一种具有抗肝癌活性的药物组合物的制作方法

1.本发明属于抗肿瘤的药物领域，是一种具有抗肝癌活性的药物组合物，具体的，本发明涉及索拉非尼与灵芝提取物组合物在治疗肝癌中的应用。


背景技术：

2.癌症是目前危害人类生命健康的罪魁祸首之一，其中肝癌发病率位居恶性肿瘤第4位，死亡率高居第3位，已成为严重威胁人们健康和生命的主要癌症之一。肝癌是最常见的原发性肝癌(占90％)，可由慢性乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)感染、酒精滥用、糖尿病和肥胖相关的代谢综合征引起。目前临床上，早期诊断、手术切除、肝移植、消融、分子靶向治疗及放化疗是肝癌常用的治疗方式。但由于受限于较低的早期筛查率和易转移，仅有少数病人能从中获益。而化疗药物治疗效果的有限性以及治疗过程中常伴严重的副作用，寻求更为安全有效的药物或治疗手段应用于肝癌治疗尤显迫切和重要。
3.索拉非尼(sorafenib,sf)是一种口服的小分子多靶点激酶抑制剂，可抑制受体酪氨酸激酶，阻断raf/mek/erk重要的肝癌细胞生殖增长通路之一，从而起到抑制肝癌细胞生长，诱导肝癌细胞凋亡。另外，索拉非尼还可通过调节vegfr/stat3/vegf信号通路，抑制肿瘤血管生成影响肿瘤细胞存活率。它作为第一个被美国fda批准用于肝癌一线治疗的多靶点药物，可同时作用于肿瘤细胞和肿瘤血管，具有双重的抗肿瘤作用，并已在临床治疗上取得良好疗效。然而，由于肝癌病理进程的复杂性，单药sf的治疗方法很难得到理想的治疗效果，并且存在严重的副作用、易导致肿瘤复发转移耐药等问题，严重影响患者的治疗效果。目前，已有研究者探究了多种药物联用增敏剂，以增强肝癌细胞对sf敏感性。中国专利cn202011199694.8《大黄素联合索拉非尼的纳米制剂对hepg2增殖的抑制验证方法》，其公开了大黄素这种中药活性成分与索拉非尼联合制备的纳米粒对hepg2肝癌细胞杀伤效果优于大黄素组和索拉非尼组。此外，cn201611112946.2也公开了一种将sf与辣椒素联合应用于肝癌治疗的联合用药物，该药物组合物能够明显抑制肝癌细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，且两者的联合应用表现出了良好的协同作用。由此可见，药物联用以协同杀伤肝癌细胞是一种有效的肝癌治疗策略。
4.如中国专利cn202210153892.3《一种治疗癌症的中药组合物及其制备方法》中公开了灵芝提取物与红豆杉等中药组合物在对不同癌症患者临床治疗过程中有明显抗癌效果，并且可以改善患者症状；中国专利cn202010234680.9提到灵芝提取物可减轻紫杉醇、顺铂等化疗药物引发的胃肠道副作用。然而，迄今为止尚未见索拉非尼与灵芝提取物联用这方面的文献报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是提供一种具有协同抗肿瘤的药物组合物，通过将具有增强免疫力保肝护肝的天然无毒的中药灵芝提取物与临床一线抗肝癌药物索拉非尼进行联合用药，增强索拉非尼治疗肝癌杀伤效果和减轻其对肝细胞毒性。
6.本发明所采用的技术方案为一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其要点在于，它包含有灵芝提取物和索拉非尼，其中所包含灵芝提取物质量浓度为56.25-900(μg/ml)，索拉非尼质量浓度为1-16(μg/ml)。
7.灵芝，作为中国几千年历史上名贵中草药，历代医学家都认为具有养心安神,养肺益气,理气化瘀、滋肝健脾，保肝护肝功效。灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的淡雾状微小种子,集中起来呈粉末状,其承载了灵芝全部的营养物质。灵芝子实体、灵芝孢子粉主要功效成分是灵芝三萜和灵芝多糖，通称灵芝总提取物(ganoderma lucidum extract，gle)，简称gle。灵芝的抗肿瘤作用机制涉及到对机体的免调节作用、影响肿瘤细胞凋亡、增殖、侵袭和转移，增强化疗药的敏感性，从而起到辅助抗肿瘤作用。与此同时，灵芝具有较好的脏器保护功效。目前传统医药越来越引发人们重视，而从中草药中寻找毒性低、疗效高的抗肿瘤活性成分成为当今抗肿瘤药物发展战略中的关键之一，灵芝提取物因其具有抗癌、免疫等药理活性成分，可有望成为抗肿瘤药物组合物候选物。
