一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法与流程

一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法
技术领域
1.本发明属于微生物育种技术领域，具体涉及一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法。


背景技术：

2.d-阿洛酮糖(d-psicose)是一种稀有己酮糖，与d-果糖互为同分异构体。由于d-阿洛酮糖在医疗、保健等方面具有显著功效，在2011年被正式列入gras(公认安全，generallyrecognized as safe)食品。其甜度约为蔗糖的70％，但能量较低，具有低吸收、低卡路里等特性，可作为蔗糖的食用性替代品。此外，d-阿洛酮糖具有抑制肥胖，降血糖，降血脂等功能，非常适用于糖尿病患者和肥胖人群的食用，因此在医疗、保健方面具有显著功效。随着对其研究的不断推进，d-阿洛酮糖越来越受到广泛的关注。
3.目前生产d-阿洛酮糖的方法主要是生物转化法，生物转化法中，通过d-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化d-果糖的c-3位置的差向异构化制备d-阿洛酮糖有许多优势，例如简单的纯化过程和较高的产物浓度。现有技术中多为对d-阿洛酮糖3-差向异构酶进行基因重组或克隆的异源表达以及细胞的固定化的研究，而目前生产d-阿洛酮糖3-差向异构酶仍存在酶活较低，半衰期短、生产时间长、成本高等问题。专利cn111518853a提供了一种利用全细胞转化合成d-阿洛酮糖的方法，该专利以d-果糖为底物，加入atp、金属离子以及重组大肠杆菌(可同时表达l-鼠李树胶糖激酶和d-阿洛酮糖-3-差向异构酶或者可同时表达l-鼠李树胶糖激酶、d-阿洛酮糖-3-差向异构酶和多聚磷酸盐激酶)经过诱导后的湿菌体，经过催化反应后再加热，加入酸性磷酸酶经过脱磷酸反应，通过该工艺可以大大提高d-阿洛酮糖的转化率；当重组大肠杆菌(可同时表达l-鼠李树胶糖激酶和d-阿洛酮糖-3-差向异构酶)表达时，d-阿洛酮糖的转化率的可达到83％以上，最高可达到93％。但该方法重组大肠杆菌的转化效率有待提高。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：提供一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，克服了现有技术中的缺陷，能定向得到稳定表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组大肠杆菌菌体；得到的菌体能增加d-阿洛酮糖产量。
5.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
6.一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，包括以下步骤：
7.a.将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液；
8.b.将步骤a中稀释液于选择培养基上37℃恒温培养8～12小时，选择培养基配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉20g/l、d-果糖10g/l、iptg 0.1mm，其余为去离子水，ph值自然；
9.c.挑选步骤b中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板
培养基上37℃恒温培养8～12小时，平板培养基配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉20g/l，其余为去离子水，ph值自然；
10.d.挑选步骤c中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，一部分用于保存，一部分接种于摇瓶培养基中37℃、200～240rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.6～1.8；摇瓶培养基配的配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l，其余为去离子水，ph值自然；
11.e.将步骤d中的菌液转移到种子培养基中37℃、200～240rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.6～1.8，加诱导剂iptg，37℃恒温诱导4～6小时，收集湿菌体；其中种子培养基与摇瓶培养基相同，接种量为总重量的0.5～2％，诱导剂添加量为0.8～1.2mm iptg；
12.f.将步骤e中的湿菌体中加入底物，30℃恒温反应5～7小时，得到转化液；其中的底物配方为：d-果糖10g/l、atp 50mm、mg
2+
(硫酸镁、硝酸镁或氯化镁)5mm，其余为纯净水，调ph值至8.0～9.0；
13.g.将步骤f中的转化液加热至100℃，调ph值至4.5～5.5，再加酸性磷酸酶(ap)50ppm，30℃摇床10～14小时；再用naoh调ph值至6.5～7.5，100℃加热以终止反应；2000～4000rpm转速离心8～12min收集上清，浓缩干燥后即得到d-阿洛酮糖。
14.优选的，所述的步骤a中d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌为专利cn111518853a方法得到的同时表达l-鼠李树胶糖激酶和d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组大肠杆菌。
15.优选的，所述的步骤a中梯度稀释为从10-1
到10-9
。
16.优选的，所述的步骤b中37℃恒温培养10小时。
