重组GAS6蛋白在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用的制作方法

重组gas6蛋白在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及重组gas6蛋白在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用。


背景技术：

2.缺血性心脏病主要是由于心脏供血不足所引起。随着皮冠状动脉介入治疗(pci)和冠状动脉旁路移植术(cabg)的发展，缺血性心肌病的死亡率大大减少，但这两种方法也导致了心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血再灌注损伤是指由于血流恢复而发生的心肌损伤，除了缺血本身之外，可能占最终心肌梗死大小的50％。有很多进程会导致心肌功能障碍，包括心肌坏死、心肌休克、再灌注心律失常、微血管功能障碍、致命再灌注损伤。
3.在心肌缺血再灌注损伤期间，氧化应激增加、炎症反应和自噬受损。虽然目前有一些应对策略，例如抑制免疫反应和控制血压等，但心肌缺血再灌注损伤的死亡率仍然很高，目前仍没有较好的治疗方法。
4.gas6是一类生长因子，属于维生素k依赖性蛋白。其广泛的表达于人体各种细胞，并作用于细胞受体如mer，sky，axl，发挥着重要的生物学作用。gas6可以作用于表达在巨噬细胞的mer受体，进而介导巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用。gas6还可以调节巨噬细胞的成熟与迁移，促进内皮细胞的生长。
5.基于此，提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明首先涉及重组血浆生长停滞特异性蛋白6(rgas6)在制备治疗心肌缺血再灌注损伤(i/r)的药物或治疗剂中的应用，所述的重组血浆生长停滞特异性蛋白6(rgas6)氨基酸序列如seq id no.1所示
7.seq id no.1：
8.mppppgpaaalgtallllllasesshtvllrareaaqflrprqrrayqvfeeakqghlerecveevcskeearevfendpeteyfypryqecmrkygrpeeknpdfakcvqnlpdqctpnpcdkkgthicqdlmgnffcvctdgwggrlcdkdvnecvqknggcsqvchnkpgsfqcachsgfslasdgqtcqdidectdsdtcgdarcknlpgsysclcdegytysskektcqdvdecqqdrceqtcvnspgsytchcdgrgglklspdmdtcedilpcvpfsmaksvkslylgrmfsgtpvirlrfkrlqptrllaefdfrtfdpegvlffaggrsdstwivlglragrlelqlryngvgritssgptinhgmwqtisveelernlvikvnkdavmkiavagelfqlerglyhlnltvggipfkeselvqpinprldgcmrswnwlngedsaiqetvkantkmqcfsvtergsffpgngfatyrlnytrtsldvgtettwevkvvarirpatdtgvllalvgdddvvpisvalvdyhstkklkkqlvvlavedvalalmeikvcdsqehtvtvslregeatlevdgtkgqsevstaqlqerldtlkthlqgsvhtyvgglpevsvisapvtafyrgcmtlevngkildldtasykhsditshscppvehatp。
9.进一步的，所述的药物或治疗剂为静脉给药型制剂。
10.进一步的，所述的药物或治疗剂应用于发生心肌缺血再灌注损伤的患者，给药方式优选为静脉注射给药或直接心内注射。
11.进一步的，所述的药物或治疗剂中包含，治疗有效量的重组血浆生长停滞特异性蛋白6，以及必要的药用辅料。
12.本发明的有益效果在于，
13.发明人通过使用动物模型探究心肌缺血再灌注损伤的病理机制，发现静脉注射rgas6可以缓解心肌损伤，增强血管新生并改善心功能，能够显著心肌缺血再灌注损伤的病理情况。