8.联合用药(drug combination)是指为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上药物同时或先后应用。联合用药治疗可以通过机制的互补、作用的协同，减少单一用药治疗导致的肿瘤耐药性的发生，还可以在增强疗效的同时降低毒副作用。对于某些药物组合，联合治疗还允许产生最佳组合剂量来使副作用最小化；两种化合物的联合治疗可揭示未预料到的协同作用和引发非由单一化合物诱导的效应。本发明构建了索拉非尼(sf)和灵芝提取物(gle)抗肿瘤药物组合物，以肝癌细胞hepg2与smmc-7721和肝正常细胞l02作为研究对象，考察该组合物体外对肝癌细胞的增殖抑制能力及对肝正常细胞的毒性作用。
9.申请人在众多的组合中选择以下几组配方组合：
10.灵芝提取物的质量浓度为56.25μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
11.灵芝提取物的质量浓度为112.5μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
12.灵芝提取物的质量浓度为225μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
13.灵芝提取物的质量浓度为450μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
14.灵芝提取物的质量浓度为900μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
15.所包含灵芝提取物质量浓度为110-115(μg/ml)，索拉非尼质量浓度为3-5(μg/ml)。
16.所包含灵芝提取物质量浓度为112.5(μg/ml)，索拉非尼质量浓度为4(μg/ml)。
17.可将上述产品制成药物制剂：所述的药物组合物为由灵芝提取物和索拉非尼制成的药物制剂。
18.所述的药物制剂是在灵芝提取物和索拉非尼药物组合物中加入医学上许可的辅料制成的口服制剂。
19.所述的口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂或滴剂。
20.本发明的优点在于：
21.(1)本发明开创了索拉非尼与灵芝提取物联用的先河，本发明所提供的协同抗肝癌药物组合物使用的药物是临床一线抗肝癌药物索拉非尼和中药灵芝提取物，两者联合使用对肝癌细胞具有显著的增殖抑制作用，gle可有效提高sf的敏感性，增强肝癌杀伤效果。
22.(2)本发明所提供的gle可减轻单用sf造成的肝损伤，对正常肝细胞低毒。
附图说明
23.图1.低、中、高浓度的灵芝提取物单独使用对肝癌细胞hepg2 24h、48h、72h存活率的影响。
24.图2.低、中、高浓度的索拉非尼单独使用对肝癌细胞hepg2 24h、48h、72h存活率的影响。
25.图3.低、中、高浓度的灵芝提取物和索拉非尼联合使用对肝癌细胞hepg2 48h存活率的影响。
26.图4.低、中、高浓度的灵芝提取物和索拉非尼联合使用对肝癌细胞hepg2协同指数ci。
27.图5.低、中、高浓度的灵芝提取物单独使用对肝癌细胞smcc-7721 24h、48h、72h存活率的影响。
28.图6.低、中、高浓度的索拉非尼单独使用对肝癌细胞smcc-7721 24h、48h、72h存活率的影响。
29.图7.低、中、高浓度的灵芝提取物和索拉非尼联合使用对肝癌细胞smcc-7721 48h存活率的影响。
30.图8.低、中、高浓度的灵芝提取物和索拉非尼联合使用对肝癌细胞smcc-7721协同指数ci。
31.图9.灵芝提取物和低、中、高浓度索拉非尼单独使用及联合使用对肝正常细胞l02 48h存活率的影响。
32.图10.灵芝提取物和索拉非尼单独使用及联合使用对hepg2和smmc-7721肝癌细胞48h处理后的细胞形态变化。
具体实施方式
33.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
34.一种具有抗肝癌活性的药物组合物，它包含有灵芝提取物和索拉非尼，其中所包含灵芝提取物质量浓度为56.25-900(μg/ml)，索拉非尼质量浓度为1-16(μg/ml)。
35.申请人在众多的组合中选择以下几组配方组合：
36.灵芝提取物的质量浓度为56.25μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
