一种参与花色素苷合成的转录因子StSMR1-like及应用

一种参与花色素苷合成的转录因子stsmr1-like及应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种参与花色素苷合成的转录因子stsmr1-like及应用。


背景技术：

2.马铃薯(solanum tuberosum l.)是世界第一大非谷类粮食作物，其在我国的栽培历史已有400多年。马铃薯营养丰富，有“地下苹果”、“第二面包”、“蔬菜之王”的美称。彩色马铃薯是一种特殊类型的马铃薯，主要表现为薯皮、薯肉或者芽眼具有粉红、红、浅紫、紫等颜色。彩色马铃薯用途广泛，在食品、化妆品、保健品和医药等领域被广泛开发利用。
3.研究发现，myb转录因子是植物中重要的转录因子家族，不仅参与植物的生长发育和对非生物胁迫的响应，在植物花色素苷的生物合成中也发挥着重要作用。但是植物的性状表现需要多基因协调控制，因此需要挖掘和深入分析，并发现其他的转录因子，以阐明花色素苷生物合成的机理。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种参与花色素苷合成的转录因子stsmr1-like及应用，所述stsmr1-like可明显抑制花色素苷的生物合成，是花色素苷生物合成的负向调节因子。
5.本发明提供了一种参与花色素苷合成的转录因子stsmr1-like，所述转录因子stsmr1-like的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.优选的，所述转录因子stsmr1-like为花色素苷合成的反向调控因子。
7.本发明还提供了扩增上述转录因子stsmr1-like的引物对，包括如seq idno.2所示的上游引物和seq id no.3所示的下游引物。
8.本发明还提供了一种扩增上述转录因子stsmr1-like的方法，包括以植物cdna为模板，利用上述引物对进行pcr扩增；
9.所述pcr扩增的程序包括：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸4min。
10.本发明还提供了上述转录因子stsmr1-like在控制植物花色素苷合成中的应用。
11.优选的，所述植物包括马铃薯或烟草。
12.本发明还提供了一种培育与花色素苷性状相关种质的方法，根据目标性状调控上述转录因子stsmr1-like在植物基因组中的表达。
13.优选的，所述目标性状包括花色素苷的合成量。
14.本发明还提供了一种培育低花色素苷植物突变体的方法，包括在植物基因组中表达上述转录因子stsmr1-like或提高所述转录因子stsmr1-like的表达量。
15.本发明还提供了一种培育高花色素苷植物突变体的方法，包括在植物基因组中抑制上述转录因子stsmr1-like的表达，或敲除所述转录因子stsmr1-like。
16.有益效果：本发明提供了一种参与花色素苷合成的转录因子stsmr1-like，所述转
录因子stsmr1-like的核苷酸序列如seq id no.1所示。本发明通过对三种不同颜色马铃薯块茎的薯皮薯肉转录组数据测序，在全基因组水平下对myb-related基因家族进行分析，筛选出所述转录因子stsmr1-like。
17.本发明实施例中，通过烟草瞬时表达显色实验证实了所述stsmr1-like可明显抑制花色素苷的生物合成；并通过对转基因植株的表型进行分析，过表达stsmr1-like抑制了转基因烟草花瓣中花色素苷的积累；同时对转基因植株进行实时荧光定量pcr检测，stsmr1-like在过表达烟草的花瓣和叶片中的表达量相较于野生型烟草的表达量显著(p《0.05)增加。证实所述stsmr1-like参与花色素苷生物合成，是花色素苷生物合成的负向调节因子。
附图说明
18.图1为stsmr1-like的测序结果和参考基因比对结果图；
19.图2为烟草瞬时表达试验结果图；
20.图3为stsmr1-like转基因植株nptⅱ基因的pcr检测结果图；
21.图4为stsmr1-like转基因植株目的基因pcr检测结果图；
22.图5为stsmr1-like转基因烟草y3叶片和野生型烟草y3叶片表型；
23.图6为stsmr1-like转基因烟草y3花瓣和野生型烟草y3花瓣表型；
24.图7为转stsmr1-like烟草花瓣和叶片rna的提取结果图，图中f代表转基因烟草的花瓣，l代表转基因烟草叶片，1和2代表不同的转基因株系；
25.图8为转基因烟草中stsmr1-like基因的相对表达量分析结果图，图中f代表花瓣，l代表叶片，ck代表野生型烟草；不同的数字代不同的转基因植株。
具体实施方式
26.本发明提供了一种参与花色素苷合成的转录因子stsmr1-like，所述转录因子stsmr1-like的核苷酸序列如seq id no.1所示。
27.本发明所述转录因子stsmr1-like为花色素苷合成的反向调控因子，cds区全长633bp，编码210个氨基酸。
