一种外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的鉴定方法和引物对及应用

1.本发明属于生物技术领域，尤其是一种“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的鉴定方法和引物对及应用。


背景技术：

2.受猪周期、非洲猪瘟及其它疫病的影响，当生猪存栏有大幅度变化，尤其在能繁母猪的数量下降，生猪存栏减少时，将导致猪价暴涨。由于利益的驱使，一些养殖企业以二元猪(大白猪和长白猪杂交后代)充当“外三元”(大白猪、长白猪、杜洛克猪)纯种猪，二元回交猪(大白猪和长白猪杂交后代再与大白猪或者长白猪杂交)充当外三元纯种猪，三元猪充当二元猪售卖。有的养殖场(户)，利用自繁的三元猪留种，进行后续养殖生产。这些猪都不同程度的存在发情不明显、屡配不孕，产仔数低的特点，导致我国猪群生产成绩降低，种质退化。所以“外三元”猪的种质鉴定技术，具有非常大的市场需求和应用空间。
3.目前种质鉴定的方式包括传统表观鉴定和分子鉴定。传统表观鉴定主要靠经验，是通过对毛色、体型及耳型进行表观的区分。但是由于养殖场(户)的技术人员或者农民并不能系统掌握“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的所有特征，导致传统鉴定方式无法准确判断猪种。也正是因为这样，很多不良商家通过以次充好的方式售卖种猪。种猪的分子鉴定方面，“外三元”猪种质的分子鉴定方法报道较少，非常标志性的突变位点并没有系统报道。目前报道的猪品种鉴定的基因大都是外种猪和国内猪种区别的鉴定。于辉等人采用pcr-rflp分型方法，探讨3个引进种猪sla-dqa基因外显子2的群体遗传结构，比较分析三品种猪的群体遗传指标，他们在ecorⅰ位点上大白猪仅有bb型和ab型，在aluⅰ位点上长白猪仅有nn型，杜洛克猪基因型频率mn高于mm和nn(于辉,李建东,赵海全等.三品种外种猪sla-dqa基因的pcr-rflp分析[j].中国畜牧杂志,2010,46(09):14-17.)。岳阳等人对太湖流域7个品种和西方5个品种猪种进行简化基因组测序，筛选出了5个小梅山猪与其他品种猪不同的snp位点，同时采用sanger测序进行验证，进而建立了小梅山猪及其制品的snp分子标记鉴定方法，该方法可用于小梅山猪与太湖流域其他6个品种及常见西方品种猪的鉴定区分(岳阳.基于单核苷酸多态性标记鉴别太湖流域地方品种猪及其制品的方法研究[d].上海交通大学,2019.doi:10.27307/d.cnki.gsj tu.2019.003893.)。目前商业化的全基因组芯片测序，比对获得猪源信息的方法较为常见。且鉴定是否具有杜洛克猪血缘，或者通过黑斑基因鉴定来推断的“外三元”纯种猪的方法较多。能用来鉴别大白猪、长白猪、杜洛克猪、二元、三元及多元回交猪的基因型非常少，也没有系统有效的方案。


技术实现要素：

[0004]
本发明目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的鉴定方法和引物对及应用。
[0005]
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
[0006]
一种用于“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪种质鉴定的引物对，所述引物对包括扩增含有ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点中的一种或两种以上的引物对，其中扩增含有ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点的pcr所有引物对，包括但不限于seq id no.1-6所示：
[0007]
其中，扩增含有ssc6:110653413t》c位点的引物对中的上游引物为seq id no.1(5'aatctccgactctgg 3')，下游引物为seq id no.2(5'gagctgcaaatgtgag 3')；
[0008]
扩增含有ssc11:47494227t》g位点的引物对中的上游引物为seq id no.3(5'gggtgggaaggaagtct 3')，下游引物为seq id no.4(5'aagccagacggtgaagat 3')；
[0009]
扩增含有ssc13:57293969a》g位点的引物对中的上游引物为seq id no.5(5'ttacggagtagaagcaa 3')，下游引物为seq id no.6(5'gatggcaggaaagaaa 3')。所述ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点均为sus scorfa 11.1版的基因组位置和具体突变。
[0010]
包括如上所述的引物对的“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的种质鉴定试剂盒。
[0011]
一种利用如上所述的引物对的单snp位点鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述方法利用所述的引物对，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序，获得测序分型结果；通过测序分型结果获得每头猪的ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点的突变类型；这三个位点的突变类型即能够用于鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪。
[0012]
这些位点的特征及鉴定原则为：
[0013]
通过ssc6:110653413t》c单位点的snp分型结果分析：tt型是长白猪纯种或大白猪纯种、二元猪、多元回交长白猪或大白猪；tc型是三元猪、三元及以上多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；cc型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪(图1)。
[0014]
通过ssc11:47494227t》g单位点的snp分型结果分析：tt型是大白猪纯种或杜洛克猪纯种、三元猪、多元回交大白猪、三元及以上多元回交杜洛克猪；tg型是二元猪、三元猪、多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；gg型是长白猪纯种、多元回交长白猪(图2)。