17.优选的，所述的步骤c中菌落形态为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落；37℃恒温培养10小时。
18.优选的，所述的步骤d中菌落形态为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落；220rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.7。
19.优选的，所述的步骤e中接种量为1％，220rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.7；加1.0mm诱导剂iptg，37℃恒温诱导5小时。
20.优选的，所述的步骤f中恒温反应6小时,mg
2+
为硫酸镁，调ph值至8.5。
21.优选的，所述的步骤g中转化液加热至100℃，调ph值至5.0，再加酸性磷酸酶(ap)50ppm，30℃摇床12小时；再用naoh调ph值至7.0，100℃加热以终止反应；3000rpm转速离心10min收集上清。
22.优选的，所述的步骤g中浓缩是采用旋转蒸发器进行浓缩，具体参数是温度：80℃，真空度≥0.09mpa浓缩至固含量50％；干燥是采用乙醇洗涤方法进行干燥，具体参数是浓缩液60℃时按醇水比1：1.1加入适量乙醇，降温至40℃，然后加1.5％晶种保温1h，然后按1℃/h降温至20℃搅拌结晶，将上述结晶液抽滤，得到湿晶体，用乙醇洗涤至无色后抽滤，于45℃鼓风干燥箱中烘干。
23.由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
24.本发明通过在固体培养基内加入d-果糖和少量iptg来选择培养并筛选，获得生长健壮、性能优良、更适用于生产的重组大肠杆菌，得到的菌株能够使转化效率最高可达到98％，相对于现有技术的转化效率明显提高；得到的菌株经过50代传代实验，证明遗传稳定
性良好，因此能够应用到生产中。
附图说明
25.附图1为实施例5条件下反应产物的hplc图；
26.附图2为实施例6条件下反应产物的hplc图。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明的技术方案进一步描述：
28.实施例1:菌株选育一
29.a.将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌(专利cn111518853a方法得到的同时表达l-鼠李树胶糖激酶和d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组大肠杆菌)用灭菌水进行梯度稀释，得到10-1
到10-9
稀释液；
30.b.将步骤a中的10-5
到10-9
稀释液分别涂布于选择培养基上，37℃恒温培养8小时，选择培养基配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉20g/l、d-果糖10g/l、iptg 0.1mm，其余为去离子水，ph值自然；
31.c.挑选步骤b中颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养8小时，平板培养基配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉20g/l，其余为去离子水，ph值自然；选择颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落一部分进行保存并命名为s101、s102、s103、s104、s105，同时将另一部分转移到液体培养基中进行培养并测定酶活。
32.实施例2:菌株选育二
33.a.将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌(菌种同实施例1)用灭菌水进行梯度稀释，得到10-1
到10-9
稀释液；
34.b.将步骤a中的10-5
到10-9
稀释液分别涂布于选择培养基上37℃恒温培养12小时，选择培养基配方同实施例1；
35.c.挑选步骤b中颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养12小时，平板培养基配方同实施例1；选择颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落一部分进行保存并命名为s201、s202、s203、s204、s205，同时将另一部分转移到液体培养基中进行培养并测定酶活。
36.实施例3:菌株选育三
37.a.将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌(菌种同实施例1)用灭菌水进行梯度稀释，得到10-1
到10-9
稀释液；
38.b.将步骤a中的10-5
到10-9
稀释液分别涂布于选择培养基上37℃恒温培养10小时，选择培养基配方同实施例1；
39.c.挑选步骤b中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养10小时，平板培养基配方同实施例1；选择颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落一部分进行保存并命名为s301、s302、s303、s304、s305，同时将另一部分转移到液体培养基中进行培养并测定酶活。
40.通过实施例1-3，初筛共得到15株菌株，分别是s101-s105，s201-s205，s301-s305。
41.实施例4:发酵筛选一
42.d.挑选实施例3中筛选到的s301接种于装有50ml摇瓶培养基的摇瓶中，37℃、200rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.6；摇瓶培养基配的配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l，其余为去离子水，ph值自然；
