金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶三维培养间充质干细胞的制备与用途的制作方法

1.本发明涉及一种金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶，由金雀异黄酮、红三叶草异黄酮和任选的细胞因子复合在琼脂糖中制得；提供了由其制成的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)培养基质材料，含司美格鲁肽、乙醇胺、转铁蛋白和胰岛素在内的无血清培养添加物，以及在低氧分压条件下用于培养mscs的方法。模拟正常mscs在机体内微环境，从原代培养开始获得人mscs，具有更佳的mscs干性和生物学活性。间充质干细胞可制备成治疗免疫性疾病的药物组合物。


背景技术：

2.由于间充质干细胞体内生长的条件并不是在一个二维的环境，而是在一个三维的体系中。研究发现间充质干细胞的三维培养后将很好地改善其的生物学功能。机体内细胞生长的微环境不仅包括细胞外基质的网状支架，还有网状支架上粘连的各种蛋白和细胞因子，生长氧气浓度及温湿度等因素，共同营造其最佳的增殖和存活条件。通过这种条件，间充质干细胞增殖能力、抗衰老能力、体内体外存活能力以及生物学功能均达到更好的状态，有助于其在体内发挥着更好地参与组织器官修复、改善机体微环境和分泌细胞因子的能力，特别是对免疫系统的调节功能，实现对免疫性疾病的抑制炎症的作用，逆转炎症细胞对机体的损伤。
3.随着卫生环境的改善和人们生活条件的改善，反而使得免疫性疾病成为我们的发病率越来越高。包括自身免疫性疾病和过敏性疾病在内，由于自身免疫系统失衡，促炎细胞和促炎因子过度增高，调节性免疫细胞和抗炎因子却下调，而造成对机体组织或器官的攻击和持续破坏。这种慢性疾病将长年累月折磨着患者，不仅是身体难受，而且无法正常生活和工作。目前临床上仅是止痛药或抗炎或抗过敏的类固醇药物，只能缓解患者短暂的痛苦，但疾病还在不断地进展，导致身体各种器官产生损伤而最终死亡。因而我们急需开发新的有效药物能治愈该类疾病，近些年生物技术的不断发展，已发现间充质干细胞可以抑制炎症细胞和炎症因子，可能成为治疗这类疾病的特效药物，但还需进一步提高其生物学功能。
4.间充质干细胞在骨髓(bone marrow,bm)中生存为1％的氧浓度，还需要基质和生物分子维护着其的增殖和抗衰老能力等，本发明的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶生物材料，具有三维空间和生命力的活体组织，作为细胞生长模板与载体的支架，其良好的生物性能，即细胞毒性小、降解产物危害小、排异反应小和适合细胞贴附等；其空间结构维持足够长的时间，满足细胞三维生长的需求；其合理的管道，仿天然的基质分子为支架内部的细胞提供营养物质。由此在三维和低氧分压条件下培养间充质干细胞，并制备其细胞外囊泡。


技术实现要素：

5.我们模拟正常间充质干细胞在体内生长的条件，包括细胞外基质、营养成分和氧
分压等因素，应用小分子代谢产物对间充质干细胞的增殖、分化、存活和免疫调节等功能方面的研究，发现了金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶结合含有细胞因子的细胞基质材料，与含司美格鲁肽、乙醇胺、转铁蛋白和胰岛素在内的无血清培养添加物，在低氧分压条件下用于培养间充质干细胞，促进了其增殖和保持了干性特征，增强了体内存活时间和免疫调节的作用。因而将琼脂糖作为支架，复合金雀异黄酮与红三叶草异黄酮和细胞因子，即形成了间充质干细胞三维培养的体系。
6.金雀异黄酮是豆类中天然存在的黄酮类物质，具有抗氧化和抗炎的特性，清除自由基对细胞氧化损伤具有保护作用。红三叶草异黄酮也是天然植物成分，强大的抗炎作用使得其常用于免疫性疾病，包括哮喘、支气管炎和牛皮癣等，同时抗氧化作用，保护神经细胞免受暴露于谷氨酸的损伤。我们将两者添加到间充质干细胞中进行培养，其增殖倍数分别达到220倍和335倍，而且两者对间充质干细胞增殖具有协同效应，所述金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶对间充质干细胞的增殖倍数至少达到690倍。金雀异黄酮和红三叶草异黄酮培养的间充质干细胞显著抑制了促炎症因子的表达和促进抗炎症因子的表达，两者联合培养间充质干细胞干性更是进一步提高。
