一种基于CRISPR的病毒快速检测识别系统及方法

一种基于crispr的病毒快速检测识别系统及方法
技术领域
1.本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种基于crispr的病毒快速检测识别系统及方法。


背景技术：

2.本部分的描述仅提供与本发明公开相关的背景信息，而不构成现有技术。
3.聚合酶链式反应(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点是能将微量的dna大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的dna，就能用pcr加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易dna扩增法，意味着pcr技术的真正诞生。到如今2013年，pcr已发展到第三代技术。1976年，中国科学家钱嘉韵，发现了稳定的taq dna聚合酶，为pcr技术发展也做出了基础性贡献。
4.pcr是利用dna在体外摄氏95
°
高温时变性会变成单链，低温(经常是60
°
c左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度(72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
5.pcr技术的基本原理类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
①
模板dna的变性：模板dna经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②
模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；
③
引物的延伸：dna模板-引物结合物在72℃、dna聚合酶(如taqdna聚合酶)的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2.6.相关文献：
7.[1]刘荭.聚合酶链式反应和基因芯片技术的研究及在主要水生动物病毒检疫和监测中的应用[d].华中农业大学,2004.
[0008]
[2]王晓囡.多重聚合酶链式反应技术研究和应用[d].苏州大学,2018.
[0009]
现有技术中的pcr检测仪器存在如下缺陷：
[0010]
1、由于常规的pcr检测仪器只是一种温度控制和检测系统，对于各种引物和裂解液等的加注需要专业人员完成，造成pcr检测仪器只能适用于专业检测实验室中；
[0011]
2、整个pcr检测仪器体积较大，且完整检测流程需要1.5～2小时以上。
[0012]
应该注意，上面对技术背景的介绍只是为了方便对本发明的技术方案进行清楚、
完整的说明，并方便本领域技术人员的理解而阐述的。不能仅仅因为这些方案在本发明的背景技术部分进行了阐述而认为上述技术方案为本领域技术人员所公知。


技术实现要素：

[0013]
本发明要解决的技术问题是提供一种基于crispr的病毒快速检测识别系统及方法。
[0014]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于crispr的病毒快速检测识别系统，其特征在于，所述的系统包括，外壳、设置在外壳内的用于盛装扩增液的扩增液注射装置及用于盛装crispr反应液的crispr反应液注射装置；设置在外壳内的水浴锅、放置在所述的水浴锅内的反应容器、用于控制水浴锅温度的温控系统，所述的反应容器用于盛放裂解液；荧光检测模块，所述的荧光检测模块包括荧光激发装置及荧光检测装置，所述的扩增液注射装置及crispr反应液注射装置分别通过管道连通至反应容器。
[0015]
