一种包载他克莫司的纳米制剂及应用

1.本发明属于制药领域，涉及包载他克莫司的纳米制剂及应用，是一类包载他克莫司的具有抗氧化活性的纳米制剂，可以在高效递送药物的同时，恢复胞内氧化还原平衡，减少细胞凋亡，涉及该纳米制剂的构建方法及其在眼科疾病中的应用。


背景技术：

2.眼部疾病的出现频率很高，且种类多样，如果得不到及时治疗，通常会对患者的视力造成影响。其中，干眼症是非常常见的一种疾病，患病率在5-30％之间，在40岁以上人群中高达75％(rouen and white 2018)。干眼症可由不稳定的泪膜引起，导致蒸发量增加，泪液量减少，造成干燥、流泪、不适、异物感和眼疲劳等不适症状。如果不经过及时治疗，眼部炎症反应、泪液渗透压升高和泪膜不稳定会形成恶性循环，进一步恶化患者的病情。
3.在疾病的早期阶段，临床常用人工泪液补充的方式维持泪膜的完整性。但当疾病进入中晚期，炎症反应加剧，只能局部使用皮质类固醇和免疫抑制剂治疗。但长期使用皮质类固醇会引起较多副作用，如青光眼、白内障等并发症和继发感染等。相比之下，局部使用免疫抑制剂则具有更高的安全性。他克莫司和环孢素a是眼科中最常用的两种免疫抑制剂。虽然它们的作用机制相似，但他克莫司的效力是环孢素a的10-100倍。然而，他克莫司由于分子量大，疏水性高，眼渗透率低，直接递送很难有效发挥作用。目前，纳米递送系统已经在很多眼科疾病中发挥了重要作用，包括增加靶部位浓度、提高渗透率等。因此，使用纳米载体改善他克莫司的递送问题具有重要的意义。
4.在干眼症中，氧化应激的“恶性循环”也是非常需要重视的问题。角膜的高渗应激会激活炎症信号通路，释放炎症因子。过量的炎症因子会招募活化的免疫细胞，造成上皮细胞损伤。在这个过程中，细胞中还会累积大量ros，加剧炎症反应。因此，抑制过度的免疫反应和清除累积的ros对干眼症治疗来说都至关重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种包载他克莫司的抗氧化眼用纳米制剂，由油相和水相组成，油相：水相为1:1000-1:2,w/w。纳米制剂粒径均匀稳定，小于200nm。
6.本发明所述的纳米制剂是指药物可接受的载体，包括但不限于纳米乳、脂质体、胶束、脂质纳米粒。
7.所述油相包括卵磷脂5-80％,w/w、中链甘油三酯0-50％,w/w、脂溶性抗氧化剂0.1-50％,w/w，以及他克莫司0.01％-20％,w/w；水相选择水溶性抗氧化剂0.1-30％,w/w或者去离子水。
8.所述油相中除脂溶性抗氧化剂和他克莫司外，其他油性成分可被磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(dotap)、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(dotma)、溴化二甲基双十八烷基铵(ddab)、大豆油、橄榄油、蓖麻油、各类中长链脂肪酸酯、胆固醇、角鲨烷代替。
9.脂溶性抗氧化剂包括天然维生素e及其衍生物，如α-生育酚、维生素e醋酸酯、维生素e琥珀酸酯、维生素e烟酸酯；也可以被其他抗氧化剂代替，如褪黑素、聚多巴胺、谷胱甘肽、β-胡萝卜素、虾青素、丁基羟基茴香醚(bha)、姜黄素、n-乙酰半胱氨酸(nac)、黄酮类化合物(如槲皮素、山奈酚、儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯egcg)等。脂溶性的抗氧化剂占油相重量的0.1％-50％。
10.水溶性抗氧化剂占水相重量的0.1％-30％。水溶性抗氧化剂包括l-抗坏血酸、茶多酚、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶等。