7.已证实了细胞在体内组织器官中氧分压基本均在1-10％之间，特别是骨髓中为1％的氧浓度，这一氧分压条件更适宜细胞的生长。通过我们发现，即使在无任何滋养层的普通培养器中，低氧培养间充质干细胞的增殖速率和生物学功能均更优于正常氧分压培养的间充质干细胞。而在金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合胶原蛋白水凝胶包被的培养器中，低氧三维培养间充质干细胞的增殖速率进一步优于普通培养器培养的间充质干细胞。特别是在含有司美格鲁肽、乙醇胺、胰岛素和重组人转铁蛋白培养条件下，司美格鲁肽作为胰高血糖素样肽受体激动剂，具有促胰岛素分泌和抗高血糖活性，对细胞功能障碍起保护作用，间充质干细胞更好保持其增殖能力和间充质干细胞特征，以及体内存活能力。间充质干细胞整个培养过程中不涉及动物和人血清或血浆。
8.本发明提供了一种金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶，其特征在于，其由金雀异黄酮、红三叶草异黄酮和任选的细胞因子复合在琼脂糖中制备的水凝胶。将添加细胞因子到琼脂糖中在细胞培养器上形成水凝胶。其制备方法包括如下步骤：
9.第1步，称取一定量的低熔点琼脂糖，加入去离子水中配置成1-10ug/ml低熔点琼脂糖，继续在蠕动泵作用下使溶液反复通过50-400目筛网以达到均匀状态；
10.第2步，加入金雀异黄酮和红三叶草异黄酮：向步骤1制备的琼脂糖溶液中加入金雀异黄酮和红三叶草异黄酮，继续在蠕动泵作用下使溶液反复通过50-400目筛网以达到均匀状态；
11.第3步，ph调节：将步骤2制备出的溶液置于0-10℃低温中，采用超滤法进行溶液置换，在超滤过程中加入超纯水或ph6.8的缓冲液，连续超滤直至透过液ph与加入的超纯水或缓冲液的ph之间的差值低于0.2；
12.第4步，辐照：将步骤3制备的样品分装后进行辐照。金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖制备得到水凝胶，优选，琼脂糖水凝胶呈多孔结构，硬度在0.2-50kpa。
13.优选，所述复合在琼脂糖水凝胶的细胞因子，包括干细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、肝细胞因子和胰岛素样生长因子中的一种或多种。
14.本发明还提供了一种细胞培养器，将所述的细胞培养基质材料放入细胞培养器，
连续均匀在细胞培养器表面形成0.2-5mm薄膜，然后加入细胞因子，所述细胞因子可复合在琼脂糖水凝胶中，从而制备得到所述细胞培养基质材料。
15.本发明还提供了一种间充质干细胞培养的无血清培养添加物，其中，所述无血清培养添加物包括含司美格鲁肽、乙醇胺、胰岛素和重组人转铁蛋白。
16.所述无血清培养添加物为1倍的使用浓度，即司美格鲁肽0.1-100μg/ml、乙醇胺0.1-200mmol/l、重组人胰岛素0.5-200μg/ml、重组人转铁蛋白0.1-500ng/ml和hepes缓冲液5mm；1倍浓度的无血清培养添加物为间充质干细胞培养最终浓度，为更好地保存和添加到培养基中，优选地为10-200倍保存浓度，高浓度储存更有利于保持其成分的活性。
17.优选地，无血清培养添加物溶液放置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到无血清培养添加物冻干粉，压盖密封后，放置2-8℃冰箱保存，便于储运和运输并有效期更长。
18.所述无血清培养添加物中含有活性蛋白，均可复合到琼脂糖水凝胶中，形成一个完整的细胞外基质环境，更有助于间充质干细胞生长和生物学功能保持。
19.本发明还提供了一种细胞培养基质材料联合上述无血清培养添加物在低氧分压条件协同培养间充质干细胞的方法，其中，所述方法为从人骨髓或组织中分离纯化得到的单细胞悬液，用40μm细胞筛过滤；所获得的细胞悬液1000转每分钟离心10分钟，细胞沉淀用1
×
pbs洗涤1次，加入含1倍无血清培养添加物的细胞培养液重悬，苔盘兰染色计数后按1-10
×
106细胞/ml加入到盛有所述细胞培养基质材料的细胞培养器中，于37℃，5％co2和低氧分压1-10％的培养箱中生长48小时。
20.培养48小时后对间充质干细胞换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入含1倍无血清培养添加物的细胞培养液，在盛有上述细胞培养基质材料的细胞培养器中继续放置37℃，5％co2和低氧分压1-10％的培养箱中继续培养，间隔2-5天用新鲜培养液进行换液1次。
21.间充质干细胞在细胞培养器中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，取5ml 1
×
