SERS-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法

sers-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法
技术领域
1.本发明涉及一种sers-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法，属于化学分析领域。


背景技术：

2.啶虫脒作为一种新烟碱类杀虫剂，与乙酰胆碱受体结合，可抑制昆虫神经传导活动，广泛用于水稻、蔬菜、果树、茶叶的蚜虫、飞虱、蓟马、部分鳞翅目害虫等的防治。然而，滥用含有啶虫脒的农药会导致农作物中残留过多并进入水系统，从而对人们造成潜在的健康风险，包括内分泌系统紊乱、致癌和先天性缺陷。根据食品安全国家标准，苹果、葡萄和香蕉中啶虫脒的最大残留量分别为0.8、0.5、3mg/ml。
3.为了避免啶虫脒对健康的危害，量化农产品受啶虫脒的污染程度具有重要意义。近几十年来，仪器方法和基于免疫的方法已发展成为检测啶虫脒的主流方法。然而，昂贵的仪器和对训练有素的技术人员的需求限制了仪器方法的发展。此外，高昂的价格和严格的运输和储存条件也限制了基于抗体的方法的实际适用性。
4.近年来，基于表面增强拉曼光谱(sers)的生物传感器由于其具有高灵敏度、特异性和多重检测能力的优势，从而成为食品安全中一种非常有前途的替代方法。作为基于sers的生物传感器的核心组件，sers探针通常由增强基底(如金纳米颗粒)和拉曼报告子(rrs)组成。我们之前工作(专利号：cn202011298830.9，发明名称：一种利用sers技术对食品中ota残留的检测方法)利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)作为rrs，tmb的催化产物容易且牢固地附着在金属纳米结构的表面。在竞争结合的作用机制下，催化后tmb的表面增强拉曼散射强度与检测目标呈负相关，结合催化后tmb的sers强度以及先前计算出的负相关线性关系即可测量目标物在食品中的含量。然而，传统rrs(如罗丹明6g、4-巯基吡啶、2'2-联吡啶和tmb)在食品分析的实际应用中仍然存在一些问题。特别是，食品生物分子和传统rrs的拉曼发射形成于《1800cm-1
，由光谱叠加现象产生的拉曼干扰会严重影响检测结果的准确性。因此，迫切需要开发一种抗干扰的rrs用于食品分析。


技术实现要素：

5.本发明克服了上述技术不足，提出一种sers-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法。本发明利用适配体补链(fe3o
4 nps/capt捕获探针)和待检测目标物啶虫脒能够特异性竞争结合适配体(4-teae/au nps/apt纳米探针)的反应体系，通过检测4-teae/au nps的sers特征峰信号强度来间接检测啶虫脒浓度。本发明所用拉曼报告分子4-teae在1998cm-1
处的拉曼峰与食品基质、传统rrs完全不重叠，从而避免了拉曼干扰，提高了检测结果的准确性。
6.本发明的技术方案是：一种sers-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法，包括如下步骤：
7.1)制备纳米探针4-teae/au nps/apt分散液
8.利用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子(au nps)分散液，再加入4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯胺(4-teae)水溶液共孵育；离心，将沉淀分散在pbs缓冲液中，获得4-teae/au nps分散液；然后将4-teae/au nps分散液与巯基修饰的啶虫脒适配体apt溶液共孵育3-5h，离心，沉淀采用pbs缓冲液重新分散，获得纳米探针4-teae/au nps/apt分散液；
[0009]
2)制备捕获探针fe3o
4 nps/capt分散液
[0010]
采用共沉淀法制备fe3o
4 nps悬浮液，将fe3o
4 nps悬浮液、水和含edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)羰基二酰亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)的混合溶液混合，室温反应，磁分离，用pbs缓冲液重新分散获得羧基保护的mnps分散液；然后加入含有啶虫脒适配体补链capt的溶液共孵育0.5-1h，磁分离，用pbs缓冲液重新分散，获得捕获探针fe3o