11.本发明所述包载他克莫司的抗氧化纳米制剂可以通过以下方法构建：由卵磷脂、中链甘油三酯、脂溶性抗氧化剂、他克莫司作为油相，含有水溶性抗氧化剂的水溶液或去离子水为水相，制备水包油型(o/w)载药纳米制剂。
12.本发明的另一个目的是提供所述纳米制剂在制备他克莫司抗氧化眼用药物中的应用，所述药物为滴眼剂，制剂形式为液体制剂。所述应用是该纳米制剂通过抑制过度免疫反应的同时，清除过量ros以维持眼部细胞氧化还原平衡稳态，降低眼部炎症反应，减少细胞凋亡。所述纳米制剂在递送药物的同时以预防、阻断和修复的方式减缓或消除氧化应激对眼部的影响。
13.本发明这种纳米制剂由生物相容性高、容易获得且生产成本低的常用脂质材料作为主要成分，添加水溶性或者脂溶性抗氧化剂，在抑制过度免疫反应的同时，还具有清除过量ros以维持眼部细胞氧化还原平衡稳态，降低眼部炎症反应，减少细胞凋亡的功能，免疫抑制剂和抗氧化剂的联用使得该纳米制剂在干眼症治疗中达到“1+1＞2”治疗效果。这种纳米制剂便于生产、成本可控、质量稳定，且由于使用的脂质材料生物相容性好，安全性高，在眼用制剂中具有良好的产业化前景和广阔应用前景。本发明的创新性在于1)针对他克莫司分子量大，角膜渗透率低的问题，通过纳米制剂提高药物递送效率。2)针对干眼症中广泛存在的氧化应激损伤，清除细胞中ros累积，缓解炎症反应，保护角膜上皮细胞。
附图说明
14.图1是载药纳米乳外观。
15.图2是载药纳米乳粒径。
16.图3是载药纳米乳透射电镜图像。
17.图4是空白和载药纳米乳粒径稳定性。
18.图5是空白和载药纳米乳电位稳定性。
19.图6是游离药和载药纳米乳24h细胞毒性。
20.图7载药纳米乳在hcec细胞系中清除ros的能力。
21.图8游离药和载药纳米乳滴眼后眼表滞留情况。
22.图9载药纳米乳治疗小鼠干眼症后角膜切片。
23.图10载药纳米乳治疗后小鼠眼球氧化还原标志物及炎症因子表达。
24.图11载药纳米乳治疗后小鼠角膜炎症细胞浸润情况。
25.图12载药纳米乳生物安全性考察。
具体实施方式
26.本发明结合附图和实施实例作进一步说明。
27.实施例1纳米乳的制备及理化性质表征
28.纳米乳处方：磷脂酰乙醇胺266.7mg甘油三酯66.3mgα-生育酚0.33mg他克莫司fk506 0.05mg水1ml。
29.按照上述处方使用高能乳化法制备水包油乳剂。简单来说，将磷脂酰乙醇胺、甘油三酯、α-生育酚和fk506溶于少量乙醇中，随后在高速搅拌下，加入去离子水得到初乳。随后通过冰浴探头超声得到纳米乳。制备得到的纳米乳为流动性很好的白色乳状液(见图1)。通过动态光散射法检测该处方制备得到的纳米乳粒径在200nm以下(见图2)。纳米乳的形态通过透射电子显微镜(tem)观察，呈现均匀且表面光滑的球状结构(见图3)。该纳米乳在4℃条件下至少可以稳定储存80天，没有发现明显粒径改变(见图4)和电位改变(见图5)。
30.实施例2载药纳米乳的细胞毒性
31.纳米乳处方：蛋黄卵磷脂0.67mg橄榄油0.29mgα-生育酚0.27mgfk506 0.11mg水1ml。
32.由于眼局部用药通常需要较高的给药频次，为了确定纳米乳的局部累积不存在安全隐患，选择人角膜上皮细胞(hcec)细胞系为模型，对上述处方制备的纳米乳的安全性进行考察。设置药物浓度梯度在10-100μg/ml之间。与市售他克莫司滴眼液(塔克司)相比，本实例中制备得到的纳米乳即使在较高浓度下也对眼细胞几乎没有毒性(见图6)。证明该纳米乳有良好的生物安全性。
33.实施例3载药纳米乳体外抗氧化能力考察
34.纳米乳处方：大豆卵磷脂5mg蓖麻油15mg维生素e醋酸酯0.02mgfk506 0.2mg水1ml。