pbs洗涤一次培养瓶底，加入0.5ml、质量体积比为0.25％胰酶(含0.05％edta)到培养瓶中，放置37℃，5％co2培养箱中消化2-10分钟；消化后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，用5ml移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用5ml的生理盐水洗涤一次，加入到同一个15ml离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集间充质干细胞；离心后用1ml新鲜培养液重悬，计数，用5ml移液管加入10ml新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液，加入到1个新的盛有所述细胞培养基质材料的细胞培养器中继续在37℃，5％ co2和低氧分压1-10％的培养箱中生长，每隔3天换一次新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液；待间充质干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集间充质干细胞连续传代培养，获得10
12
数量级以上的间充质干细胞，用生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得间充质干细胞，放置冰箱4℃存放备用。
22.本发明制备的间充质干细胞与淋巴细胞共培养后促进调节性t淋巴细胞增殖，抑制促炎症因子白介素4和白介素17的表达至少达到60％，促进抗炎因子白介素10和转化生长因子β1的表达超过1倍以上。
23.部分间充质干细胞用40％间充质干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。
24.所述人组织包括骨髓、废弃脐带、脐血、胎盘、羊膜、羊水、脂肪、皮肤、经血、牙齿、滑液和滑膜等，在其相应硬度的琼脂糖水凝胶基质的培养器培养，制备得到相对应的间充
质干细胞。
25.所述低氧培养条件为低氧分压1-10％；优选地，选择低氧分压1-5％。所用的培养箱为三气培养箱、低氧培养箱或在低氧工作站中进行操作并培养。
26.所述传代培养10-30次后制备的间充质干细胞，与正常氧分压条件下培养的间充质干细胞相比，具有更强细胞增殖速率和更高的克隆集落形成率，还保持间充质干细胞良好的细胞形态、细胞表型，以及可分化相应的成体细胞；优选地，制备的间充质干细胞具有更强的免疫调节功能。
27.本发明提供的一种基于金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的细胞培养基质材料和无血清培养添加物，在低氧分压条件下培养制备的间充质干细胞，包括所述的细胞培养基质材料、无血清培养添加物的细胞培养液，在低氧分压培养条件下培养的间充质干细胞，可以制备成生物制品，用于免疫性疾病治疗的药物组合物。
附图说明
28.图1为实施例4制备的bm-mscs的增殖倍数图
29.图2中实施例4与对比例制备的bm-mscs细胞增殖活性对比图
30.图3为实施例4制备的bm-mscs流式检测结果图
31.图4为实施例4与对比例制备的bm-mscs与pbls共培养后淋巴细胞亚群流式结果图
32.图5为实施例4与对比例制备的bm-mscs与pbls共培养后淋巴细胞和调节性t淋巴细胞亚群对比结果图
33.图6为实施例4与对比例制备的bm-mscs与pbls共培养后促炎因子分泌水平的结果图
34.图7为实施例4与对比例制备的bm-mscs与pbls共培养后抑炎因子分泌水平的结果图
35.图8为实施例4制备的bm-mscs治疗oa大鼠mankin's法关节病理损伤评分结果图
36.图9为实施例4制备的bm-mscs治疗oa大鼠oarsi法关节病理损伤评分结果图
37.图10为实施例4制备的bm-mscs治疗oa大鼠后炎症因子分泌水平结果图
具体实施方式
38.如本文所用，术语琼脂糖水凝胶，采用氧化反应得到了琼脂糖水凝胶，呈多孔结构，硬度在0.2-50kpa，连续均匀在细胞培养器表面形成0.5-5mm薄膜。制备成琼脂糖水凝胶细胞培养器，可用于适宜在特定硬度下生长的间充质干细胞，即在0.1-1kpa硬度下适宜培养间充质干细胞。
39.如本文所用，术语“金雀异黄酮”属于黄酮类化合物异黄酮的一种，大豆中含量较多，分子量：270.24；“红三叶草异黄酮”是天然存在的一种黄酮类化合物，在红三叶草中含量最多，高分子量：264，两者均是生物活性物质。我们研发中发现两者促进间充质干细胞增殖、抑制凋亡和衰老，特别提mscs抗炎症作用，并具有很好的协同效应。
40.本发明提供了一种制备金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的方法，其特征在于，包含如下步骤：
41.第1步，称取低熔点琼脂糖，加入去离子水中配置成1-10ug/ml低熔点琼脂糖，继续
在蠕动泵作用下使溶液反复通过50-400目筛网以达到均匀状态；
42.第2步，加入金雀异黄酮和红三叶草异黄酮：向步骤1制备的琼脂糖溶液中加入金雀异黄酮和红三叶草异黄酮，继续在蠕动泵作用下使溶液反复通过50-400目筛网以达到均匀状态；