28.本发明还提供了扩增上述转录因子stsmr1-like的引物对，包括如seq idno.2所示的上游引物(5
’‑
ggagaggacacgctcgagatgatgtatccagcga acaatcg-3’)和seq id no.3所示的下游引物(5
’‑
ttaaagcaggactcta gactacatgggaaagttgaaattctga-3’)。
29.本发明还提供了一种扩增上述转录因子stsmr1-like的方法，包括以植物cdna为模板，利用上述引物对进行pcr扩增；
30.所述pcr扩增的程序包括：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸4min。
31.本发明实施例中优选以“铃田红美”马铃薯块茎cdna为模板，采用高保真聚合酶(takara，日本)进行pcr扩增，扩增体系为50μl：5
×
primestar buffer(mg
2+
plus)10μl、dntp mixture(2.5mmol each)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板2μl、primestar hs dna polymerase(2.5u/μl)0.5μl和灭菌水31.5μl。
32.本发明还提供了上述转录因子stsmr1-like在控制植物花色素苷合成中的应用。
33.通过烟草瞬时表达显色实验证实了所述stsmr1-like可明显抑制花色素苷的生物合成；并通过对转基因植株的表型进行分析，过表达stsmr1-like抑制了转基因烟草花瓣中花色素苷的积累。证实所述stsmr1-like参与花色素苷生物合成，是花色素苷生物合成的负向调节因子，因此可利用所述stsmr1-like调控植物花色素苷的生物合成。本发明所述植物优选包括马铃薯或烟草。
34.本发明还提供了一种培育与花色素苷性状相关种质的方法，根据目标性状调控上述转录因子stsmr1-like在植物基因组中的表达。
35.本发明所述目标性状优选包括花色素苷的合成量，如通过基因工程的手段对所述转录因子stsmr1-like的表达进行控制，包括在植物基因组中表达上述转录因子stsmr1-like或提高所述转录因子stsmr1-like的表达量，可得到低花色素苷植物突变体，在植物基因组中抑制上述转录因子stsmr1-like的表达，或敲除所述转录因子stsmr1-like，可得到高花色素苷植物突变体。
36.本发明还提供了一种培育低花色素苷植物突变体的方法，包括在植物基因组中表达上述转录因子stsmr1-like或提高所述转录因子stsmr1-like的表达量。
37.本发明所述方法优选与上述相同，在此不再赘述。
38.本发明还提供了一种培育高花色素苷植物突变体的方法，包括在植物基因组中抑制上述转录因子stsmr1-like的表达，或敲除所述转录因子stsmr1-like。
39.本发明所述方法优选与上述相同，在此不再赘述。
40.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种参与花色素苷合成的转录因子stsmr1-like及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
41.实施例1
42.植物表达载体的构建
43.对三种不同颜色马铃薯(新大坪-白皮白肉、铃田红美-红皮红肉和黑美人-紫皮紫肉)块茎的薯皮薯肉转录组数据测序，在全基因组水平下对myb-related基因家族进行分析，筛选出一些可能参与花色素苷生物合成的转录候选因子。
44.本研究选用一个候选myb-related转录因子(pgsc0003dmg400007603)为目标基因，进行克隆，分析该基因在花色素苷生物合成方面的作用。根据pgsc数据库中马铃薯的全基因组序列查找pgsc0003dmg400007603的cds序列，利用primer 6.0引物设计软件设计目的基因扩增引物，具体引物为正向引物：5
’‑
ggagaggacacgctcgagatgatgtatccagcgaacaatcg-3’，反向引物：5
’‑
ttaaagcaggactctagactacatgggaaagttgaaattctga-3’。以“铃田红美”马铃薯块茎cdna为模板，采用高保真聚合酶(takara，日本)进行pcr扩增，扩增体系为50μl。具体如下：采用高保真聚合酶(takara，日本)进行pcr扩增，扩增体系为50μl：5
×
primestarbuffer(mg
2+
plus)10μl、dntp mixture(2.5mmol each)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板2μl、primestar hs dnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl和灭菌水31.5μl。pcr扩增：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸45s，总共循环30次；72℃延伸4min。