37.灵芝提取物的质量浓度为112.5μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
38.灵芝提取物的质量浓度为225μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
39.灵芝提取物的质量浓度为450μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
40.灵芝提取物的质量浓度为900μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml中的任意一种。
41.所包含灵芝提取物质量浓度为110-115(μg/ml)，索拉非尼质量浓度为3-5(μg/ml)。
42.所包含灵芝提取物质量浓度为112.5(μg/ml)，索拉非尼质量浓度为4(μg/ml)。通过mtt实验结果表明在该浓度下药物联用后对hepg2和smmc-7721的杀伤效果显著且优于单药组，并且在该浓度下的联合用药可减轻sf对l02细胞的毒性，实验结果表明该浓度下联合给药具有增效减毒作用。
43.可将上述产品制成药物制剂：所述的药物组合物为由灵芝提取物和索拉非尼制成的药物制剂。
44.所述的药物制剂是在灵芝提取物和索拉非尼药物组合物中加入医学上许可的辅料制成的口服制剂。
45.所述的口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂或滴剂。
46.通过试验对产品的效果进行检测。
47.检测例1
48.本检测例是提供灵芝提取物和索拉非尼单独使用及联合使用24、48、72h对hepg2细胞的增殖抑制作用：采用标准mtt比色法测定了灵芝提取物和索拉非尼不同联合比例对hepg2肝癌细胞株的增殖抑制活性。
49.取对数期的hepg2细胞，用胰酶消化后，细胞计数，将制得的细胞悬液，每孔100μl接种到96孔板(每个孔约1
×
105个细胞)，放于37℃、5％ co2培养箱中培养24h，将灵芝提取物按照低、中、高浓度分为56.25μg/ml、112.5μg/ml(低)和225μg/ml、450μg/ml(中)和900μg/ml(高)5组；将索拉非尼按照低、中、高浓度分为1μg/ml、2μg/ml(低)和4μg/ml、8μg/ml(中)和16μg/ml(高)5组；联合用药组按照浓度分为低浓度gle(56.25μg/ml、112.5μg/ml)分别与低、中、高浓度sf组合；中浓度gle(225μg/ml、450μg/ml)分别与低、中、高浓度sf组合；高浓度gle(900μg/ml)分别与低、中、高浓度sf组合。弃掉旧的培养基，加入配制好的含不同药物浓度的培养基继续培养24h、48h和72h，吸弃含药培养基，于每孔中加入100μl稀释好的mtt溶液(0.5mg/ml mtt的母液：无血清无酚红培养基＝1:9)，继续孵育4h后，终止培养；小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入100μl dsmo，振荡10min，于490nm/570nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(od值)，计算细胞成活率(％)＝(用药组平均od值/空白对照组平均od值)
×
100％。用graphpad prism软件进行数据处理。
50.实验结果如图1-3所示，灵芝提取物和索拉非尼单独使用及联合使用24、48、72h对hepg2细胞的增殖抑制作用检测，结果表明如图1所示，当低、中、高不同浓度的gle对hepg2细胞作用24h后，增殖抑制效果不明显。当灵芝提取物达到最高浓度900μg/ml对hepg2肝癌细胞杀伤效果才为46％，当给药48、72h对hepg2细胞有明显的抑制增殖作用,而给药24h无法充分发挥药效，说明药物发挥药效需要一定的时间，并其这种增殖抑制作用具有时间、剂量依赖性；图2所示不同浓度sf单药组对hepg2细胞作用24、48、72h增殖抑制效果，同图1单药组gle一样，低浓度sf无明显增殖抑制作用，给药24h时间增殖抑制效果不佳，同时也呈现
出时间、浓度依赖性。综上后续实验包括联合用药考虑用48h。图3所示的是低、中、高浓度的gle和sf两两组合的联合用药方案，柱状图的高低表示细胞的存活率，结果表明与单药组sf比较下，联合用药组在同等剂量sf与不同浓度gle联用，其对hepg2细胞杀伤效果全都优于单药组，且呈现浓度依赖性。