4 nps/capt分散液；
[0011]
3)检测
[0012]
将步骤1)制备的纳米探针4-teae/au nps/apt分散液和步骤2)制备的捕获探针fe3o4nps/capt分散液混合；将待检样品加入上述混合液中进行反应，反应完后利用外部磁铁分离，再利用拉曼光谱光谱仪检测4-teae/au nps的特征峰信号强度，进而获得啶虫脒浓度检测结果。
[0013]
进一步的，上述巯基修饰的啶虫脒适配体(apt)，其序列如下所示：
[0014]5′‑
sh-ctgacaccatattatgaaga-3
′
；
[0015]
进一步的，上述啶虫脒适配体补链为capt，序列如下：
[0016]5’‑
nh
2-tcttcataatatggtgtcag-3
′
。
[0017]
进一步的，使用拉曼光谱仪测量在1998cm-1
处的拉曼强度。
[0018]
进一步的，apt与capt的浓度均为200-400nm(最佳300nm)，纳米探针4-teae/au nps/apt分散液和步骤2)制备的捕获探针fe3o
4 nps/capt分散液按照体积比1-1.5:1的比例混合。
[0019]
进一步的，所述pbs缓冲液的ph值为7。
[0020]
进一步的，步骤3)的反应ph为ph＝7，反应时间为≥25min。
[0021]
有益效果：
[0022]
1、本发明选用4-teae/au nps/apt与fe3o
4 nps/capt作sers探针，4-teae作为抗干扰拉曼报告分子，其在1998cm-1
处的拉曼峰与食品基质(葡萄)和传统rrs(罗丹明6g、4-巯基吡啶、2'2-联吡啶和tmb)完全不重叠，提高了检测的准确性和灵敏度。
[0023]
2、本发明利用适配体补链和啶虫脒能够特异性竞争结合适配体的反应体系，提高了抗干扰sers技术检测啶虫脒的选择性及其在真实样品中的应用潜力。
附图说明
[0024]
图1为合成纳米探针中4-teae的最佳浓度；
[0025]
图2为适配体apt的最佳浓度；
[0026]
图3为适配体capt的最佳浓度；
[0027]
图4为啶虫脒、捕获探针与纳米探针竞争反应最佳反应时间；
[0028]
图5为啶虫脒、捕获探针与纳米探针竞争反应最佳反应ph；
[0029]
图6为拉曼报告分子(4-teae)在1998cm-1
处的拉曼峰和传统rrs(罗丹明6g、4-巯基
吡啶、2'2-联吡啶和tmb)的比较；
[0030]
图7为拉曼报告分子(4-teae)在1998cm-1
处的拉曼峰与食品基质(葡萄)的比较；
[0031]
图8为sers检测啶虫脒的标准曲线；
[0032]
图9为sers特异性分析。
具体实施方式
[0033]
为了使本技术领域人员更好地理解本技术中的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。
[0034]
实施例1：利用sers技术抗干扰检测啶虫脒
[0035]
巯基修饰的啶虫脒适配体(apt)，其序列如下所示：
[0036]5′‑
sh-ctgacaccatattatgaaga-3
′
；
[0037]
啶虫脒适配体补链为capt，序列如下：
[0038]5’‑
nh
2-tcttcataatatggtgtcag-3
′
。
[0039]
拉曼光谱仪：ocean insight qepro便携式拉曼光谱仪；激光拉曼光谱仪测定条件：激光波长785nm，激光强度380mv，扫描范围2800～0cm-1
，积分时间1s，积分5次，每个样品重复扫描3次。
[0040]
一、实验步骤
[0041]
1、合成纳米探针4-teae/au nps/apt
[0042]
(1)金纳米粒子(au nps)分散液制备
[0043]
首先，采用柠檬酸钠还原法制备了金纳米粒子(au nps)分散液，具体为：用加热套加热100ml超纯水至沸腾，然后加入1ml 0.01g/ml柠檬酸三钠溶液并加入转子并在590rpm下涡旋。1分钟后，向沸腾溶液加入0.1ml(0.1g/ml)的氯金酸溶液，沸腾液体的颜色迅速从无色变为透明的酒红色。待颜色稳定不再变化后，停止加热，继续搅拌20min，自然冷却至室温后获得au nps分散液，在4℃下储存供进一步使用。