附图说明
14.如下附图展示了重组血浆生长停滞特异性蛋白6(rgas6)对小鼠模型的i/r损伤的治疗效果
15.图1、rgas6给药后小鼠血浆gas6水平；
16.图2、rgas6给药后增加心脏中mertk巨噬细胞；
17.图3、rgas6改善i/r损伤的心功能；
18.图4、rgas6减轻i/r损伤后心脏纤维化；
19.图5、流式细胞仪测试rgas6增强i/r损伤后血管新生效果；
20.图6、免疫荧光染色测试rgas6增强i/r损伤后血管新生效果。
具体实施方式
21.实验动物、试剂及试剂盒、仪器
22.ir小鼠模型(心肌缺血再灌注损伤模型)：10-12周龄雄性c57bl/6小鼠购自viewsolid biotech(编号：vsm10001)。所有动物均在无病原体条件下饲养，并允许随意获取食物和水。房间保持在温度(20-25℃)、湿度(30-70％)和光暴露周期(12小时明暗周期)的受控范围内。所有涉及动物的实验均根据《实验动物使用和护理指南》进行，并经首都医科大学北京安贞医院动物受试者委员会批准。
23.生化试剂及试剂盒名称及供应商见下表
[0024][0025]
实验仪器设备名称及供应商见下表
[0026][0027][0028]
实施例1、心肌缺血再灌注损伤模型的构建
[0029]
10-12周龄雄性c57bl/6小鼠分别用2-3％异氟烷吸入麻醉。通过左侧的第三个肋间隙进入心脏，用6-0丝缝线在左冠状动脉(lad)从其起点起2-3mm的下行分支上打上一个丝结。通过心电图(st段抬高)和心肌颜色的变化证实了缺血。缺血30min后，释放活结以达到再灌注。假手术小鼠进行同样的手术，不进行lad结扎。
[0030]
实施例2、注射rgas6对心肌缺血再灌注损伤的治疗效果
[0031]
使用如实施例1所述的i/r小鼠模型。
[0032]
将12只c57bl/6小鼠随机分为两组：
[0033]
一组为对照组(n＝6)：静脉注射生理盐水，隔天一次
[0034]
一组为rgas6治疗组(n＝6)：静脉注射rgas6(40μg/kg)，隔天一次
[0035]
持续1周后检测治疗效果。。
[0036]
给药后，对动物模型治疗效果的检测过程如下：
[0037]
1、小动物超声
[0038]
在i/r模型构建的第1周后，使用小动物超声仪vevo2100高分辨率成像仪器(vevo2100；visual sonics)进行心脏超声数据采集。过程为：
[0039]
首先使用异氟烷气体(10％)麻醉小鼠，之后置于超声金属板上，采用5％的异氟烷维持麻醉状态，使用脱毛膏祛除小鼠胸部毛发，上面涂耦合剂，使用超声探头采集小鼠心脏左室流出道m超，通过心室水平的短轴m超模式扫描获取lvef和其他收缩功能指标；
[0040]
使用脉冲波和组织多普勒成像在二尖瓣水平测量舒张功能，获得麻醉小鼠的心尖四腔视图，在控制体温的条件下采集超声心动图，将异氟烷降至1.0-1.5％，并进行调整以保持心率在400-500次/min范围内。
[0041]
通过分析软件计算左心室舒张末期内径(lvdd)、左心室收缩末期内径(lvds)、舒张末期室间隔厚度(ivsd)、左心室舒张末期后壁厚度(lvpwd)、左心室短轴缩短分数(fs)、左室射血分数(lvef)、舒张早期通过二尖瓣的峰值血流速度(e波)、舒张晚期心房收缩引起的峰值血流速度(a波)、等容舒张时间(ivrt)、二尖瓣环舒张早期心肌舒张速度峰值(e’波)和充盈早期减速时间(edt)。
[0042]
所有参数均至少测量3次，并给出平均值。
[0043]
2、masson三色染色
[0044]
对石蜡切片进行脱蜡再水合。切片用蒸馏水洗涤后，用weigert铁苏木素染色液染色10min，然后在自来水下冲洗10min。切片用丽春红酸性复红溶液染色5-10min，用蒸馏水洗涤，在磷钼酸-磷钨酸溶液中分化10-15min或直到胶原不再出现红色。接下来，将切片直接转移(不冲洗)到苯胺蓝溶液中，染色1-2min，然后在蒸馏水中短暂冲洗，在1％醋酸溶液中分化2-5min。用蒸馏水清洗几次后，切片迅速脱水，清洗，并封片。
[0045]
切片图像采用光学显微镜(尼康eclipse te2000-s)采集。使用imagej软件测量并计算纤维化面积占总面积的平均百分比。
[0046]
3、免疫荧光染色