45.目的片段扩增完之后，通过凝胶电泳的方式验证目的片段扩增是否完整，将扩增完整的片段命名为stsmr1-like。将纯化完成的pcr产物测序后利用pcr一步定向克隆试剂盒无缝克隆到植物表达载体part-cam中。
46.载体的构建及连接
47.①
载体线性化
48.植物表达载体选用part-cam载体。首先进行载体线性化：用xhoi和xbai双酶切质粒part-cam，酶切后通过琼脂糖凝胶电泳进行结果检测，切取载体大片段对应条带的凝胶，采用凝胶回收试剂盒(百泰克胶回收试剂盒)回收酶回收酶切产物。
49.②
构建植物表达载体
50.将纯化完成的pcr产物与植物表达载体part-cam通过novorec pcr一步定向克隆试剂盒(近岸蛋白科技，苏州)进行无缝克隆，将stsmr1-like基因重组到part-cam载体中。将所述stsmr1-like与参考基因(pgsc0003dmg400007603)(http://spuddb.uga.edu/)进行序列比对。由图1看出，stsmr1-like与参考基因的同源性达到了99.2％以上，cds区全长633bp，编码210个氨基酸；参考基因全长579bp，编码193个氨基酸，其中在537bp到704bp的位置多出了107bp的序列。
51.实施例2
52.烟草瞬时表达显色实验
53.为了初步分析stsmr1-like在调控花色素苷生物合成的功能，进行了烟草瞬时表达实验观察烟草叶片的显色反应。具体操作如下：
54.(1)农杆菌的培养与活化：取-80℃保存的工程菌种，用涂布器接种到含有(100mg/l spec+50mg/l str+25mg/l rif)抗生素的lb固体平板上，倒置于28℃黑暗条件下培养2d后。
55.(2)将培养好的农杆菌用一次性接种环刮取适量的菌株，转移至添加了mgcl2和乙酰丁香酮的溶液中，静置1h后，轻柔倒转混匀后再次静置1h。保持菌液浓度od
600
为0.8左右，并且预混菌液时间不可超过两个小时，避免菌株状态不好。
56.(3)选取形态健壮，时期适宜的烟草植株(长至五到六片叶)用于烟草注射。将含有stan1与stsmr1-like的农杆菌等比例混合后，使用1ml无菌无酶的一次性注射器从烟草叶片下表皮慢慢注射，让菌液充满一侧烟草叶片；将含有stan1和part-cam空载体(ev)农杆菌等比例混合，注射到烟草叶片的另一侧，作为对照。注射后培养3～5d，观察烟草叶片颜色的变化，并拍摄照片。
57.stan1是调控花色素苷生物积累的主效因子(jung et al.,2009；liu et al.,2016)，stan1可与bhlh1、wd40结合形成mbw复合体，促进花色素苷的积累。以五叶龄的烟草y3为试验材料，进行烟草瞬时表达显色试验，在烟草叶片的右侧注射马铃薯花色素苷合成激活子stan1+ev作为对照，在叶片的左侧注射stan1+stsmr1-like，培养3～5天后观察叶片颜色。结果如图2所示，注射了stan1+ev的右侧叶片中积累了大量的花色素苷，叶片呈暗红色，而注射了stan1+stsmr1-like的左侧叶片仅有少量花色素苷积累，小部分叶片呈现出淡红色。结果说明，stsmr1-like与stan1混合注射后，stsmr1-like可明显抑制花色素苷的生物合成，是花色素苷生物合成的负向调节因子。
58.实施例3
59.烟草稳定遗传转化
60.观察过表达植株的表型性状，并分析该基因在转基因烟草中的相对表达量。本试验采用叶盘法进行烟草稳定遗传转化，具体操作如下：
cam阳性对照在455bp左右均有明显条带，ck作为阴性对照未出现条带，且扩增了目的基因片段243bp，证明所获得的再生植株为转基因植株。
72.(10)将筛选好的阳性转化苗种植于花盆中，待到开花时取样。分别取植株的叶片和烟草花瓣，并保存于无菌无酶的离心管中，迅速放置于液氮中冻存，放于-80℃以备后续试验使用。
73.对转基因植株表型性状分析发现，与野生烟草植株的叶片相比，叶片形态呈现皱缩卷曲，叶片形状不规整。烟草叶片颜色深浅不一，呈现出深绿色和野生绿色相间的状态(图5)；由图6看出，与野生型烟草的花瓣相比，stsmr1-like转基因烟草植株的花瓣整体形态较小，颜色明显浅于对照，呈现出淡粉色或白色。结果说明，过表达stsmr1-like抑制了转基因烟草花瓣中花色素苷的积累，这与烟草瞬时表达试验的结果一致。
74.实施例4
75.stsmr1转基因烟草叶片和花瓣rna提取
76.为了进一步分析stsmr1-like在转基因烟草植株中的表达量，首先对实施例3得到的转基因烟草花瓣和叶片进行了总rna提取，用于实时荧光定量pcr。如图7所示，可以清晰地看见28s和18s的条带。通过nd-2000分光光度计检测到的浓度在300ng/μl左右。这说明所提取的rna较为完整，可以用于后期实时荧光定量pcr试验。