[0015]
通过ssc13:57293969a》g单位点的snp分型结果分析：aa型是大白猪纯种或杜洛克猪纯种、三元猪、多元回交大白猪、三元及以上多元回交杜洛克猪；ag型是二元猪、三元猪、多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；gg型是长白猪纯种、多元回交长白猪(图3)。
[0016]
一种利用如上所述的引物对的双snp位点联合鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述双snp位点为ssc6:110653413t》c位点和ssc11:47494227t》g位点，所述引物对为seq id no.1-4，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果。ssc6:110653413t》c位点和ssc11:47494227t》g双位点联合分析特征及选育原则为(附图1，2)tttt型是大白猪纯种、多元回交大白猪；tttg型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；ttgg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；cctt型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；cctg型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tctt型是三元猪、三元及以上多元回交大白猪或杜洛克猪；tctg型是三元猪、三元及以上多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；tcgg型是三元及以上多元回交长白
猪。
[0017]
一种利用如上所述的引物对的双snp位点联合鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述双snp位点为ssc6:110653413t》c位点和ssc13:57293969a》g位点，所引物对为seq id no.1-2、seq id no.5-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果。ssc6:110653413t》c位点和ssc13:57293969a》g位点双位点联合分析特征及选育原则为(附图1，3)：ttaa型是大白猪纯种、多元回交大白猪；ttag型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；ttgg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；ccaa型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；ccag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tcaa型是三元猪、三元及以上多元回交大白猪或杜洛克猪；tcag型是三元猪、三元及以上多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；tcgg型是三元及以上多元回交长白猪。
[0018]
一种利用如上所述的引物对的双snp位点联合鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述双snp位点为ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点，所述引物对为seq id no.3-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果。ssc11:47494227t》g和ssc13:57293969a》g双位点联合分析特征及选育原则为(图2，3)：ttaa型是大白猪纯种、杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；ttag型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；ggag型是多元回交长白猪；gggg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；tgaa型是三元猪，三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；tgag型是二元猪、三元猪、多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；tggg型是多元回交长白猪。
[0019]
一种利用如上所述的引物对的三snp位点联合鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述三snp位点为ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点，所述引物对为seq id no.1-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果。ssc6:110653413t》c、ssc11:47494227t》g和ssc13:57293969a》g三位点联合分析特征及选育原则为(图1，2，3)：ttttaa型是大白纯种猪、多元回交大白猪；ttttag型是多元回交大白猪；tttgaa型是多元回交大白猪；tttgag型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；tttggg型是多元回交长白猪；ttggag型是多元回交长白猪；ttgggg型是长白纯种猪、多元回交长白猪；ccttaa型是杜洛克纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；ccttag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；cctgaa型是三元及以上多元回交杜洛克猪；cctgag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tcttaa型是三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tcttag型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tctgaa型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tctgag型是三元猪、三元及以上多元回交猪(如杜洛克猪、长白猪或大白猪)；tctggg型是三元及以上多元回交长白猪；tcggag型是三元及以上多元回交长白猪；tcgggg型是三元及以上多元回交长白猪。