43.第3步，ph调节：将步骤2制备出的溶液置于0-10℃低温中，采用超滤法进行溶液置换，在超滤过程中加入超纯水或ph6.8的缓冲液，连续超滤直至透过液ph与加入的超纯水或缓冲液的ph之间的差值低于0.2；
44.第4步，辐照：将步骤3制备的样品分装后进行辐照。
45.如本文所用，术语“细胞培养基质”是由天然高分子材料如琼脂糖、海藻酸钠和明胶等制备成细胞生长材料，具有异体抗原性弱、生物相容性好、可生物降解且能促进细胞粘附、生长和增殖等。任选地，当加入金雀异黄酮、红三叶草异黄酮和细胞因子到琼脂糖溶液中，在无菌环境下制备成琼脂糖水凝胶，即为细胞培养基质材料。
46.所述可复合到琼脂糖水凝胶的细胞因子，包括干细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、肝细胞因子和胰岛素样生长因子等，优选地，间充质干细胞培养常用的细胞因子，即表皮生长因子和碱性成纤维生长因子。
47.如本文所用，术语“细胞培养器”是由高分子材料制成的细胞培养器材，主要材质为聚苯乙烯、聚氯乙烯材质和聚乙烯等。本发明还提供了一种间充质干细胞培养基质材料，其特征在于，所述细胞培养基质材料用于包被细胞培养器，包括如下步骤：
48.第1步，取0.01-0.1ml/cm2的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖溶液加入到细胞培养器中，在56℃摇床上振荡30min；再加入一定量的细胞因子，37℃摇床上再振荡10min；
49.第2步，金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖包被好的细胞培养器放置在室温或37℃放置1-3小时，或者2-8℃过夜细胞培养器表面形成一层金雀异黄酮复合琼脂糖水凝胶；
50.第3步，金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶在细胞培养器表面形成0.5-5mm薄膜；制备成包被细胞培养基质材料的间充质干细胞培养器。
51.所述细胞培养器采用各种直径的细胞培养皿(如35mm、60mm、90mm、100mm、150mm和245mm方形等)、各种规格的细胞培养瓶(如25cm2、75cm2、150cm2、175cm2和225cm2等)、各种大小的细胞培养板(如96孔、24孔、12孔、6孔和4孔等)、多层细胞培养瓶(如2层、3层、4层和5层等)及多层细胞培养器(如1层式、2层式、5层式、10层式和40层式等)，均使用有助于细胞生长的聚苯乙烯材质。
52.所述细胞培养器真空密封后，可放置在2-8℃、-10℃、-20℃、-56℃和-86℃等保存，优选地，放置在-20℃保存，有限期为6个月。
53.如本文所用，术语“无血清培养添加物”是一种不添加任何动物血清，提供营养物质，例如氨基酸、维生素、脂类、胆固醇、葡萄糖和/或生长因子，帮助细胞生长的营养成分。本发明所述无血清培养添加物中含有司美格鲁肽、乙醇胺、胰岛素和转铁蛋白，形成一个完整的细胞外基质环境，更有助于间充质干细胞生长和生物学功能保持。
54.本发明提供了一种间充质干细胞培养的无血清培养添加物，其中，所述无血清培养添加物为1倍浓度，其包括含如下成分：
55.1)司美格鲁肽0.1-100μg/ml；
56.2)乙醇胺0.1-200mmol/l；
57.3)重组人胰岛素：0.5-200μg/ml；
58.4)重组人转铁蛋白：0.1-500ng/ml；
59.5)hepes缓冲液：5mm。
60.优选地为10-200倍浓度，所述无血清培养添加物使用玻璃瓶或塑料瓶灌装，根据不同规格要求灌装体积5-100ml，拧盖和密封后，可放置在2-8℃、-10℃、-20℃、-56℃和-86℃等保存，优选地，放置在-86℃保存，有限期为12个月。
61.优选地，灌装的西林瓶或塑料瓶放置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到无血清培养添加物冻干粉，压盖密封后，放置2-8℃冰箱保存，便于储运和运输并有效期更长。
62.上述试剂均有商品化产品，如美国西格玛公司和上海阿拉丁公司等，均可采购到。
63.根据上述发明内容，本发明还提供了一种上述细胞培养基质材料在低氧分压条件培养间充质干细胞的方法，其中，所述方法为从人骨髓或组织中分离纯化得到的单细胞悬液，用40μm细胞筛过滤；所获得的细胞悬液1000转每分钟离心10分钟，细胞沉淀用1
×
pbs洗涤1次，加入含1倍无血清培养添加物的细胞培养液重悬，苔盘兰染色计数后按1-10
×
106细胞/ml加入到金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的细胞培养器中，于37℃，5％co2和低氧分压1-10％的培养箱中生长48小时；