43.e.将步骤d中的菌液5ml转移到装有1000ml种子培养基的摇瓶中，37℃、200rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.6，加诱导剂iptg，37℃恒温诱导6小时，收集得到湿菌体50克；其中种子培养基与摇瓶培养基相同，接种量为总重量的0.5％，诱导剂添加量为0.8mm iptg。
44.f.将步骤e中的湿菌体中加入底物1000ml，30℃恒温反应5小时，得到转化液；其中的底物配方为：d-果糖10g/l、atp 50mm、硝酸镁5mm，其余为纯净水，调ph值至8.0；
45.g.将步骤f中的转化液加热至100℃，调ph值至4.5，再加酸性磷酸酶(ap)50ppm，30℃摇床14小时；再用naoh调ph值至6.5，100℃加热以终止反应；2000rpm转速离心12min收集上清，旋转蒸发器进行浓缩，60℃时乙醇洗涤、降温结晶后干燥箱烘干即得到d-阿洛酮糖9.0克，转化率为90％。
46.实施例5:发酵筛选二
47.d.挑选实施例3中筛选到的s301接种于装有50ml摇瓶培养基的摇瓶中，37℃、240rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.8；摇瓶培养基配的配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l，其余为去离子水，ph值自然；
48.e.将步骤d中的菌液20ml转移到装有1000ml种子培养基的摇瓶中，37℃、240rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.8，加诱导剂iptg，37℃恒温诱导4小时，收集得到湿菌体80克；其中种子培养基与摇瓶培养基相同，接种量为总重量的2％，诱导剂添加量为1.2mm iptg。
49.f.将步骤e中的湿菌体中加入底物1000ml，30℃恒温反应7小时，得到转化液；其中的底物配方为：d-果糖10g/l、atp 50mm、mg
2+
(氯化镁)5mm，其余为纯净水，调ph值至8.0～9.0；
50.g.将步骤f中的转化液加热至100℃，调ph值至5.5，再加酸性磷酸酶(ap)50ppm，30℃摇床10小时；再用naoh调ph值至7.5，100℃加热以终止反应；4000rpm转速离心8min收集上清，按实施例4方法浓缩干燥后即得到d-阿洛酮糖9.4克，转化率为94％。
51.实施例6:发酵筛选三
52.d.挑选实施例3中筛选到的s301接种于装有50ml摇瓶培养基的摇瓶中，37℃、220rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.7；摇瓶培养基配的配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l，其余为去离子水，ph值自然；
53.e.将步骤d中的菌液10ml转移到装有1000ml种子培养基的摇瓶中，37℃、220rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.7，加诱导剂iptg，37℃恒温诱导5小时，收集得到湿菌体70克；其中种子培养基与摇瓶培养基相同，接种量为总重量的1％，诱导剂添加量为1.0mm iptg。
54.f.将步骤e中的湿菌体中加入底物1000ml，30℃恒温反应6小时，得到转化液；其中的底物配方为：d-果糖10g/l、atp 50mm、硫酸镁5mm，其余为纯净水，调ph值至8.5；
55.g.将步骤f中的转化液加热至100℃，调ph值至5.0，再加酸性磷酸酶(ap)50ppm，30
℃摇床12小时；再用naoh调ph值至7.0，100℃加热以终止反应；3000rpm转速离心10min收集上清，按实施例4方法浓缩干燥后即得到d-阿洛酮糖9.8克，转化率为98％。
56.通过实施例4-6可得出结论，实施例6为最佳发酵实验条件。
57.实施例7:发酵筛选四
58.将实施例1-3筛选到的所有菌株分别通过实施例6发酵方法进行发酵，得到的d-阿洛酮糖重量及转化率分别如表1：
59.表1实施例1-3筛选到的菌种发酵实验结果
[0060][0061]
通过上述结果可见，s102,s103,s203,s204,s303,s304,s305菌株产量较高。
[0062]
实施例8:稳定性实验
[0063]
将实施例7得到的产量较高的菌株进行遗传稳定性实验结果显示，s103、s204、s304、s305菌传代50代后收率不变。证明可以用于工业生产。
[0064]
对比例1:
[0065]
不用果糖进行筛选，其它条件同实施例3得到5株菌株，将5株菌株同实施例6进行发酵实验。得到的产品中，最高产量为8.8g及转化率为88％。
[0066]
对比例2：
[0067]
不用iptg，其它条件同实施例3得到5株菌株，将5株菌株同实施例6进行发酵实验。得到的产品中，最高产量为9.0g及转化率为90％。
[0068]
对比例3：
[0069]
不用果糖和iptg进行筛选，其它条件同实施例3得到5株菌株，将5株菌株同实施例6进行发酵实验。得到的产品中，最高产量为8.5g及转化率为85％。结果分析:
[0070]
通过对实施例及对比例的产品分析得出如下结论：单独使用果糖或者iptg能够略微提高产品获得数量及转化率(实施例3与对比例1、对比例2相比较)，但效果并不明显；使用果糖和iptg进行筛选可以显著提高d-阿洛酮糖产量及转化率(实施例3与对比例3相比较)。
[0071]