[0020]
如上所述的引物对在猪种质鉴定中的应用。
[0021]
本发明取得的有益效果为：
[0022]
1、本发明是通过分析比较大群全基因组芯片数据，挑选杜洛克猪、长白猪和大白猪特有的突变位点，利用多品系的“外三元”纯种猪、二元猪和三元猪等进行验证。最终获得“外三元”猪种鉴定的有效突变位点并制定鉴定方案。为我国“外三元”猪的种质净化提供技术支持，促进养猪生产持续稳定发展。
[0023]
2、本发明主要解决了“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的种质鉴定问题。重点考察了ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点的单snp位点、双snp位点联合和三snp位点联合对“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪种质鉴定的方法、效果及应用。本发明是利用猪常染色体的三个猪种特异性的突变位点联合分析，鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法和引物对，是一种分子育种技术、引物对及结果的应用。
[0024]
3、本发明公开了一种通过snp分型技术确定的ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点三突变位点联合分析鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法和引物对。本发明同时也公开了ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点扩增的引物及利用该引物进行检测、分析和鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法。此引物、方法和方案利用分子生物学基因检测技术在6、11、13号常染色体找出突变位点以鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪，解决市场上猪的种质混乱等问题。该方法准确度高，操作简单，在猪的种质鉴定方面具有很高的实践应用价值。
附图说明
[0025]
图1为本发明中ssc6:110653413t》c位点分别在长白猪、大白猪、杜洛克猪、二元猪和三元猪种上的碱基突变测序结果图；
[0026]
图2为本发明中ssc11:47494227t》g位点分别在长白猪、大白猪、杜洛克猪、二元猪和三元猪种上的碱基突变测序结果图；
[0027]
图3为本发明中ssc13:57293969a》g位点分别在长白猪、大白猪、杜洛克猪、二元猪和三元猪种上的碱基突变测序结果图；
[0028]
图4为本发明中ssc6:110653413t》c位点扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m为marker2000；1-9泳道依次为二元猪、三元猪、法系长白纯种母猪、美系大白纯种母猪、丹系杜洛克纯种公猪、加系大白纯种公猪、丹系大白纯种公猪、加系长白纯种公猪、丹系长白纯种公猪在110653413位点的扩增产物；
[0029]
图5为本发明中ssc11:47494227t》g位点扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m为marker2000；1-9泳道依次为二元猪、三元猪、法系长白纯种母猪、美系大白纯种母猪、丹系杜洛克纯种公猪、加系大白纯种公猪、丹系大白纯种公猪、加系长白纯种公猪、丹系长白纯种公猪在47494227位点的扩增产物；
[0030]
图6为本发明中ssc13:57293969a》g位点扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m为marker2000；1-9泳道依次为二元猪、三元猪、法系长白纯种母猪、美系大白纯种母猪、丹系杜洛克纯种公猪、加系大白纯种公猪、丹系大白纯种公猪、加系长白纯种公猪、丹系长白纯种公猪在57293969位点的扩增产物；
[0031]
图7为本发明中二元猪、三元猪、法系长白纯种母猪、美系大白纯种母猪、丹系杜洛克纯种公猪、加系大白纯种公猪、丹系大白纯种公猪、加系长白纯种公猪、丹系长白纯种公猪在ssc6:110653413t》c位点的测序峰图；
[0032]
图8为本发明中二元猪、三元猪、法系长白纯种母猪、美系大白纯种母猪、丹系杜洛克纯种公猪、加系大白纯种公猪、丹系大白纯种公猪、加系长白纯种公猪、丹系长白纯种公猪在ssc11:47494227t》g位点的测序峰图；
[0033]
图9为本发明中二元猪、三元猪、法系长白纯种母猪、美系大白纯种母猪、丹系杜洛克纯种公猪、加系大白纯种公猪、丹系大白纯种公猪、加系长白纯种公猪、丹系长白纯种公猪在ssc13:57293969a》g位点的测序峰图。
具体实施方式
[0034]
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
[0035]
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
[0036]
本发明公开了一种用于鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的扩增含有ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点出现的突变和pcr引物对；其中扩增含有ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点的引物对，见seq id no.1-6所示；
[0037][0038]
ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点均为sus scorfa11.1版的基因组位置和具体突变。
[0039]
本发明进一步公开了鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的试剂盒，它包含上述突变位点和相关引物对。
[0040]