64.培养48小时后对间充质干细胞换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入含1倍无血清培养添加物的细胞培养液，在金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的细胞培养器中继续放置37℃，5％co2和低氧分压1-10％的培养箱中继续培养，间隔2天用新鲜培养液进行换液1次；
65.间充质干细胞在细胞培养器中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，取5ml 1
×
pbs洗涤一次培养瓶底，加入0.5ml、质量体积比为0.25％胰酶(含0.05％edta)到培养瓶中，放置37℃，5％co2培养箱中消化2-3分钟；消化后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，用5ml移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用5ml的生理盐水洗涤一次，加入到同一个15ml离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集间充质干细胞；离心后用1ml新鲜培养液重悬，计数，用5ml移液管加入10ml新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液，加入到1瓶新的盛有所述细胞培养基质材料的细胞培养器中继续在37℃，5％co2和低氧分压1-10％的培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液；待间充质干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集间充质干细胞，连续传代培养，获得10
12
数量级以上的间充质干细胞，用生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得间充质干细胞，放置冰箱4℃存放备用；
66.部分间充质干细胞用40％间充质干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。
67.所述人组织包括骨髓、废弃脐带、脐血、胎盘、羊膜、羊水、脂肪、皮肤、经血、牙齿、滑液和滑膜等，在其相应硬度的琼脂糖水凝胶基质的培养器培养，制备得到相对应的mscs。
68.所述低氧培养条件为低氧分压1-10％；优选地，选择低氧分压1-5％。所用的培养箱为三气培养箱、低氧培养箱或在低氧工作站中进行操作并培养。
69.所述传代培养10-30次后制备的mscs，与其他方法培养的mscs相比，本发明培养
mscs倒置显微镜观察具有很好的细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型符合要求；体外增殖能力分析表明其更好的增殖活性；与淋巴细胞共培养后促进调节性t淋巴细胞增殖，抑制促炎症因子白介素4和白介素17的表达至少达到60％，促进抗炎因子白介素10和转化生长因子β1的表达超过1倍以上。优选，mscs治疗骨性关节炎动物模型的体内实验中，采用mankin's评分和国际骨关节炎研究学会(osteoarthritis research society international，oarsi)半定量评分显著降低，促进骨性关节炎大鼠运动功能恢复，更有助于大鼠骨性关节炎修复。
70.所述的细胞培养液为商业上可购买到的，包括gibco公司mem alpha与dmem/f12(1:1)培养基、lonza公司ebm-2basal medium-2与ultraculture
tm
无血清培养基、biowit公司无血清培养基、irvine公司chang培养基、cyagen biosciences公司oricell
tm
无血清培养基、r&d公司stemxvivo无血清培养基和thermo fisher公司stempro无血清培养基等。
71.本发明提供的一种细胞培养基质材料，由金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合的琼脂糖水凝胶制得；由其制成的细胞培养器，含乙醇胺、胰岛素和转铁蛋白在内的无血清培养添加物，以及在低氧分压条件下用于培养mscs的方法。特别地，模拟正常mscs在机体内生长环境，从原代培养开始获得人mscs，可以制备成生物制品，用于免疫性疾病治疗的药物组合物。特别是在骨性关节炎(osteoarthritis，oa)、自身免疫疾病、过敏性疾病、糖尿病和皮肤病等制备成细胞治疗产品，用于临床治疗。
72.以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
73.实施例1金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖的制备