77.通过提取转基因植株的叶片和花瓣的rna，并进行实时荧光定量pcr。结果显示，stsmr1-like在过表达烟草花瓣中的表达量相较于野生型烟草的表达量显著(p《0.05)增加；stsmr1-like基因在过表达叶片中的表达量相较于野生型烟草的表达量也有显著(p《0.05)增加(图8)。
78.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
79.参考文献：jung cs,griffiths hm,de jong dm,cheng s,bodis m,kim ts,de jong ws.2009.the potato developer(d)locus encodes an r2r3 myb transcription factorthat regulates expression ofmultiple anthocyanin structural genes in tuber skin.theoretical andapplied genetics 120,45-57.
80.liu y,kui lw,espley rv,wang l,yang h,yu b,andrew d,erika vg,wang j,zhang j.2016.functional diversification of the potato r2r3 myb anthocyanin activators an1,myba1,and myb113 and their interaction with basic helix-loop-helix cofactors.journal ofexperimental botany 67,2159-2176。

技术特征：
1.一种参与花色素苷合成的转录因子stsmr1-like，其特征在于，所述转录因子stsmr1-like的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述转录因子stsmr1-like，其特征在于，所述转录因子stsmr1-like为花色素苷合成的反向调控因子。3.扩增权利要求1或2所述转录因子stsmr1-like的引物对，其特征在于，包括如seq id no.2所示的上游引物和seq id no.3所示的下游引物。4.一种扩增权利要求1或2所述转录因子stsmr1-like的方法，其特征在于，包括以植物cdna为模板，利用权利要求3所述引物对进行pcr扩增；所述pcr扩增的程序包括：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸4min。5.权利要求1或2所述转录因子stsmr1-like在控制植物花色素苷合成中的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述植物包括马铃薯或烟草。7.一种培育与花色素苷性状相关种质的方法，其特征在于，根据目标性状调控权利要求1或2所述转录因子stsmr1-like在植物基因组中的表达。8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述目标性状包括花色素苷的合成量。9.一种培育低花色素苷植物突变体的方法，其特征在于，包括在植物基因组中表达权利要求1或2所述转录因子stsmr1-like或提高所述转录因子stsmr1-like的表达量。10.一种培育高花色素苷植物突变体的方法，其特征在于，包括在植物基因组中抑制权利要求1或2所述转录因子stsmr1-like的表达，或敲除所述转录因子stsmr1-like。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种参与花色素苷合成的转录因子StSMR1-like及应用。本发明所述转录因子StSMR1-like的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。本发明通过烟草瞬时表达显色实验证实了所述StSMR1-like可明显抑制花色素苷的生物合成；并通过对转基因植株的表型进行分析，过表达StSMR1-like抑制了转基因烟草花瓣中花色素苷的积累；同时对转基因植株进行实时荧光定量PCR检测，StSMR1-like在过表达烟草的花瓣和叶片中的表达量相较于野生型烟草的表达量显著(P<0.05)增加。证实所述StSMR1-like参与花色素苷生物合成，是花色素苷生物合成的负向调节因子。苷生物合成的负向调节因子。苷生物合成的负向调节因子。


技术研发人员：刘玉汇 刘震 李元铭 李田 李进福 姚攀峰 白江平 毕真真 孙超 李华泽 张俊莲
受保护的技术使用者：甘肃农业大学
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/9/6