本发明更进一步公开了一种单snp位点鉴定方法，其此方法是利用上述的引物对，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序序列见seq id no.7-9获得测序分型结果；通过测序序列获得测序分型结果可知每头猪的ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点的突变类型；这三个位点的突变类型即可用于鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪，这些位点的特征及鉴定原则：
[0041]
通过ssc6:110653413t》c单位点的snp分型结果分析；tt型是长白猪纯种或大白猪纯种、二元猪、多元回交长白猪或大白猪；tc型是三元猪、三元及以上多元回交猪(长白猪、大白猪或杜洛克猪)；cc型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪。通过ssc11:47494227t》g单位点的snp分型结果分析：tt型是大白猪纯种或杜洛克猪纯种、三元猪、多元回交大白猪、三元及以上多元回交杜洛克猪；tg型是二元猪、三元猪、多元回交猪(长白猪、大白猪或杜洛克猪)；gg型是长白猪纯种、多元回交长白猪。通过ssc13:57293969a》g单位点的snp分型结果分析：aa型是大白猪纯种或杜洛克猪纯种、三元猪、多元回交大白猪、三元及以上多元回交杜洛克猪；ag型是二元猪、三元猪、多元回交猪(长白猪、大白猪或杜洛克猪)；gg型是长白猪纯种、多元回交长白猪。
[0042]
丹系杜洛克纯种公猪在ssc6:110653413t》c位点的测序序列seq id no.7：
[0043]
cgatccaaaatctgctagtgatgtggaagtttcctgtccttgggcaaccttgctttcaggtctgat
[0044]
gagattcactccaaagcagtaaagccattctacctcttactttctttcattcattcattcaaaaca
[0045]
tatttactcagagtttattagctaaagcagatgttgagtggcagcaagaaaatggttcctacctt
[0046]
caggatgcttagtcttctagatgagagaataaatgactagccacacagatcctagcagtaatctc
[0047]
cagatttttctattagaatacatccaaaaacactatttacagtcacctgctcctaccttgattcta
[0048]
atttcacttctcttgacttcagtagtagaataaaagtacttagaacaaaaataatttttatattaa
[0049]
ttacatggtaaaatggtaatattttggatatattcagtgaaattaaatatattattaacataaatt
[0050]
tcatttgtcttttttatattttaatgttgttttcaaaatttaatgtatggctcacattttgcagctc
[0051]a[0052]
丹系杜洛克纯种公猪在ssc11:47494227t》g位点的测序序列seq id no.8：
[0053]
gacttcgcgcttaacccacgctgggagttgtctcctccacccctcagctgggcgagatactgagg
[0054]
ttgctggttagctgggggaagggctcaggatgacctggatcaaagggtcagagggacaaggctg
[0055]
cctggtgcaccttgtctaaccctgaacaagactcggaagcgaagccccaccttctccggtgttcc
[0056]
agatttctgcggggctgaaggacagcgccgggtttgccaaagtagtaggagctgcgcggcctcc
[0057]
cctgagagtgtccctccgcagaagggcccatttccagacgccagaatagtctgatcttcaccgtc
[0058]
tggcttt
[0059]
丹系杜洛克纯种公猪在ssc13:57293969a》g位点的测序序列seq id no.9：
[0060]
ggggagtggcggtgacacatgagaagtccagctttggggtagtttccttgtcttgagtttttctc
[0061]
agggaagtgtatagtcttcagttaagtggctgtgatgctgtgagccacatgcagaaaggaatgt
[0062]
ataaacttgacttatcaaaaggccaaaaatgaacatgtttccttttggagctgacccctaccccc
[0063]
aacgcccaccatccctctcctcaaatccatgccttctgtggaagcacacttctagtttctgtctac
[0064]
tcacgttgactttctaactgacttcttgattttgcatcacaaaaagccccgagattacctggcaag
[0065]
aactaaatttccctcaggtgtgaaggaagggagaaaagtaagaggttaatcaactgatggtaga
[0066]
catttaacagctccgaagataggctggaagtccaggtccacattcatttccctacagcttatgtg
[0067]
gttcaggaaatgaagatgtaccagagataggaacaaaccaggagaaggagttgttgagaatga
[0068]
aaggaataaaaaggaaaagtaaatagcttttctttcctgccatca
[0069]