优选地，所述的系统还包括控制模块，所述的控制模块用于控制所述的温控系统将水浴锅加热至裂解温度t1，保持时间t1,裂解过程结束；控制温控系统将水浴锅温度降低至扩增温度t2，控制所述的扩增液注射装置将扩增液打入反应容器中进行扩增反应，保持温度t2时间t2；控制所述的温控系统将水浴锅温度降至检测温度t3，控制所述的crispr反应液注射装置将crispr反应液打入反应容器中，crispr反应液中荧光探针和反应容器中的dna片断结合并生成荧光基团，控制所述的荧光激发装置向反应容器内的液体发射蓝色荧光激发光，当所述的荧光检测装置检测到的绿色荧光光强达到预设值时，则确定检测样品中含有特定dna片段。
[0016]
优选地，所述的系统还包括用于控制所述的扩增液注射装置向反应容器中注射液体的第一直线电机及用于控制crispr反应液注射装置向反应容器中注射液体的第二直线电机。
[0017]
优选地，所述的扩增液注射装置及crispr反应液注射装置为注射针筒，所述的扩增液和crispr反应液盛放在针筒中，所述的注射针筒包括推杆，所述的第一直线电机和第二直线电机分别用于驱动所述的扩增液注射装置及crispr反应液注射装置的推杆，以将注射针筒中的液体推出。
[0018]
优选地，所述的系统还包括设置在外壳内的第一针筒锁紧机构及第二针筒锁紧机构，所述的第一针筒锁紧机构用于固定所述的扩增液注射装置，所述的第二针筒锁紧机构用于固定所述的crispr反应液注射装置。
[0019]
优选地，所述的系统还包括触摸显示屏，所述的触摸显示屏用于输入裂解温度、裂解持续时间、扩增温度、扩增持续时间、检测温度、检测持续时间，并且具有开启实验和暂停实验按钮，所述的触摸显示屏还用于显示当前水浴锅温度、当前阶段持续时间，当前所在工作状态，检测荧光背景值、当前值及检测结果。
[0020]
优选地，所述的系统还包括蓝牙模块，所述的蓝牙模块用于将检测结果上传至云端服务器。
[0021]
本技术还提供一种基于crispr的病毒快速检测识别方法，所述的方法使用权利要求1～7任意一项所述的系统实现，所述的方法包括如下步骤，
[0022]
(一)温控系统将水浴锅加热至裂解温度t1，保持时间t1,裂解过程结束；
[0023]
(二)温控系统将水浴锅温度降低至扩增温度t2，所述的扩增液注射装置将扩增液打入反应容器中进行扩增反应，保持温度t2时间t2；
[0024]
(三)温控系统将水浴锅温度降至检测温度t3，所述的crispr反应液注射装置将crispr反应液打入反应容器中，crispr反应液中荧光探针和反应容器中的dna片断结合并生成荧光基团，所述的荧光激发装置向反应容器内的液体发射蓝色荧光激发光，当所述的荧光检测装置检测到的绿色荧光光强达到预设值时，则确定检测样品中含有特定dna片段。
[0025]
优选地，在步骤(一)中，所述的裂解温度t1为95℃，温控精度0.3℃；
[0026]
在步骤(二)中，所述的扩增温度t2为42℃，温控精度0.1℃；
[0027]
在步骤(三)中，所述的检测温度t3为37℃，所述的荧光激发装置，每500ms向反应容器内的液体发射蓝色荧光激发光。
[0028]
优选地，所述的方法还包括，将检测结果显示在触摸显示屏中，并通过蓝牙模块上传至云端服务器。
[0029]
借由以上的技术方案，本发明的有益效果如下：
[0030]
本发明的基于crispr的病毒快速检测识别系统及方法，可以方便快捷的进行各种病毒样本的核酸检测，仪器操作简单，检测过程可以全自动完成，不必专业人员参与，可以应用于街道、家庭等场景，并服务于快速核酸检测任务。检测人员可以在完成病毒样本的采样后，直接将样本放置在系统检测位置，识别系统全自动完成核酸变性(裂解)，退火，延伸(扩增)反应，并自动对反应完成后的产物进行结果检测并记录、显示的仪器系统，整个检测过程在30分钟内完成。
附图说明
[0031]
图1是本技术的病毒快速检测识别系统的原理设计图。
[0032]
图2是本技术的病毒快速检测识别系统的检测仪的结构示意图。
[0033]
图3是本技术的病毒快速检测识别系统的检测仪的内部结构示意图。
[0034]
其中：1、触摸显示屏；2、门；3、外壳；4、第一直线电机；5、第二直线电机；6、扩增液注射装置；7、crispr反应液注射装置；8、第一针筒锁紧机构；9、第二针筒锁紧机构；10、蓝牙模块；11、反应容器；12、水浴锅；13、液路沟槽。
具体实施方式