74.第1步，称取4g低熔点琼脂糖(美国lonza公司)置于烧杯中，加入100倍重量的0.1mol/l去离子水溶液，在蠕动泵作用下使溶液反复通过200目筛网使其达到均匀状态；
75.第2步，加入金雀异黄酮和红三叶草异黄酮：向步骤(1)制备的琼脂糖溶液中加入0.1-1μm金雀异黄酮和0.1-1μm红三叶草异黄酮各1ml(均购自中国食品药品检定研究院)，继续在蠕动泵作用下使溶液反复通过100目筛网以达到均匀状态；
76.第3步，ph调节：将步骤(2)制备出的溶液置于0-10℃低温中，采用超滤法进行溶液置换，在超滤过程中加入超纯水，连续超滤直至透过液ph与加入的超纯水之间的差值低于0.2；
77.第4步，辐照：将步骤(3)制备的样品分装后进行紫外照射，即制备成细胞培养基质材料。
78.实施例2金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的细胞培养器的制备
79.第1步，取0.01-0.1ml/cm2的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖溶液加入到细胞培养器中，在56℃摇床上振荡30min；再加入20ng/ml重组人egf、20ng/ml重组人bfgf和/或20ng/ml重组人igf-1(美国peprotech)，37℃摇床上再振荡10min；
80.第2步，金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖包被好的细胞培养器放置在2-8℃冰箱中过夜，细胞培养器表面形成一层金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶；
81.第3步，金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶在细胞培养器表面形成0.2-0.5mm薄膜；制备成硬度为0.5kpa金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合的琼脂糖水凝胶
包被的间充质干细胞培养器。
82.实施例3间充质干细胞用无血清培养添加物的制备
83.购买生物试剂按照50倍配制无血清培养添加物，具体配制方法：分别称司美格鲁肽(杭州壹静科技有限公司)、乙醇胺(美国sigma公司)、重组人胰岛素(先使用0.1m盐酸进行溶解，北京科昕生物)、重组人转铁蛋白(美国sigma公司)和hepes(上海阿拉丁)，加入earle's平衡盐溶液(ebss)缓冲液溶解，磁力搅拌下4℃层析柜中溶解30min，调节ph值为7.2-7.6，配制的溶液连续通过真空0.22μm和0.1μm过滤器抽滤除菌，然后进行无菌灌装到西林瓶或塑料瓶中，每瓶为10ml，并压盖密封后，放置-86℃超低温冰箱保存。
84.灌装的10ml西林瓶或塑料瓶放置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到无血清培养添加物冻干粉，压盖密封后，放置2-8℃冰箱保存。
85.50倍无血清培养添加物各组分浓度如下：
86.1)司美格鲁肽5-5mg/ml；
87.2)乙醇胺：5-1000mmol/l；
88.3)重组人胰岛素：25-1000μg/ml；
89.4)重组人转铁蛋白：5ng-2.5μg/ml；
90.5)hepes缓冲液：250mm。
91.西林瓶或塑料瓶贴上标签并装入包装盒中，并放入使用说明书，密封后形成产品。
92.实施例4金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的细胞培养器在低氧分压条件培养骨髓来源的间充质干细胞
93.将采集的人骨髓(与捐献者签署知情同意书)用1
×
pbs(ph7.4)稀释1倍后，混匀后通过人淋巴细胞分离液进行梯度离心获得单个核细胞，即将稀释后的骨髓吸取到加有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中2000转每分钟离心20分钟，密度梯度离心后吸取中间白膜层到50ml离心管，加入1倍体积的1
×
pbs(ph7.4)，1500转每分钟离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用1
×
pbs(ph7.4)再洗涤2次后，加入含实施例3制备的1倍无血清培养添加物的mem alpha(美国gibco)无血清培养基重悬，苔盘兰染色计数后按10
×
106细胞/ml加入到实施例2制备的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的10cm细胞培养皿中，于37℃，5％ co2和低氧分压1-5％的三气培养箱中培养48小时。
