一种乌贼墨抗肝癌寡肽及其制备方法和用途

1.本发明涉及到一种海洋抗肝癌寡肽，具体指涉及一种具有抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡的乌贼墨寡肽及其应用。


背景技术：

2.肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发和危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。原发性肝癌是原发于肝细胞或肝内胆管细胞的癌症，往往经历了肝炎、肝硬化、肝癌三个过程。原发性肝癌主要的病理类型有三种，即肝细胞癌、肝内胆管细胞癌、肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合。肝细胞癌约占85-90％，临床上一般把原发性肝细胞癌简称为肝癌。
3.在各种癌症中，肝癌发病率位居第五；死亡率位居第二，仅次于肺癌。因此，研发治疗肝癌药物与功能产品至关重要。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种具有显著抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡的抗肿瘤寡肽，该抗肿瘤寡肽可用于制备预防和治疗肝癌相关的药物。
5.本发明以乌贼墨为原料，利用酶解工艺和色谱制备技术制备得到了具有显著抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡的抗肿瘤寡肽，该抗肿瘤寡肽可用于制备治疗和/或预防肝癌的药物。
6.一方面，本发明提供了一种乌贼墨抗肝癌寡肽，该抗肿瘤寡肽为七肽化合物，其氨基酸序列为met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)，esi-ms测定分子量为838.03da，该乌贼墨抗肿瘤寡肽具有显著抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡功效。
7.另一方面，本发明提供了上述乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备方法，其包括以下步骤：乌贼墨预处理、胰蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解得到酶解物、酶解物经超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析及高效液相色谱制备得到乌贼墨抗肿瘤寡肽。
8.进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
9.1)乌贼墨预处理：将乌贼墨囊解冻，将乙酸乙酯加入到乌贼墨中，匀浆，超声脱脂，干燥；
10.2)乌贼墨蛋白的酶解：将上述脱脂乌贼墨粉末加入到磷酸盐缓冲液，溶液调温至35～45℃，调节ph值至6.5～7.5，加入乌贼墨粉末重量1.5～2.0％的胰蛋白酶，水解；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至50～60℃，加入乌贼墨粉末重量1.5～2.0％的中性蛋白酶，水解；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，离心，收集上清液，得到乌贼墨酶解液；
11.3)乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备：将上述乌贼墨酶解液经截留分子量为1.0kda和
5.0kda的超滤膜进行分级，收集分级组分，测定其抑制肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的能力，选择对细胞增殖抑制能力最强的组分冻干，得乌贼墨超滤酶解物，该超滤酶解物溶解并依次经过凝胶柱层析和反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化，得到具有显著抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡活性的乌贼墨抗肿瘤寡肽。
12.作为优选，所述步骤1)中的乌贼墨为曼氏无针乌贼(sepiella japonica)的乌贼墨。
13.作为优选，所述步骤1)中的乌贼墨与乙酸乙酯的料液比为1g:8～10ml。
14.作为优选，所述步骤2)中的磷酸盐缓冲液为0.2mol/l的磷酸盐缓冲液，所述乌贼墨粉末与磷酸盐缓冲液的料液比1g:18～25ml。
15.作为优选，所述步骤3)的凝胶柱层析和rp-hplc纯化的具体过程为：
16.凝胶柱层析：将上述乌贼墨超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为40～45mg/ml的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱层析分离，用磷酸盐缓冲液(0.2mol/l，ph 7.0)进行洗脱，流速1.0～1.5ml/min，根据214nm下的吸光值制作凝胶层析色谱图，收集各色谱峰，测定各色谱峰组分对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力，选择抑制能力最强的色谱峰组分，冻干，得乌贼墨凝胶层析酶解物。
17.rp-hplc纯化：将上述乌贼墨凝胶层析酶解物用双蒸水配成45～50μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化，根据对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力，得1个高活性寡肽met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)，esi-ms测定分子量为838.03da。
18.作为进一步优选，所述rp-hplc纯化条件为：进样量10～15μl；色谱柱zorbax,sb c-18(4.6
×
250mm，5μm))；流动相：梯度洗脱，乙腈浓度在30min内从0匀速提高至35％；洗脱速度1.0～1.5ml/min；紫外检测波长214nm。
19.再一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的所述乌贼墨抗肝癌寡肽met-gly-tyr-pro-met-his-cys。
20.另有，本发明提供一种所述的乌贼墨抗肝癌寡肽或含有其的药物组合物在制备药物中的应用。
21.进一步地，所述制备药物为在制备治疗和/或预防肝癌的药物中的应用。
22.与现有技术相比，本发明所提供的具有抗肝癌功效的乌贼墨抗肿瘤寡肽met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)可以显著地抑制肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)的增殖，促进肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)的凋亡，具有显著的抗肝癌功效。本发明met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)具有安全无毒副作用、活性强等优点，可用于制备治疗和/或预防肝癌的药物。
附图说明