[0035]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036]
需要说明的是，在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的和区别类似的对象，两者之间并不存在先后顺序，也不能理解为指示或暗示相对重要性。此外，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0037]
如图所示，本发明提供了一种基于crispr的病毒快速检测识别系统，包括，外壳3、设置在外壳3内的用于盛装扩增液的扩增液注射装置6及用于盛装crispr反应液的crispr反应液注射装置7；设置在外壳3内的水浴锅12、放置在所述的水浴锅12内的反应容器11、用
于控制水浴锅12温度的温控系统，所述的反应容器11用于盛放裂解液；荧光检测模块，所述的荧光检测模块包括荧光激发装置及荧光检测装置。在一种优选的实施方式中，荧光激发装置为蓝光led，使用485nm蓝光激发样品中荧光基团后，使用荧光检测装置接收基团受激发辐射的荧光，光电二极管的电压变化被控制模块检测到后，作为实验结果显示到触摸屏中。
[0038]
所述的扩增液注射装置6及crispr反应液注射装置7分别通过管道连通至反应容器11。
[0039]
水浴锅12可以用铝制材料制成，中间可以放置500ul的pcr管作为反应容器11。荧光检测模块放置在水浴锅12的底部。温控系统包括分别设置在水浴锅12两侧的2个15瓦加热片和2个12瓦半导体制冷器、位于水浴锅12顶部的1个15瓦加热片及设于水浴锅12内部的温度传感器。
[0040]
所述的系统还包括控制模块，控制模块主要由控制电路板组成，使用arduino mega 2560型号控制板。
[0041]
所述的控制模块用于控制所述的温控系统将水浴锅12加热至裂解温度t1，保持时间t1,裂解过程结束；控制温控系统将水浴锅12温度降低至扩增温度t2，控制所述的扩增液注射装置6将扩增液打入反应容器11中进行扩增反应，保持温度t2时间t2；控制所述的温控系统将水浴锅12温度降至检测温度t3，控制所述的crispr反应液注射装置7将crispr反应液打入反应容器11中，crispr反应液中荧光探针和反应容器11中的dna片断结合并生成荧光基团，控制所述的荧光激发装置向反应容器11内的液体发射蓝色荧光激发光，荧光基团逐步受激发增强，说明阳性样品中目标rna和荧光蛋白质基团结合，并被特定荧光激发光激发，从而激发出荧光。
[0042]
所述的系统还包括用于控制所述的扩增液注射装置6向反应容器11中注射液体的第一直线电机4及用于控制crispr反应液注射装置7向反应容器11中注射液体的第二直线电机5。在一种优选的实施方式中，所述的扩增液注射装置6及crispr反应液注射装置7为注射针筒，所述的扩增液和crispr反应液盛放在针筒中，所述的注射针筒包括推杆，所述的第一直线电机4和第二直线电机5分别用于驱动所述的扩增液注射装置6及crispr反应液注射装置7的推杆，以将注射针筒中的液体推出。所述的第一直线电机4和第二直线电机5由控制模块控制，将扩增液注射装置6及crispr反应液注射装置7中液体精确的推入至反应容器11中。
[0043]
所述的系统还包括设置在外壳3内的第一针筒锁紧机构8及第二针筒锁紧机构9，所述的第一针筒锁紧机构8用于固定所述的扩增液注射装置6，所述的第二针筒锁紧机构9用于固定所述的crispr反应液注射装置7。
[0044]
所述的系统还包括触摸显示屏1，触摸显示屏1的外部接口通过db15链接器作为供电接口，触摸屏型号为大彩光电dc804809050。所述的触摸显示屏1用于输入裂解温度、裂解持续时间、扩增温度、扩增持续时间、检测温度、检测持续时间，并且具有开启实验和暂停实验按钮，所述的触摸显示屏1还用于显示当前水浴锅12温度、当前阶段持续时间，当前所在工作状态，检测荧光背景值、当前值及检测结果。所述的系统还包括蓝牙模块10，所述的蓝牙模块10用于将检测结果上传至云端服务器，可以直观地对疫情分布进行分析，保障人民群众的健康，为疫情防控提供数据支持。