[0047]
心脏组织在室温下用10％福尔马林固定，石蜡包埋，并以4mm的厚度连续切片。心脏切片随后进行脱蜡后再水合以进行免疫荧光检测。抗原提取在柠檬酸缓冲液(ph 6.0)或edta缓冲液(ph 9.0)中进行，使用800w微波，100％功率，持续15min。用预冷的甲醇固定细胞10min，以5min间隔用pbs洗涤2次，然后在室温下用0.1％ triton x-100渗透10min。切片和细胞用5％ bsa/pbs阻断60min，在4℃下用3％ bsa/pbs一抗，即抗cd31(anti-cd31抗体，abcam，ab222783；1：100)。接下来，偶联到alexafluor488(a-11001，1：500)或alexafluor555(a-21422，a-31572；1：500)的二抗与染色切片和细胞在1％ bsa/pbs中室温孵育1小时。细胞核用dapi(abcam，ab104139)染色。
[0048]
所有免疫荧光图像均采用徕卡st5激光扫描共聚焦显微镜拍摄。
[0049]
4、流式细胞分析
[0050]
用15毫升含有25u/ml肝素钠盐的预冷生理盐水灌注心脏5分钟，然后在ir后收集并分离出左心室组织，用手术剪刀剪碎，并在37℃下用含有胶原酶ii(200u/ml，
thermofisher，17101015)和分散酶ii(1u/ml，roche，04942078001)的酶消化液处理30分钟。收集细胞并过滤(40μm)以产生单细胞悬浮液。用含有0.04％bsa的pbs清洗悬浮液。然后将细胞与荧光标记的抗小鼠抗体(抗cd31(anti-cd31抗体，bd，561073；1：100)与抗pdgfra(anti-pdgfra抗体，cst，3174；1：100)抗体)在4℃孵育40分钟，上机检测。
[0051]
结果显示，rgas6治疗组小鼠较对照组小鼠的表型显著改善(包括心功能，血管新生，左室纤维化)。
[0052]
具体的(如图所示)，与对照组相比，
[0053]
(1)rgas6治疗组小鼠的血浆gas6水平明显高于对照组(图1)。
[0054]
(2)rgas6治疗组小鼠中mertk心脏巨噬细胞的数量在i/r后1天有所增加(图2)。
[0055]
(3)心脏超声结果显示rgas6治疗组小鼠左室射血分数(lvef)显著增高，表明心功能明显增强(图3)。
[0056]
(4)masson三色染色显示rgas6治疗组小鼠左室纤维化(图中浅色框出的区域)面积显著低于对照组小鼠(图4)。
[0057]
(5)利用免疫荧光染色标记内皮细胞的特征基因cd31，流式细胞分析(图5，心脏内皮细胞为高表达cd31，低表达pdgfra的细胞，数量显著增加)和免疫荧光染色(图6，dapi标记细胞核，同时标记cd31)显示rgas6治疗组小鼠较对照组小鼠血管新生明显增加。
[0058]
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，不用于对本发明保护范围的限定。

技术特征：
1.重组血浆生长停滞特异性蛋白6(rgas6)在制备治疗心肌缺血再灌注损伤(i/r)的药物或治疗剂中的应用，所述的重组血浆生长停滞特异性蛋白6(rgas6)的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物或治疗剂为静脉给药型制剂。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物或治疗剂中包含，治疗有效量的重组血浆生长停滞特异性蛋白6(rgas6)，以及必要的药用辅料。

技术总结
本发明涉及涉及重组GAS6蛋白在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用，具体的，使用重组血浆生长停滞特异性蛋白6(rGAS6)制备治疗心肌缺血再灌注损伤(I/R)的药物或治疗剂，所述的药物或治疗剂为静脉给药型制剂。药物或治疗剂为静脉给药型制剂。药物或治疗剂为静脉给药型制剂。


技术研发人员：李玉琳 邵怡辉
受保护的技术使用者：北京市心肺血管疾病研究所
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/9/6