51.采用compusyn软件计算gle和sf两者联合给药在不同配比下作用48h对hepg2细胞的协同指数(combination index,ci)，筛选出最佳的药物配比。compusyn软件是通过利用质量作用定律的中值效应原理及其组合指数促进药效学研究和简单计算化分析模拟。ci指数可以用来评价药物联合效果。一般来说ci小于1，药物具有联合效应；ci等于1，药物具有相加作用；ci大于1，药物具有拮抗作用。
52.结果如图4所示，gle+sf有多组不同浓度组合具有协同效应。
53.检测例2
54.本检测例提供了灵芝提取物和索拉非尼单独使用及联合使用24、48、72h对smmc-7721细胞的增殖抑制作用：采用标准mtt比色法测定了灵芝提取物和索拉非尼不同联合比例对smmc-7721肝癌细胞株的增殖抑制活性，步骤同检测例1，实验结果如图5-7所示，灵芝提取物和索拉非尼单独使用及联合使用24、48、72h对smmc-7721细胞的增殖抑制作用检测，结果表明如图5-7所示:图5-6所示gle和sf单药给药24h无法充分发挥药效，特别是低浓度没有明显的抑制作用,给药48、72h对smmc-7721细胞有明显的抑制增殖作用,该作用具有时间、剂量依赖性。图7柱状图的高低表示细胞的存活率，试验结果表明根据不同浓度单药gle和sf两两组合，与单药组sf比较下，联合组在同等剂量sf下与不同浓度gle联用，其对smmc-7721细胞杀伤效果全都优于单药组，且呈现浓度依赖性。
55.采用compusyn软件计算gle和sf两者联合给药在不同配比下作用24、48、72h对smmc-7721细胞的协同作用，筛选出最佳的药物配比。方法同实施例2，结果如图8所示和表1、2和3所示。
56.表1药物联合用药研究协同拮抗表
[0057][0058][0059]
表2不同浓度的gle+sf作用于hepg2细胞的ci指数
[0060]
[0061][0062]
表3不同浓度的gle+sf作用于smmc-7721细胞的ci指数
[0063]
[0064][0065]
根据ci指数＜1，药物联用才有协同作用。因此根据图8所示在这二十五种组合中，
gle+sf有低中高不同浓度组合具有协同效应。hepg2细胞具有中等协同效果(ms)的联用组合主要是：gle+sf为(56.25+4)、(56.25+16)、(112.5+4)、(900+1)、(900+2)、(900+4)μg/ml。smmc-7721细胞具有中等协同效果(ms)的联用组合主要是：gle+sf为(56.25+4)、(112.5+4)、(900+4)μg/ml。
[0066]
检测例3
[0067]
取对数期的l02细胞，用胰酶消化后，细胞计数，将制得的细胞悬液，每孔100μl接种到96孔板(每个孔约1
×
105个细胞)，放于37℃、5％ co2培养箱中培养24h，将上述有协同效应的药物组合。单药组分为不同浓度的索拉非尼；联合组分为不同浓度的灵芝提取物与不同浓度的索拉非尼联用。弃掉旧的培养基，加入配制好的含不同药物浓度的培养基继续培养48h，吸弃含药培养基，于每孔中加入100μl稀释好的mtt溶液(0.5mg/ml mtt的母液：无血清无酚红培养基＝1:9)，继续孵育4h后，终止培养；小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入100μl dsmo，振荡10min，于490nm/570nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(od值)，计算细胞成活率(％)＝(用药组平均od值/空白对照组平均od值)
×
100％。用graphpad prism软件进行数据处理。
[0068]
结果如图9所示，柱状图的高低表示细胞的存活率，试验结果表明，与同等剂量单药组sf比，当联用时gle浓度剂量达到900μg/ml,对l02细胞杀伤太大，不具有减毒作用，可能是gle剂量太大。但是当gle浓度为56.25μg/ml和112.5μg/ml时，与sf在不同浓度下(1-16μg/ml)联用都具有减毒作用，并且低剂量gle与低剂量的sf联用可明显减轻肝损伤。
[0069]
所以，综合考虑对肝癌hepg2细胞杀伤效果，ci协同指数和对l02减毒作用，选用最佳联用浓度gle:sf＝112.5:4(μg/ml)。
[0070]
检测例4
[0071]
取对数生长期的hepg2和smmc-7721细胞消化接种在6孔板(500个/孔)中，37℃，5％co2无菌孵箱孵育，待细胞贴壁后加入不同组别包含对照组药物并培养48h，倒置显微镜观察药物处理后细胞形态。