[0045]
本技术的基于crispr的病毒快速检测识别系统的工作流程如下：
[0046]
扩增液注射针筒预装20ul扩增液，crispr反应液注射针筒预装20ulcrispr反应液，反应液中包括荧光探针，整个液路系统独立包装，液路系统包括crispr反应液注射针筒、扩增液注射针筒、反应容器11。进行检测时可以将液路系统安装到外壳3内，使用针筒锁紧机构锁紧。将待测试样品(鼻试子或咽试子)放入反应容器11中并将样品液与裂解液充分混合。触摸显示屏1会显示裂解温度，裂解时间，扩增温度，扩增时间，检测温度，检测时间等几个输入项，常规检测可以不改动初始值。曲线图可显示荧光检测结果，若为阳性样品荧光检测强度会上升并显示检测结果。同时蓝牙模块10开始自动运行，可以打开手机相应app接收检测系统工作信息，包括位置、检测流程、检测结果等。
[0047]
点击触摸显示屏1上的开始检测”按钮，整个检测流程开始自动进行。
[0048]
第一阶段是裂解升温阶段，温控系统将水浴锅12和反应容器11加热至裂解温度(95℃)，达到裂解温度后进行控温，温控精度0.3℃，保持时间至设置裂解时间后，裂解过程结束；温控系统将水浴锅12温度降低至扩增温度(42℃)，达到扩增温度后，第一直线电机4启动，将扩增液注射装置6中扩增液打入反应容器11，扩增反应开始进行，同时开始保温，温控精度0.1℃；保持扩增温度时间持续至设置时间，时间到达后开始向检测温度(37℃)控温；达到检测温度后，第二直线电机5启动，将crispr反应液注射装置7中crispr反应液打入反应容器11，此时crispr反应液中荧光探针开始和特定dna片断结合并生成荧光基团，同时测试系统荧光检测模块开始工作，每500ms发射蓝色荧光激发光并进行光强检测，当被测试样品中含有目标dna基团时，荧光基团会被蓝色荧光激发光激发并发出绿色荧光，检测绿色荧光光强便可以确定样品中是否含特定dna片断。检测结果被显示在显示屏上并通过蓝牙模块10上传至收集app，由app存储至云端服务器。
[0049]
本发明的基于crispr的病毒快速检测识别系统及方法，可以方便快捷的进行各种病毒样本的核酸检测，仪器操作简单，检测过程可以全自动完成，不必专业人员参与，可以应用于街道、家庭等场景，并服务于快速核酸检测任务。检测人员可以在完成病毒样本的采样后，直接将样本放置在系统检测位置，识别系统全自动完成核酸变性(裂解)，退火，延伸(扩增)反应，并自动对反应完成后的产物进行结果检测并记录、显示的仪器系统，整个检测过程在30分钟内完成。
[0050]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.一种基于crispr的病毒快速检测识别系统，其特征在于，所述的系统包括，外壳、设置在外壳内的用于盛装扩增液的扩增液注射装置及用于盛装crispr反应液的crispr反应液注射装置；设置在外壳内的水浴锅、放置在所述的水浴锅内的反应容器、用于控制水浴锅温度的温控系统，所述的反应容器用于盛放裂解液；荧光检测模块，所述的荧光检测模块包括荧光激发装置及荧光检测装置，所述的扩增液注射装置及crispr反应液注射装置分别通过管道连通至反应容器。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的系统还包括控制模块，所述的控制模块用于控制所述的温控系统将水浴锅加热至裂解温度t1，保持时间t1,裂解过程结束；控制温控系统将水浴锅温度降低至扩增温度t2，控制所述的扩增液注射装置将扩增液打入反应容器中进行扩增反应，保持温度t2时间t2；控制所述的温控系统将水浴锅温度降至检测温度t3，控制所述的crispr反应液注射装置将crispr反应液打入反应容器中，crispr反应液中荧光探针和反应容器中的dna片断结合并生成荧光基团，控制所述的荧光激发装置向反应容器内的液体发射蓝色荧光激发光，当所述的荧光检测装置检测到的荧光基团受激发后发出的绿色荧光的光强达到预设值时，则确定检测样品中含有特定dna片段。