35.使用上述处方制备纳米乳。在人角膜上皮细胞(hcec)中加入h2o2体外模拟氧化应激情况，随后加入载药纳米乳共孵育30分钟，以dcfh-da作为ros指示探针，使用荧光酶标仪检测ros荧光信号强度(见图7)。与市售他克莫司滴眼液(塔克司)相比，本发明中制备的载药纳米乳能够显著减轻细胞氧化应激，体现出良好的体外抗氧化能力。
36.实施例4载药纳米乳局部给药后眼表滞留情况考察
37.纳米乳处方：蛋黄卵磷脂20mg(2，3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵dotap 13.3mg大豆油66.3mg维生素e醋酸酯166.7mg他克莫司66.7mg水1ml。
38.滴眼液的一个亟待解决的问题是清除快，通常游离药物溶液的滞留时间仅为1-5分钟。为方便将药物的滞留可视化，在按照上述处方制备纳米乳后，使用脂溶性荧光染料dir标记。在给药后30min摘除大鼠给药侧眼球，清洗后进行荧光切片考察。如图8所示，本发明制备的纳米乳比游离药有更长的眼表滞留，并且能够渗透到角膜内皮细胞侧。证明本发明中的纳米乳具有更强的角膜渗透能力。
39.实施例5抗氧化载药纳米乳在干眼症模型中的治疗作用
40.纳米乳处方：磷脂酰乙醇胺5mg磷脂酰丝氨酸1mg姜黄素10mgfk506 4mg水1ml。
41.使用0.2％苯扎溴铵长期滴眼制造小鼠干眼症模型。干眼症由于泪膜稳态被破坏，泪液蒸发加速。长期的高渗透压导致眼表炎症反应增加，免疫细胞浸润增加，进而导致脂质过氧化物(mda)、炎症因子tnf-α水平增高，细胞超氧化物歧化酶(sod)活性降低。纳米乳中的抗氧化剂能够协同他克莫司发挥作用，抑制过度的免疫反应，减少角膜细胞损伤(见图9)。与单纯使用他克莫司相比，具有抗氧化功能的纳米乳能够减少角膜氧化应激标志物(见图10)，显著减少了角膜炎症细胞浸润(见图11)。
42.实施例6抗氧化载药纳米乳生物安全性考察
43.纳米乳处方：大豆卵磷脂5mg蓖麻油4mgfk506 0.8mg水1ml(含l-抗坏血酸4mg)。
44.按照上述处方制备载药纳米乳。将制备好的纳米乳、市售他克莫司滴眼液、pbs每日一次局部滴注在大鼠单侧眼球。给药结束后观察将给药侧眼球取下，pbs清洗后进行苏木精&伊红切片观察(见图12)。无论是本发明制备的纳米乳和市售他克莫司滴眼液，在长期给药后都没有引起大鼠角膜增生。证明本发明制备的纳米乳具有良好的生物安全性。
45.实施例7具有抗氧化功能的眼用载药脂质体的制备与应用
46.脂质体处方：二油酰磷脂酰乙醇胺15mg磷脂酰肌醇5mg
胆固醇3mg虾青素3mgfk506 1mg水1ml。
47.采用薄膜分散法制备抗氧化功能的载药脂质体。简单来说，将上述处方中的脂质完全溶解于氯仿中，使用旋转蒸发仪减压蒸发去除溶剂，形成均一完整的薄膜。向获得的脂质薄膜中加入超纯水，在45℃水浴条件下进行水化。接下来，将水化后的样品进行冰浴探头超声，获得粒径均一稳定的载药脂质体。本发明制备的脂质体中，虾青素可以清除过量ros，协同他克莫司抑制眼部炎症反应，在干眼症治疗中发挥良好效果。
48.实施例8具有抗氧化功能的眼用载药胶束的制备与应用
49.胶束处方：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe-peg)100mg表儿茶素-3-加醇(egcg)2.5mgfk506 2.5mg水1ml。
50.本发明通过薄膜水化法制备dspe-peg胶束。首先将dspe-peg、egcg和fk506溶于氯仿溶液中，超声至完全溶解。随后将有机相通过旋转蒸发去除，形成均匀的含药脂质薄膜。随后加入纯水搅拌，40℃水化1h，即可得到载药胶束。egcg可以清除过量ros，减轻眼部炎症反应，保护角膜上皮细胞免受损伤，协同他克莫司抑制眼部炎症反应，在干眼症治疗中发挥良好效果。