23.图1是本发明的乌贼墨酶解液(wh)和超滤组分(wh-i～wh-v)在5.0mg/ml浓度下对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力。
24.图2是本发明的乌贼墨酶解液超滤组分(wh-i)羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20层析图。
25.图3羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20制备酶解物组分(wh-ia～wh-ic)在5.0mg/ml浓度下对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力。
26.图4羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20制备酶解物(wh-ib)的rp-hplc分析图。
27.图5rp-hplc分离组分在5.0mg/ml浓度下对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力。
28.图6met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)的质谱图。
29.图7met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)的结构图。
30.图8met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)在0.5-2.5mg/ml浓度下抑制肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)增殖的能力。
31.图9met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)在0.5-2.5mg/ml浓度下促进肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)凋亡的能力。
具体实施方式
32.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
33.一种乌贼墨抗肝癌寡肽，制备工艺流程如下：乌贼墨
→
预处理
→
胰蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解
→
酶解物
→
超滤
→
离子交换层析
→
凝胶过滤层析
→
高效液相色谱制备
→
具有抗肝癌功效的抗肿瘤寡肽
→
功能评价。
34.具体步骤为：
35.1)乌贼墨预处理：将曼氏无针乌贼墨囊解冻，按照料液比为1g:10ml将乙酸乙酯加入到乌贼墨中，匀浆，然后于40khz超声脱脂2小时，干燥。
36.2)乌贼墨蛋白的酶解：将上述脱脂乌贼墨粉末按照料液比1g:20ml加入到0.2mol/l的磷酸盐缓冲液，溶液调温至37℃，调节ph值至7.2，加入乌贼墨粉末重量1.8％胰蛋白酶，水解2.5h；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至55℃，加入乌贼墨粉末重量1.8％中性蛋白酶，水解2.5h；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，12000rmp离心30min，收集上清液，即乌贼墨酶解液(wh)。
37.3)乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备：将乌贼墨酶解液(wh)经截留分子量为1.0kda和5.0kda的超滤膜进行分级，收集分级组分wh-i(mw《1.0kda)、wh-ii(1.0《mw《5.0kda)和wh-iii(mw》5.0kda)，测定其对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力(见图1)，选择对增殖抑制能力最强的组分冻干，得乌贼墨超滤酶解物(wh-i)，该超滤酶解物(wh-i)依次经过凝胶柱层析和反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化，得到具有显著抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡功效的乌贼墨抗肿瘤寡肽。
38.①
凝胶柱层析：将上述乌贼墨超滤酶解物(wh-i)溶于双蒸水配成浓度为40mg/ml的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱层析分离，用磷酸盐缓冲液(0.2m，ph 7.0)进行洗脱，流速1.0～1.5ml/min，根据214nm下的吸光值制作凝胶层析色谱图(见图2)，收集各色谱峰(wh-ia、wh-ib和wh-ic)，测定各色谱峰组分对对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力(见图3)，选择对肝癌细胞株抑制能力最强的色谱峰组分，冻干，得乌贼墨凝胶层析酶解物(wh-ib)。
39.②
rp-hplc纯化：将上述乌贼墨凝胶层析酶解物(wh-ib)用双蒸水配成45μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化(见图4)，根据对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力(见图5)，得1个高活性寡肽(wp-4)。
40.③
结构检测：收集对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖抑制能力最强色谱峰(wp-4)，经
rp-hplc检测达到测序要求，利用esi-ms测定分子量为838.03da(见图6)，蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)(见图7)。
41.④
功能评价：
42.细胞增殖抑制率检测：取对数生长期的肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)，以1
×
105/ml细胞浓度种植96孔细胞培养板中，常规培养24h，样品组用dmem完全培养基稀释样品至设定浓度，空白对照组加入100μl dmem完全培养基，每组设3个复孔。样品加入96孔细胞培养板后，处理48h后，小心吸除上层含样品培养基。每孔加入10％ mtt的完全培养基继续培养4h，弃掉上清液，加入dmso，振荡溶解10min。在490nm波长处测定吸光度值(od值)。按下列公式计算细胞增殖抑制率：
43.细胞增殖抑制率(％)＝(1-实验组细胞od值/空白对照组细胞od值)
×
100％。
44.met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)对肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)增殖的影响如图8所示，在0.5～2.5mg/ml的浓度范围内，met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)对肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)显示出剂量依赖性的增殖抑制能力。