[0044]
(2)4-teae/au nps分散液制备
[0045]
将步骤(1)制备的au nps分散液10ml加入0.5ml浓度为1mm的4-[三甲基硅基]乙基苯胺(4-teae)水溶液，在涡旋振荡器中震荡孵育1h，6000rpm下离心15分钟，收集沉淀，用超纯水清洗3次，沉淀分散在5ml pbs缓冲液(ph＝7)中，获得4-teae/au nps分散液；
[0046]
(3)啶虫脒适配体溶液的准备
[0047]
啶虫脒配体(apt)用edta(0.5m)溶液溶解至100μm，再用pbs缓冲液(ph＝7)稀释至10μm进一步使用。
[0048]
(4)纳米探针4-teae/au nps/apt溶液制备
[0049]
步骤(2)制备的4-teae/au nps分散液1ml与步骤(3)制备的浓度为10μm的巯基修饰啶虫脒适配体溶液20μl，在室温下震荡共孵育4h，在6000rpm下离心15min，收集沉淀，用超纯水洗涤3次，再充分分散于pbs缓冲液(ph＝7)中，获得纳米探针4-teae/au nps/apt分散液，以4℃的温度保存在冰箱中待用。
[0050]
2、捕获探针fe3o
4 nps/capt的制备
[0051]
capt固定在fe3o
4 nps表面，制备捕获探针，具体为：
[0052]
(1)fe3o
4 nps悬浮液的制备
[0053]
采用共沉淀法制备，将5.2g fecl3·
6h2o、2.0g fecl2·
4h2o、0.85ml hcl(12mol/l)溶解在25ml用氮气脱气的去离子水中。然后，在剧烈搅拌和氮气保护下，将所得溶液滴加到250ml的1.5mol/l naoh溶液中。反应结束后，通过外部磁铁从反应介质中分离得到沉淀物，用200ml去离子水洗涤5次，然后重悬于220ml去离子水中，产生的fe3o
4 nps悬浮液的浓度估计为10mg/ml。
[0054]
(2)制备羧基保护的fe3o
4 nps分散液
[0055]
将100μl fe3o
4 nps悬浮液(10mg/ml)与10ml超纯水混合，并加入200μl edc(16mm)和nhs(4mm)的混合溶液以保护fe3o
4 nps表面的羧基。室温孵育30min后，用磁铁分离，用超纯水洗涤3次，然后用pbs缓冲液(ph＝7)重新分散至10ml即可获得羧基保护的fe3o4nps分散液。
[0056]
(3)capt(10μm)溶液的准备
[0057]
啶虫脒适配体补链(capt)用edta(0.5m)溶液溶解至100μm，再用pbs缓冲液(ph＝7)稀释至10μm进一步使用。
[0058]
(4)制备捕获探针fe3o
4 nps/capt分散液
[0059]
将0.2ml capt(10μm)溶液加入到羧基保护的fe3o
4 nps分散液(10ml)中，继续振荡共孵育1h，制备捕获探针，经过磁选和洗涤多余的capt后，捕获探针用pbs缓冲液(ph＝7)重新分散并储存在4℃下供后续使用。
[0060]
3、拉曼光谱检测
[0061]
(1)最佳探针合成工艺选择
[0062]
首先，吸取2、3、4、5、6mm 4-teae溶液10μl与1ml胶体金分散液(上述步骤(1)制备的au nps分散液)混合，室温下涡旋振荡器中连续震荡1h，随后，6000rpm下离心15min，收集沉淀，并用超纯水复溶至1ml，并加入到透明小瓶中进行拉曼检测。对比各个浓度下三次平行实验的4-teae/au nps在1998cm-1
处的拉曼强度的统计结果。结果如图1所示，50μm是纳米探针中4-teae的最佳浓度。
[0063]
为了研究适配体浓度对纳米性能的影响，将适配体初始浓度为100、200、300、400、500nm的0.5ml纳米探针与捕获探针等体积混合，并用外磁体分离。用纯水复溶至1ml的复合探针分散液通过拉曼光谱仪检测在1998cm-1
处的拉曼强度，统计不同适配体初始浓度(100～500nm)间的3个平行的拉曼强度并比较。同理，含有不同capt初始浓度的捕获探针在相同条件下进行比较(比较时，capt和apt浓度分别固定为200nm)。结果如图2、3所示，apt与capt的最佳浓度分均为300nm。
[0064]
(2)啶虫脒、捕获探针与纳米探针竞争反应最佳条件选择
[0065]