51.实施例9具有抗氧化功能的眼用脂质纳米粒的制备
52.固体脂质纳米粒处方：单硬脂酸甘油酯15mg褪黑素5mgfk506 5mg吐温80 5-10mg水1ml。
53.使用超声分散法制备载药固体脂质纳米粒。将处方量的单硬脂酸甘油酯和fk506混合，加热到熔融后作为油相。吐温80溶解于水中作为水相。在搅拌情况下将水相缓慢注入油相中，获得初乳液。随后探头超声3min，室温冷却后固化得到粒径均一的固体脂质纳米粒。制备得到的纳米粒可以被角膜上皮细胞摄取或者通过黏附滞留在眼表。固体脂质纳米粒可以缓慢释放他克莫司抑制过度免疫反应，同时释放褪黑素清除过量ros，打破干眼症的炎症循环，发挥良好治疗效果。

技术特征：
1.一种包载他克莫司的抗氧化纳米制剂，其特征在于，所述纳米制剂由水相和油相组成，油相为卵磷脂5-80％,w/w、中链甘油三酯0-50％,w/w、脂溶性抗氧化剂0.1-50％,w/w，以及他克莫司0.01％-20％,w/w；水相为水溶性抗氧化剂0.1-30％,w/w或者去离子水。2.根据权利要求1所述的抗氧化纳米制剂，其特征在于，所述纳米制剂的油相：水相为1:1000-1:2,w/w。3.根据权利要求1所述的抗氧化纳米制剂，其特征在于，纳米制剂为药物可接受的载体，选用纳米乳、脂质体、胶束或脂质纳米粒。4.根据权利要求1所述的抗氧化纳米制剂，其特征在于，所得纳米制剂粒径小于200nm。5.根据权利要求1所述的抗氧化纳米制剂，其特征在于，脂溶性抗氧化剂选用褪黑素、聚多巴胺、谷胱甘肽、β-胡萝卜素、虾青素、丁基羟基茴香醚、姜黄素、n-乙酰半胱氨酸、槲皮素、山奈酚、儿茶素或表没食子儿茶素没食子酸酯；水溶性抗氧化剂选用茶多酚、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶或谷胱甘肽还原酶。6.根据权利要求1所述的抗氧化纳米制剂，其特征在于，纳米制剂的油相中除脂溶性抗氧化剂和他克莫司外，其他油性成分用磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、大豆油、橄榄油、蓖麻油、各类中长链脂肪酸酯、胆固醇或角鲨烷代替。7.权利要求1所述的所述抗氧化纳米制剂在制备他克莫司抗氧化眼用药物中的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为液体制剂。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是纳米制剂通过抑制过度免疫反应的同时，清除过量ros以维持眼部细胞氧化还原平衡稳态，降低眼部炎症反应，减少细胞凋亡，以阻断和修复的方式减缓或消除氧化应激对眼部的影响。

技术总结
本发明提供一种包载他克莫司的纳米制剂及应用，所述制剂由油相和水相组成。油相为卵磷脂、中链甘油三酯、脂溶性抗氧化剂、他克莫司，水相为水溶性抗氧化剂或去离子水。本发明所述的纳米制剂针对他克莫司分子量大，角膜渗透率低的问题，通过纳米制剂提高局部药物浓度和递送效率，同时针对干眼症中广泛存在的氧化应激损伤，清除细胞中ROS累积，缓解炎症反应，保护角膜上皮细胞。本发明的纳米制剂可在抑制免疫反应的同时减轻眼部氧化应激，减少细胞损伤，以达到更加高效的治疗效果，具有易于生产制备、协同增效等特点，可制备他克莫司抗氧化眼用药物。本发明生物相容性好，安全性高，在眼用制剂中具有良好的产业化前景和广阔应用前景。景。


技术研发人员：游剑 郭雪萌 石美幸
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/9/6