本发明同时也公开了两位点联合的鉴定方法，其此方法是利用上述的引物对，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行普通测序；测序序列见seq id no.7-9获得测序分型结果。通过测序序列获得测序分型结果可知每头猪的ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点的突变类型；两位点联合分析的特征及鉴定原则：通过ssc6:110653413t》c和ssc11:47494227t》g双位点snp分型结果联合分析：tttt型是大白猪纯种、多元回交大白猪；tttg型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；ttgg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；cctt型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；cctg型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tctt型是三元猪、三元及以上多元回交大白猪或杜洛克猪；tctg型是三元猪、三元及以上多元回交猪(长白猪、大白猪或杜洛克猪)；tcgg型是三元及以上多元回交长白猪。通过ssc6:110653413t》c和ssc13:57293969a》g双位点snp分型结果联合分析：ttaa型是大白猪纯种、多元回交大白猪；ttag型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；ttgg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；ccaa型是杜
洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；ccag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tcaa型是三元猪、三元及以上多元回交大白猪或杜洛克猪；tcag型是三元猪、三元及以上多元回交猪(长白猪、大白猪或杜洛克猪)；tcgg型是三元及以上多元回交长白猪。通过ssc11:47494227t》g和ssc13:57293969a》g双位点snp分型结果联合分析：ttaa型是大白猪纯种、杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；ttag型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；ggag型是多元回交长白猪；gggg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；tgaa型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；tgag型是二元猪、三元猪、多元回交猪(长白猪、大白猪或杜洛克猪)；tggg型是多元回交长白猪。
[0070]
本发明同时也公开了三位点联合鉴定方法，其此方法是采用上述的引物对，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果；测序序列见seq id no.7-9测序分型结果可知每头猪的ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点的突变类型。通过ssc6:110653413t》c、ssc11:47494227t》g和ssc13:57293969a》g三位点snp分型结果联合分析：ttttaa型是大白纯种猪、多元回交大白猪；ttttag型是多元回交大白猪；tttgaa型是多元回交大白猪；tttgag型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；ttt ggg型是多元回交长白猪；ttggag型是多元回交长白猪；ttgggg型是长白纯种猪、多元回交长白猪；ccttaa型是杜洛克纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；ccttag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；cctgaa型是三元及以上多元回交杜洛克猪；cctgag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tcttaa型是三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tcttag型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tctgaa型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tctgag型是三元猪、三元及以上多元回交猪(杜洛克猪、长白猪或大白猪)；tctggg型是三元及以上多元回交长白猪；tcggag型是三元及以上多元回交长白猪；tcgggg型是三元及以上多元回交长白猪。
[0071]
本发明更加详细的描述如下：
[0072]
常染色体筛选：
[0073]
根据613头杜洛克猪illumina snp60芯片位点数据、503头长白猪illumina snp50芯片位点数据、10头大白猪重测序数据分析，经过位点筛选，计算出杜洛克猪1-18号常染色体总位点数是52258，90％以上纯合位点数是17948；长白猪1-18号常染色体总位点数是48036，90％以上纯合位点数是11919；大白猪1-18号常染色体总位点数是19989824，90％以上纯合位点数是5108549。本试验利用长白猪、杜洛克猪共1116个样本的芯片数据在6号、11号和13号常染色体上共检出18643个snp位点(见“外三元”纯种猪芯片测序位点及90％以上纯和位点统计表即表1)。
[0074]
表1“外三元”纯种猪芯片测序位点及90％以上纯和位点统计表
[0075][0076][0077]
chr：chromosome染色体
[0078]
大白猪、长白猪、杜洛克猪特异性snp位点的获得：
[0079]
根据613头杜洛克猪illumina snp60芯片位点数据、503头长白猪illumina snp50芯片位点数据、
[0080]
10头大白猪重测序90％以上纯合位点数据分析，找到长白猪有多个特有突变位点，杜洛克猪有多个特有的突变位点，大白猪有多个特有的突变位点。通过对比筛选，获得ssc6:110653413t》c、ssc11:47494227
[0081]
t》g和ssc13:57293969a》g三个纯和率较高的特异性位点，具体位点信息如表2、表3所示(表2为
[0082]
ssc6:110653413t》c、ssc11:47494227t》g和ssc13:57293969a》g位点信息表，表3为ssc6:110653413
[0083]
t》c、ssc11:47494227t》g和ssc13:57293969a》g位点在“外三元”猪内的基因型统计表)。
[0084]
表2ssc6:110653413t》c、ssc11:47494227t》g和ssc13:57293969a》g位点信息表
[0085][0086]
chr：chromosome染色体
[0087]
表3ssc6:110653413t》c、ssc11:47494227t》g和ssc13:57293969a》g位点在“外三元”猪内的基因型统计表