3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，所述的系统还包括用于驱动所述的扩增液注射装置向反应容器中注射液体的第一直线电机及用于驱动crispr反应液注射装置向反应容器中注射液体的第二直线电机。4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述的扩增液注射装置及crispr反应液注射装置为注射针筒，所述的扩增液和crispr反应液盛放在针筒中，所述的注射针筒包括推杆，所述的第一直线电机和第二直线电机分别用于驱动所述的扩增液注射装置及crispr反应液注射装置的推杆，以将注射针筒中的液体推出。5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述的系统还包括设置在外壳内的第一针筒锁紧机构及第二针筒锁紧机构，所述的第一针筒锁紧机构用于固定所述的扩增液注射装置，所述的第二针筒锁紧机构用于固定所述的crispr反应液注射装置。6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的系统还包括触摸显示屏，所述的触摸显示屏用于输入裂解温度、裂解持续时间、扩增温度、扩增持续时间、检测温度、检测持续时间，并且具有开启实验和暂停实验按钮，所述的触摸显示屏还用于显示当前水浴锅温度、当前阶段持续时间，当前所在工作状态，检测荧光背景值、当前值及检测结果。7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述的系统还包括蓝牙模块，所述的蓝牙模块用于将检测结果上传至云端服务器。8.一种基于crispr的病毒快速检测识别方法，其特征在于，所述的方法使用权利要求1～7任意一项所述的系统实现，所述的方法包括如下步骤，(一)温控系统将水浴锅加热至裂解温度t1，保持时间t1,裂解过程结束；(二)温控系统将水浴锅温度降低至扩增温度t2，所述的扩增液注射装置将扩增液打入反应容器中进行扩增反应，保持温度t2时间t2；(三)温控系统将水浴锅温度降至检测温度t3，所述的crispr反应液注射装置将crispr反应液打入反应容器中，crispr反应液中荧光探针和反应容器中的dna片断结合并生成荧
光基团，所述的荧光激发装置向反应容器内的液体发射蓝色荧光激发光，当所述的荧光检测装置检测到的荧光基团受激发后发出的绿色荧光光强达到预设值时，则确定检测样品中含有特定dna片段。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，所述的裂解温度t1为95℃，温控精度0.3℃；在步骤(二)中，所述的扩增温度t2为42℃，温控精度0.1℃；在步骤(三)中，所述的检测温度t3为37℃，所述的荧光激发装置，每500ms向反应容器内的液体发射蓝色荧光激发光。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括，将检测结果显示在触摸显示屏中，并通过蓝牙模块上传至云端服务器。

技术总结
本发明公开了一种基于CRISPR的病毒快速检测识别系统及方法，包括，外壳、设置在外壳内的用于盛装扩增液的扩增液注射装置及用于盛装CRISPR反应液的CRISPR反应液注射装置；设置在外壳内的水浴锅、放置在所述的水浴锅内的反应容器、用于控制水浴锅温度的温控系统，所述的反应容器用于盛放裂解液；荧光检测模块，所述的荧光检测模块包括荧光激发装置及荧光检测装置，所述的扩增液注射装置及CRISPR反应液注射装置分别通过管道连通至反应容器。本发明的基于CRISPR的病毒快速检测识别系统及方法，可以方便快捷的进行各种病毒样本的核酸检测，仪器操作简单，检测过程可以全自动完成，不必专业人员参与，可以应用于街道、家庭等场景，并服务于快速核酸检测任务。服务于快速核酸检测任务。服务于快速核酸检测任务。


技术研发人员：董栋 张涛 郑伟波 田清 刘方武 袁永春 徐紫贺
受保护的技术使用者：中国科学院上海技术物理研究所
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/9/6