45.细胞凋亡检测：肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)种植于60mm细胞培养皿中，待细胞增长达对数生长期后，分别按照设定浓度加入样品，空白对照组加入100μl dmem完全培养基，每组设3个复孔。继续培养48h，以胰酶消化并收集细胞，用高速离心机3000r/min离心5min，磷酸盐缓冲液(0.2mol/l，ph 7.0)清洗两次，以annexin v-fitc在暗室中孵育30min，然后加入2μl的pi(100μg/ml)，用流式细胞分析检测肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)凋亡情况。
46.met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)对肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)凋亡的影响如图9所示，在0.5～2.5mg/ml的浓度范围内，met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)剂量依赖性地促进肝癌细胞株(sk-hep-1、hepg2和smmc-7721)凋亡。
47.最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种乌贼墨抗肝癌寡肽，其特征在于，所述抗肿瘤寡肽为七肽化合物，其氨基酸序列为met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)，esi-ms测定分子量为838.03da。2.如权利要求1所述一种乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：乌贼墨预处理、胰蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解得到酶解物、酶解物经超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析及高效液相色谱制备得到乌贼墨抗肿瘤寡肽。3.如权利要求2所述一种乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：1)乌贼墨预处理：将乌贼墨囊解冻，将乙酸乙酯加入到乌贼墨中，匀浆，超声脱脂，干燥；2)乌贼墨蛋白的酶解：将上述脱脂乌贼墨粉末加入到磷酸盐缓冲液，溶液调温至35～45℃，调节ph值至6.5～7.5，加入乌贼墨粉末重量1.5～2.0％的胰蛋白酶，水解；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至50～60℃，加入乌贼墨粉末重量1.5～2.0％的中性蛋白酶，水解；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，离心，收集上清液，得到乌贼墨酶解液；3)乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备：将上述乌贼墨酶解液经截留分子量为1.0kda和5.0kda的超滤膜进行分级，收集分级组分，测定其抑制肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的能力，选择对细胞增殖抑制能力最强的组分冻干，得乌贼墨超滤酶解物，该超滤酶解物溶解并依次经过凝胶柱层析和反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化，得到具有显著抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡活性的乌贼墨抗肿瘤寡肽。4.如权利要求3所述一种乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备方法，其特征在于所述步骤1)中的乌贼为曼氏无针乌贼(sepiella japonica)；所述步骤1)中的乌贼墨与乙酸乙酯的料液比为1g:8～10ml。5.如权利要求3所述一种乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备方法，其特征在于所述步骤2)中的磷酸盐缓冲液为0.2mol/l的磷酸盐缓冲液，所述乌贼墨粉末与磷酸盐缓冲液的料液比1g:18～25ml。6.如权利要求3所述一种乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备方法，其特征在于所述步骤3)的凝胶柱层析和rp-hplc纯化的具体过程为：凝胶柱层析：将上述乌贼墨超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为40～45mg/ml的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱层析分离，用磷酸盐缓冲液(0.2mol/l，ph 7.0)进行洗脱，流速1.0～1.5ml/min，根据214nm下的吸光值制作凝胶层析色谱图，收集各色谱峰，测定各色谱峰组分对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力，选择抑制能力最强的色谱峰组分，冻干，得乌贼墨凝胶层析酶解物；rp-hplc纯化：将上述乌贼墨凝胶层析酶解物用双蒸水配成45～50μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化，根据对肝癌细胞株(sk-hep-1)增殖的抑制能力，得1个高活性寡肽met-gly-tyr-pro-met-his-cys(mgypmhc)。7.如权利要求6所述一种乌贼墨抗肿瘤寡肽的制备方法，其特征在于所述rp-hplc纯化条件为：进样量10～15μl；色谱柱zorbax,sb c-18(4.6
×
250mm，5μm))；流动相：梯度洗脱，乙腈浓度在30min内从0匀速提高至35％；洗脱速度1.0～1.5ml/min；紫外检测波长214nm。8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的
乌贼墨抗肝癌寡肽met-gly-tyr-pro-met-his-cys。9.如权利要求1所述的乌贼墨抗肝癌寡肽met-gly-tyr-pro-met-his-cys或权利要求8所述的药物组合物在制备药物中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述制备药物为在制备治疗和/或预防肝癌的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种乌贼墨抗肝癌寡肽，其以乌贼墨为原料，通过预处理、胰蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解，膜超滤、色谱分离纯化得到具有抗肝癌功效的寡肽Met-Gly-Tyr-Pro-Met-His-Cys(MGYPMHC)，ESI-MS测定分子量为838.03Da。本发明制备的得到的抗肝癌功效的寡肽Met-Gly-Tyr-Pro-Met-His-Cys(MGYPMHC)可以显著地抑制肝癌细胞株(SK-Hep-1、HepG2和SMMC-7721)的增殖，促进肝癌细胞株(SK-Hep-1、HepG2和SMMC-7721)的凋亡，可应用于制备预防和治疗肝癌相关的药物。肝癌相关的药物。


技术研发人员：施垚薇 迟长凤
受保护的技术使用者：浙江海洋大学
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/9/6