实施方案及鉴定计划：
[0088]
根据长白猪、大白猪、杜洛克猪特有的基因突变位点，选用纯和率较高的杜洛克猪特有的突变位点
[0089]
ssc6:110653413t》c，长白猪特有的2个突变位点ssc13:57293969a》g和ssc11:47494227t》g，利用引物对seq id no.1-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序，具体的扩增及测序步骤如下：
[0090]
(1)采集猪耳样，利用dna提取试剂盒，提取猪耳组织dna。
[0091]
(2)利用如下引物进行扩增：
[0092][0093]
(3)以猪耳dna为模板，利用上下游引物及pcr扩增体系：模板dna 3μl，上、下游引物各
[0094]
1.5μl，taq dna聚合酶15μl，用ddh2o补足体系至30μl。pcr扩增程序：95℃预变性3min；95℃
[0095]
变性5s，55℃退火30s，72℃延伸50s，共40个循环；最后72℃延伸5min；4℃。扩增后，产生产物
[0096]
1、2和3。
[0097]
(4)测序及测序结果如下：
[0098]
将pcr扩增产物1、2和3进行琼脂糖凝胶电泳。
[0099]
pcr扩增结果：
[0100]
ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点通过二元猪、三元猪、法系长白纯种母猪、美系大白纯种母猪、丹系杜洛克纯种公猪、加系大白纯种公猪、丹系大白纯种公猪、加系长白纯种公猪、丹系长白纯种公猪分别提取的基因组dna做pcr扩增，扩增电泳结果如图4至图6所示，条带清晰，大小无误时，送测序公司进行测序。测序序列见seq id no.7-9，获得测序分型结果峰图；通过测序分型结果可知每头猪的ssc13:57293969a》g位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc6:110653413t》c位点的突变类型；这3个位点的突变类型即可用于鉴定“外三元”纯种、二元、三元和多元回交猪。
[0101]
(5)单snp位点方案如下：
[0102]
1)ssc6:110653413t》c位点的突变类型及对应的猪种推测如下：
[0103][0104]
2)ssc11:47494227t》g位点的突变类型及对应的猪种推测如下：
[0105][0106]
3)ssc13:57293969a》g位点的突变类型及对应的猪种推测如下：
[0107][0108]
(6)双snp位点联合分析方案如下：
[0109]
1)ssc6:110653413t》c位点和ssc11:47494227t》g位点联合分析所得的突变类型及对应的猪种推测如下：
[0110][0111]
2)ssc6:110653413t》c位点和ssc13:57293969a》g位点联合分析所得的突变类型及对应的猪种推测如下：
[0112][0113]
3)ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点联合分析所得的突变类型及对应的猪种推测如下：
[0114][0115]
(7)三snp位点联合分析方案如下：ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点联合分析所得的所有突变类型及对应的猪种推测如下：
[0116]
[0117][0118]
利用不同品系的“外三元”纯种、二元、三元和多元回交猪进行种质鉴定方案的验证：
[0119]
通过在纯种公猪、纯种母猪、三元猪、二元猪共计115头猪中(猪种质鉴定方案验证猪只品种信息表)验证结果，对比峰图分析，获得ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点信息。
[0120]
猪种质鉴定方案验证猪只品种信息表
[0121][0122]
种质鉴定方案的验证结果如下：
[0123]
二元猪在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为tt型，在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为tg型，在ssc13:57293969a》g位点的突变类型为ag型；
[0124]
三元猪在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为tc型，在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为tg型，在ssc13:57293969a》g位点的突变类型为ag型；法系长白纯种母猪在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为tt型，在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为gg型，在ssc13:57293969a》g位点的突变类型为gg型；美系大白纯种母猪在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为tt型，在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为tt型，在ssc13:57293969a》g位点的突变类型为aa型；丹系杜洛克纯种公猪在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为cc型，在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为tt型，在ssc13:57293969a》g位点的突变类型为aa型；加系大白纯种公猪在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为tt型，在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为tt型，在ssc13:57293969a》g位点的突变类型为aa型；丹系大白纯种公猪在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为tt型，在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为tt型，在ssc13:57293969a》g位点的突变类型为aa型；加系长白纯种公猪在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为tt型，在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为gg型，在ssc13:57293969a》g位点的突变类型为gg型；丹系长白纯种公猪，在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为tt型，在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为gg型，在