[0072]
结果如图10所示，观察发现联合用药组对不同肝癌细胞增殖抑制作用显著优于单药组。对照组细胞形态完整，贴壁生长，细胞大小一致排列密集，边界清晰；灵芝用药组有少量细胞漂浮在培养液中，变圆；索拉非尼组多数细胞间隙变大，疏松排列细胞数量减少，变圆，悬浮于培养液中，在联用组中，细胞数量明显减少，变圆变亮，大多数呈细胞碎片状，说明联用组可显著抑制肝癌生长。
[0073]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，它包含有灵芝提取物和索拉非尼，其中所包含灵芝提取物质量浓度为56.25-900 (μg/ml) ，索拉非尼质量浓度为1-16（μg/ml）。2.根据权利要求1所述的一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，灵芝提取物的质量浓度为56.25 μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml中的任意一种。3.根据权利要求1所述的一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，灵芝提取物的质量浓度为112.5 μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml中的任意一种。4.根据权利要求1所述的一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，灵芝提取物的质量浓度为225 μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml中的任意一种。5.根据权利要求1所述的一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，灵芝提取物的质量浓度为450 μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml中的任意一种。6.根据权利要求1所述的一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，灵芝提取物的质量浓度为900 μg/ml，索拉非尼的质量浓度为1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml中的任意一种。7.根据权利要求1所述的一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，所包含灵芝提取物质量浓度为110-115 (μg/ml) ，索拉非尼质量浓度为3-5（μg/ml）。8.根据权利要求7所述的一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，所包含灵芝提取物质量浓度为112.5 (μg/ml) ，索拉非尼质量浓度为4（μg/ml）。9.根据权利要求1至8任一所述的一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为由灵芝提取物和索拉非尼制成的药物制剂。10.根据权利要求9所述的一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其特征在于，所述的药物制剂是在灵芝提取物和索拉非尼药物组合物中加入医学上许可的辅料制成的口服制剂。

技术总结
本发明提供一种具有抗肝癌活性的药物组合物，其要点在于，它包含有灵芝提取物和索拉非尼，其中所包含灵芝提取物质量浓度为56.25-900(μg/mL)，索拉非尼质量浓度为1-16（μg/mL）。其中索拉非尼与灵芝提取物最佳联用质量浓度比为4:112.5。本发明开创了索拉非尼与灵芝提取物联用的先河，该组合物对肝癌细胞有明显的细胞杀伤能力，GLE可有效提高SF的敏感性，起到联合增效作用；对正常肝细胞有减毒作用，可减轻单用索拉非尼造成的肝损伤，起到保肝护肝作用。总之，本发明提供的一种抗肝癌组合物在抗肝癌方面具有广大的应用前景。在抗肝癌方面具有广大的应用前景。在抗肝癌方面具有广大的应用前景。


技术研发人员：邵敬伟 沈姜雯 张文钟 黎武林 李晔 吴长辉
受保护的技术使用者：仙芝科技（福建）股份有限公司
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/6