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，其特征在于：包括以下步骤：a.将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液；b.将步骤a中稀释液于选择培养基上37℃恒温培养8～12小时，选择培养基配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉20g/l、d-果糖10g/l、iptg 0.1mm，其余为去离子水，ph值自然；c.挑选步骤b中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养8～12小时，平板培养基配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉20g/l，其余为去离子水，ph值自然；d.挑选步骤c中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，一部分用于保存，一部分接种于摇瓶培养基中37℃、200～240rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.6～1.8；摇瓶培养基配的配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l，其余为去离子水，ph值自然；e.将步骤d中的菌液转移到种子培养基中37℃、200～240rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.6～1.8，加诱导剂iptg，37℃恒温诱导4～6小时，收集湿菌体；其中种子培养基与摇瓶培养基相同，接种量为总重量的0.5～2％，诱导剂添加量为0.8～1.2mm iptg；f.将步骤e中的湿菌体中加入底物，30℃恒温反应5～7小时，得到转化液；其中的底物配方为：d-果糖10g/l，atp 50mm，硫酸镁、硝酸镁或氯化镁5mm，其余为纯净水，调ph值至8.0～9.0；g.将步骤f中的转化液加热至100℃，调ph值至4.5～5.5，再加酸性磷酸酶(ap)50ppm，30℃摇床10～14小时；再用naoh调ph值至6.5～7.5，100℃加热以终止反应；2000～4000rpm转速离心8～12min收集上清，浓缩干燥后即得到d-阿洛酮糖。2.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，其特征在于：所述步骤a中梯度稀释为从10-1
到10-9
。3.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，其特征在于：所述步骤b中37℃恒温培养10小时。4.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，其特征在于：所述步骤c中菌落形态为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落；37℃恒温培养10小时。5.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，其特征在于：所述步骤d中菌落形态为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落；220rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.7。6.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，其特征在于：所述步骤e中接种量为1％，220rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.7；加1.0mm诱导剂iptg，37℃恒温诱导5小时。7.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，其特征在于：所述步骤f中恒温反应6小时,mg
2+
为硫酸镁，调ph值至8.5。8.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，其特征在于：所述步骤g中转化液加热至100℃，调ph值至5.0，再加酸性磷酸酶(ap)50ppm，30℃摇
床12小时；再用naoh调ph值至7.0，100℃加热以终止反应；3000rpm转速离心10min收集上清。9.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，其特征在于：所述步骤g中浓缩是采用旋转蒸发器进行浓缩，温度：80℃，真空度≥0.09mpa浓缩至固含量50％；干燥是采用乙醇洗涤方法进行干燥，先将浓缩液60℃时按醇水比1:1.1加入适量乙醇，降温至40℃，然后加1.5％晶种保温1h，然后按1℃/h降温至20℃搅拌结晶，将上述结晶液抽滤，得到湿晶体，用乙醇洗涤至无色后抽滤，于45℃鼓风干燥箱中烘干。

技术总结
本发明属于微生物育种技术领域，公开了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌诱导选育方法，该方法将待选择菌株的稀释液于选择培养基上37℃恒温培养8～12小时后，挑选颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落继续平板培养，再挑选颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落来实现，其中选择培养基配方为酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L、D-果糖10g/L、IPTG 0.1mM，其余为去离子水，pH值自然；平板培养基配方为酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L，其余为去离子水，pH值自然。本发明能定向得到稳定表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组大肠杆菌菌体；得到的菌体能增加D-阿洛酮糖产量。量。


技术研发人员：朱理平 徐良平 马旭
受保护的技术使用者：东台市浩瑞生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/6