ssc13:57293969a》g位点的突变类型为gg型。
[0125]
因此可以看出大白猪、长白猪、杜洛克猪、二元猪、三元猪分别在ssc6:110653413t》c位点的突变类型为tt型、tt型、cc型、tt型、tc型(如图7)；在ssc11:47494227t》g位点的突变类型为tt型、gg型、tt型、tg型、tg型(如图8)；在ssc13:57293969a》g位点的突变类型为aa型、gg型、aa型、ag型、ag型(如图9)。根据上述9个不同品种、品系猪的验证结果可知，本发明中涉及的三个位点ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点做为“外三元”猪种质鉴定的特有位点，具有鉴定过程简单，鉴定结果稳定可靠的特点。这不但克服了全基因组芯片测序，周期长、费用高的缺陷，还具有测序过程简单、测序周期短费用低的推广优势。可以应用于“外三元”纯种、二元、三元和多元回交猪的种质鉴定。
[0126]
测序结果具体如下：
[0127]
分别选择ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点扩增的特异性较好的pcr产物送出测序。二元猪、三元猪、法系长白纯种母猪、美系大白纯种母猪、丹系杜洛克纯种公猪、加系大白纯种公猪、丹系大白纯种公猪、加系长白纯种公猪、丹系长白纯种公猪分别在ssc6:110653413t》c位点、ssc11:47494227t》g位点和ssc13:57293969a》g位点的测序峰图如图7至9所示。
[0128]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

技术特征：
1.一种用于外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪种质鉴定的引物对，其特征在于：所述引物对包括扩增含有ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点中的一种或两种以上的引物对：其中，扩增含有ssc6:110653413t>c位点的引物对中的上游引物为seq id no.1(5'aatctccgactctgg3')，下游引物为seq id no.2(5'gagctgcaaatgtgag3')；扩增含有ssc11:47494227t>g位点的引物对中的上游引物为seq id no.3(5'gggtgggaaggaagtct)，下游引物为seq id no.4(5'aagccagacggtgaagat 3')；扩增含有ssc13:57293969a>g位点的引物对中的上游引物为seq id no.5(5'ttacggagtagaagcaa3')，下游引物为seq id no.6(5'gatggcaggaaagaaa 3')。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点均为susscorfa11.1版的基因组位置和具体突变。3.包括如权利要求1或2所述的引物对的外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的种质鉴定试剂盒。4.一种利用如权利要求1或2所述的引物对的单snp位点鉴定外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，其特征在于：所述方法利用所述的引物对，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序，获得测序分型结果；通过测序分型结果获得每头猪的ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点的突变类型；这三个位点的突变类型即能够用于鉴定外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪；这些位点的特征及鉴定原则为：通过ssc6:110653413t>c单位点的snp分型结果分析；tt型是长白猪纯种或大白猪纯种、二元猪、多元回交长白猪或大白猪；tc型是三元猪、三元及以上多元回交猪；cc型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；通过ssc11:47494227t>g单位点的snp分型结果分析：tt型是大白猪纯种或杜洛克猪纯种、三元猪、多元回交大白猪、三元及以上多元回交杜洛克猪；tg型是二元猪、三元猪、多元回交猪；gg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；通过ssc13:57293969a>g单位点的snp分型结果分析：aa型是大白猪纯种或杜洛克猪纯种、三元猪、多元回交大白猪、三元及以上多元回交杜洛克猪；ag型是二元猪、三元猪、多元回交猪；gg型是长白猪纯种、多元回交长白猪。5.一种利用如权利要求1或2所述的引物对的双snp位点联合鉴定外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，其特征在于：所述双snp位点为ssc6:110653413t>c位点和ssc11:47494227t>g位点，所述引物对为seq id no.1-4，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果；ssc6:110653413t>c位点和ssc11:47494227t>g双位点联合分析特征及选育原则为：tttt型是大白猪纯种、多元回交大白猪；tttg型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；ttgg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；cctt型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；cctg型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tctt型是三元猪、三元及以上多元回交大白猪或杜洛克猪；tctg型是三元猪、三元及以上多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；