为了获得最佳竞争反应时间，设定一系列反应时间(10、15、20、25、30min)并将0.5ml纳米探针、0.5ml捕获探针和20μl啶虫脒混合来确定最佳反应时间；比较时，上述两种分散液中capt和apt浓度分别固定为200nm，竞争反应ph固定为ph＝7。各个时间的竞争反应重复三次，每次反应时间结束后进行外部磁铁分离，用超纯水清洗两遍后复溶至1ml并用拉曼光谱仪检测。统计每个反应时间的三次平行实验在1998cm-1
处的拉曼强度并进行对比。结果如图4所示，最佳反应时间为25分钟，时间继续延长对其影响不大。
[0066]
最佳反应ph是竞争反应的另一个影响适体传感器灵敏度的关键因素。为此，设定
一系列反应ph(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)并在该ph下将0.5ml纳米探针、0.5ml捕获探针和20ml啶虫脒混合来确定最佳反应ph；比较时，上述两种分散液中capt和apt浓度分别固定为200nm，竞争反应时间固定为1小时。各个ph的竞争反应重复三次，反应结束后进行外部磁铁分离，用超纯水清洗两遍后复溶至1ml并用拉曼光谱仪检测。统计每个反应ph的三次平行实验在1998cm-1
处的拉曼强度并进行对比。结果如图5所示，最佳反应ph为ph＝7，ph对竞争反应影响较大。
[0067]
此外，将拉曼报告分子(4-teae)在1998cm-1
处的拉曼峰分别与食品基质(巨峰葡萄)和传统rrs(罗丹明6g、4-巯基吡啶、2'2-联吡啶和tmb)进行比较。结果分别如图6、7所示，所用拉曼报告分子(4-teae)在1998cm-1
处的拉曼峰与食品基质(葡萄)和传统rrs(罗丹明6g、4-巯基吡啶、2'2-联吡啶和tmb)完全不重叠。
[0068]
二、方法学验证
[0069]
1、线性
[0070]
将制备好的500μl au nps/4-teae/apt纳米分散液和500μl fe3o
4 nps/capt分散液混合15min，上述两种分散液中，capt和apt浓度分别为300nm；然后在混合液中加入20μl不同浓度(0.1、1、5、10、20、30、40nm)的啶虫脒溶液，振荡孵育1小时，完全反应。最后，通过磁选除去未与捕获探针结合的sers探针，并用纯水洗涤，剩余的探针悬浮在1ml纯水中，使用拉曼光谱仪测量其在1998cm-1
处的拉曼强度。每个啶虫脒浓度重复测定3次，记录拉曼强度变化，制作标准曲线。结果表明，该方法在0.1-40nm之间具有良好的线性范围和检测灵敏度，如图8所示。线性回归方程y＝2152.14-46.73x，线性相关系数为0.991，检测灵敏度为0.03nm。
[0071]
2、方法可行性
[0072]
为了验证适配体传感器的实用性，通过网购购买了葡萄(品种：巨峰)作为真实的食品样品进行了测试。1ml真实样品(葡萄清洗后去梗打浆)分别加入1nm、5nm和10nm的啶虫脒作为待测溶液。将20μl待测溶液引入适体传感器系统中完成检测。由表1可知，加药样品的回收率在89.2～95.4％之间，相对标准偏差(rsd)小于8％。这些结果表明，本发明的方法能够检测真实样本中的啶虫脒，真实样本的干扰可以忽略不计。
[0073]
表1抗干扰检测技术对加标葡萄样品中啶虫脒检测结果(n＝3)
[0074][0075]
3、方法的识别特异性
[0076]
选择杀虫剂唑苯腈(azoxynil)、甲基恶唑啉(thiamethoxaline)、环氧苯丙胺(cymoxanil)、氰唑咪胺(cyazofamid)和氟虫腈(fipronil)来验证方法特异性。在相同的条
件下，分别对300nm的唑苯腈、甲基恶唑啉、环氧苯丙胺、氰唑咪胺和氟虫腈和30nm的啶虫脒(acetamiprid)以及各毒素的混合进行检测。重复测定3次，比较1998cm-1
处的表面增强拉曼散射强度。结果表明(图9)，基于sers的抗干扰检测方法对啶虫脒检测具有较高的特异性。
[0077]
实施例2：样品检测
[0078]
1、建立sers技术
[0079]
按照实施例1所述的方法制备纳米探针au nps/4-teae/apt分散液、合成捕获探针fe3o4nps/capt分散液，上述两种分散液中，capt和apt浓度分别为300nm。
[0080]
2、建立回归方程
[0081]
将制备好的500μl au nps-4/teae/apt溶液和500μl fe3o
4 nps/capt溶液混合15min。然后在混合液中加入20μl不同浓度(0.1、1、5、10、20、30、40nm)的啶虫脒溶液，振荡孵育1小时，完全反应。最后，通过磁选除去未与捕获探针结合的sers探针，并用纯水洗涤，剩余的探针悬浮在1ml纯水中，使用拉曼光谱仪测量其在1998cm-1