94.培养48小时后对间充质干细胞换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入上述的mem alpha无血清培养基，在上述的10cm细胞培养皿中继续放置37℃，5％co2和低氧分压1-5％的三气培养箱中继续培养，间隔2天用新鲜培养液进行换液1次；
95.骨髓来源的间充质干细胞在细胞培养器中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，取5ml1
×
pbs洗涤一次培养瓶底，加入0.5ml、质量体积比为0.25％胰酶(含0.05％ edta)(美国gibco)到培养瓶中，放置37℃，5％co2培养箱中消化2-3分钟；消化后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，用5ml移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用5ml的生理盐水洗涤一次，加入到同一个15ml离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集间充质干细胞；离心后用1ml新鲜培养液重悬，计数，用5ml移液管加入10ml新鲜的上述的细胞培养液，加入到1瓶新的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的175cm2的细胞培养瓶中继续在37℃，5％co2和低氧分压1-10％的三气培养箱中生长，每隔3天换一次新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液；待间充质干细胞生长融合达到80％以上时，按
上述经胰酶消化收集间充质干细胞，连续传代培养到第5代、第10代和第15代，获得的间充质干细胞用生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得间充质干细胞，放置冰箱4℃存放备用。经金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的细胞培养器和在低氧分压条件培养第5、10和15代bm-mscs倒置显微镜观察，均呈小突起圆形或梭形形态，成螺旋状生长。图1为bm-mscs在连续传代后的增殖倍数，本发明制备的mscs在p1到p5代时增殖倍数为691.06倍；从p5到p10代时增殖倍数为364.07倍；因而表明在本发明的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的细胞培养器中在低氧分压条件培养骨髓来源的mscs具有很好细胞增殖能力，扩增倍数显著提高。
96.实施例5间充质干细胞体外增殖活性和细胞表型分析
97.取实施例4中培养的第15代骨髓间充质干细胞以及通过对照组制备的第10代间充质干细胞进行增殖活性分析。对比例依据shaimaa a abdelrahman等2022年8月在分子与细胞杂志上发表的缺氧上调有丝分裂周期蛋白并通过延长增殖寿命促进人间充质干细胞的多向分化(abdelrahman sa,abdelrahman aa,samy w,dessouky aa,ahmed sm.hypoxia pretreatment enhances the therapeutic potential of mesenchymal stem cells(bmscs)on ozone-induced lung injury in rats.cell tissue res.2022aug；389(2):201-217.)取5.0
×
103细胞/孔接种到6孔板中，每孔3ml培养体系，平行3个复孔，分别在本发明培养条件下和对照组培养条件下培养1天、2天、3天、4天和5天，每天分别通过美国bio-rad细胞计数仪进行计数，检测细胞增殖活性。从图2中可以知道，本发明制备的第15代msc和对照组制备的第10代相比，细胞增殖活性明显增强，两者之间并具有显著的差异(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001和****p＜0.0001)，表明本发明制备的第15代骨髓间充质干细胞具有更好的增殖活性。
98.取实施例4中制备的3
×
106第15代bm-mscs，分4组，第1组为同型对照，分别添加到有20μl fitc标记鼠igg1、20μl pe标记鼠igg1和20μl percp标记鼠igg1；第2组分别添加到有20μl fitc标记鼠抗人cd34单抗、20μl pe标记鼠抗人cd90单抗和20μl percp标记鼠抗人hla-dr单抗；第3组分别添加到有20μl fitc标记鼠抗人cd44单抗和20μl pe标记鼠抗人cd73单抗；第4组分别添加到有20μl fitc标记鼠抗人cd45单抗和20μl pe标记鼠抗人cd105单抗(全部流式抗体购自美国biolegend公司)。