tcgg型是三元及以上多元回交长白猪。6.一种利用如权利要求1或2所述的引物对的双snp位点联合鉴定外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，其特征在于：所述双snp位点为ssc6:110653413t>c位点和ssc13:57293969a>g位点，所引物对为seq id no.1-2、seq id no.5-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果；ssc6:110653413t>c位点和ssc13:57293969a>g位点双位点联合分析特征及选育原则为：ttaa型是大白猪纯种、多元回交大白猪；ttag型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；ttgg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；ccaa型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；ccag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tcaa型是三元猪、三元及以上多元回交大白猪或杜洛克猪；tcag型是三元猪、三元及以上多元回交猪；tcgg型是三元及以上多元回交长白猪。7.一种利用如权利要求1或2所述的引物对的双snp位点联合鉴定外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，其特征在于：所述双snp位点为ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点，所述引物对为seq id no.3-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果；ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点双位点联合分析特征及选育原则为：ttaa型是大白猪纯种、杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；ttag型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；ggag型是多元回交长白猪；gggg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；tgaa型是三元猪，三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；tgag型是二元猪、三元猪、多元回交猪；tggg型是多元回交长白猪。8.一种利用如权利要求1或2所述的引物对的三snp位点联合鉴定外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，其特征在于：所述三snp位点为ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点，所述引物对为seq id no.1-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果；ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点三位点联合分析特征及选育原则为：ttttaa型是大白纯种猪、多元回交大白猪；ttttag型是多元回交大白猪；tttgaa型是多元回交大白猪；tttgag型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；tttggg型是多元回交长白猪；ttggag型是多元回交长白猪；ttgggg型是长白纯种猪、多元回交长白猪；ccttaa型是杜洛克纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；ccttag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；cctgaa型是三元及以上多元回交杜洛克猪；cctgag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tcttaa型是三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tcttag型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tctgaa型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tctgag型是三元猪、三元及以上多元回交猪；tctggg型是三元及以上多元回交长白猪；tcggag型是三元及以上多元回交长白猪；tcgggg型是三元及以上多元回交长白猪。9.如权利要求1或2所述的引物对在猪种质鉴定中的应用。10.如权利要求3至8任一项所述的引物对在猪种质鉴定中的应用。

技术总结
本发明生物技术技术领域，公开了一种用于外三元纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪种质鉴定的引物对，所述引物对包括扩增含有Ssc6:110653413T>C位点、Ssc11:47494227T>G位点和Ssc13:57293969A>G位点中的一种或两种以上的引物对。本发明是通过分析比较大群全基因组芯片数据，挑选杜洛克猪、长白猪和大白猪特有的突变位点，利用多品系的外三元纯种猪、二元猪和三元猪等进行验证。最终获得外三元猪种鉴定的有效突变位点并制定鉴定方案。为我国外三元猪的种质净化提供技术支持，促进养猪生产持续稳定发展。持续稳定发展。持续稳定发展。


技术研发人员：蒲蕾 刘欣 张琛 郑春婷 张建斌 洪亮 吴国芳 崔茂盛 王立刚 闫峻 王磊 彭子旋 秦蕾 罗云燕 章贵峰
受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 青海省畜牧兽医科学院 天津市农业科学院
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/6