处的拉曼强度。每个啶虫脒浓度重复测定3次，记录拉曼强度变化，制作标准曲线。
[0082]
3、样品检测
[0083]
网购购买了葡萄(品种分别为：巨峰、红珍珠、巨峰、红提、夏黑)作为真实的食品样品，取50μl真实样品用于sers检测。每个样品水平重复3次。
[0084]
4、检测结果
[0085]
检测结果如表2所示，其中啶虫脒检测含量最高为3.73nm，低于检测标准。
[0086]
表2基于sers技术对六个不同葡萄样品中啶虫脒检测结果(n＝3)
[0087][0088][0089]
“–”
低于检测限。

技术特征：
1.一种sers-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法，其特征是，包括如下步骤：1)制备纳米探针4-teae/au nps/apt分散液利用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子au nps分散液，再加入4-teae水溶液共孵育；离心，将沉淀分散在pbs缓冲液中，获得4-teae/au nps分散液；然后将4-teae/au nps分散液与巯基修饰的啶虫脒适配体apt溶液共孵育3-5h，离心，沉淀采用pbs缓冲液重新分散，获得纳米探针4-teae/au nps/apt分散液；2)制备捕获探针fe3o
4 nps/capt分散液采用共沉淀法制备fe3o
4 nps悬浮液，将fe3o
4 nps悬浮液、水和含edc和nhs的混合溶液混合，室温反应，磁分离，用pbs缓冲液重新分散获得羧基保护的mnps分散液；然后加入含有啶虫脒适配体补链capt的溶液共孵育0.5-1h，磁分离，用pbs缓冲液重新分散，获得捕获探针fe3o
4 nps/capt分散液；3)检测将步骤1)制备的纳米探针4-teae/au nps/apt分散液和步骤2)制备的捕获探针fe3o4nps/capt分散液混合；将待检样品加入上述混合液中进行反应，反应完后利用外部磁铁分离，再利用拉曼光谱光谱仪检测4-teae/au nps的特征峰信号强度，进而获得啶虫脒浓度检测结果。2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述巯基修饰的啶虫脒适配体apt，其序列如下：5
′‑
sh-ctgacaccatattatgaaga-3
′
；所述啶虫脒适配体补链capt，其序列如下：5
’‑
nh
2-tcttcataatatggtgtcag-3
′
。3.如权利要求1所述的方法，其特征是，使用拉曼光谱仪测量在1998cm-1
处的拉曼强度。4.如权利要求1所述的方法，其特征是，合成纳米探针4-teae/au nps/apt分散液所需apt与捕获探针fe3o
4 nps/capt分散液所需capt的浓度均为200-400nm。5.如权利要求4述的方法，其特征是，合成纳米探针4-teae/au nps/apt分散液所需apt与捕获探针fe3o
4 nps/capt分散液所需capt的浓度均为300nm。6.如权利要求4述的方法，其特征是，所述纳米探针4-teae/au nps/apt分散液和捕获探针fe3o
4 nps/capt分散液按照体积比1-1.5:1的比例混合。7.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述3)的反应ph为ph＝7，反应时间为≥25min。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征是，所述pbs缓冲液为ph＝7的pbs缓冲液。

技术总结
本发明公开了一种SERS-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法。本发明利用适配体补链(Fe3O4NPs/cApt捕获探针)和待检测目标物啶虫脒能够特异性竞争结合适配体(4-TEAE/Au NPs/Apt纳米探针)的反应体系，通过检测4-TEAE/Au NPs的SERS特征峰信号强度来间接检测啶虫脒浓度。本发明所用拉曼报告分子4-TEAE在1998cm-1


技术研发人员：颜朦朦 王浩 朱超 秦宏伟 张文君 毛江胜 杜红霞
受保护的技术使用者：山东省农业科学院
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/9/6