99.将样本置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1ml的1
×
pbs(ph7.4)洗涤3次，最后用0.5ml的1
×
pbs重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用fcs calibur流式细胞仪检测(美国bd公司)，图3为第15代bm-mscs流式检测结果图，具体检测结果见表1。
100.表1
[0101][0102]
表中结果表明本发明制备的人bm-mscs均高表达cd90、cd73、cd105和cd44，而低表达cd34、cd45和hla-dr，表明bm-mscs连续培养到第15代，仍符合间充质干细胞表型标志物要求，与对比例培养的p5代bm-mscs的表型相似。
[0103]
实施例6间充质干细胞免疫调节功能检测
[0104]
取实施例4制备第10代的bm-mscs和对比例制备第5代的bm-mscs分别以5
×
104个活细胞/孔加入到6孔板中，加入3ml相应的培养基分别在三气培养箱和co2培养箱中培养24小时。
[0105]
采集正常健康捐献者的50ml外周血(与其签署知情同意书)，经人淋巴细胞分离液梯度离心后获得人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,pbls)，计数后放置4度冰箱备用。培养了24小时的bm-mscs吸弃培养上清，加入以5
×
105个pbls/孔加入到6孔板中，并添加3ml含5％胎牛血清的rpmi 1640培养基，分别在三气培养箱和co2培养箱中培养5天，对照组为未共培养的pbls。
[0106]
取培养了5天悬浮的pbls，计数后将3
×
106，分4组，第1组为同型对照，分别添加到有20μl fitc标记鼠igg1、20μl pe标记鼠igg1和20μl percp标记鼠igg1；第2组分别添加到有20μl fitc标记鼠抗人cd3单抗、20μl pe标记鼠抗人cd8单抗和20μl percp标记鼠抗人cd4单抗；第3组分别添加到有20μl fitc标记鼠抗人cd25单抗和20μl pe标记胞内igg1单抗；第4组分别添加到有20μl fitc标记鼠抗人cd25单抗、20μl pe标记鼠抗人foxp3单抗和和20μl percp标记鼠抗人cd4单抗(全部流式抗体购自美国biolegend公司)。
[0107]
前两组为细胞表面标志物，即将细胞置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1ml的1
×
pbs(ph7.4)洗涤3次，最后用0.5ml的1
×
pbs重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用fcs calibur流式细胞仪检测；后两组为胞内表达，即先细胞破膜后再染色foxp3，按照产品说明书进行操作，图4为bm-mscs与pbls共培养后淋巴细胞亚群流式结果图。图5为统计学分析后bm-mscs与pbls共培养后淋巴细胞亚群百分比对比结果图，与对比例制备的p5代bm-mscs与pbls共培养的相比，本发明的p10代bm-mscs能明显抑制cd3+cd8
+
淋巴细胞增殖，而促进调节性t淋巴细胞增殖，其是体内主要的抑制免疫功能的细胞，并具有显著性差异。
[0108]
细胞因子酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)检测，取收集bm-mscs与pbls共培养后的上清，按照elisa试剂盒说明书检测共培养上清中促炎因子(il-4和il-17)和抑炎因子(il-10和tgf-β1)的分泌水平。图6为共培养上清中促炎
因子分泌水平结果图，本发明的p10代bm-mscs与pbls共培养后抑制了抑炎因子il-4和il-17的表达，与对比例的bm-mscs相比，统计学上均具有显著下降(*p＜0.05，**p＜0.01和****p＜0.001)。图7为共培养上清中抑炎因子分泌水平结果图，本发明的p10代bm-mscs与pbls共培养后促进抑炎因子il-10和tgf-β1的表达，与对比例的bm-mscs相比，统计学上均具有显著地上升(*p＜0.05，**p＜0.01和****p＜0.001)。
[0109]
上述的结果表明本发明制备的bm-mscs可促进调节性t淋巴细胞增殖，并抑制炎症因子的分泌，对于自身免疫和过敏性疾病的治疗将具有良好的免疫调节作用。
[0110]
实施例7间充质干细胞治疗骨性关节炎动物模型的体内实验
[0111]
将大鼠随机分为正常对照组、oa模型组、实施例4制备的第10代msc、对比例制备的第5代msc，每组8只。所有大鼠麻醉后于使用0.02mg(25cdu/50μl)胶原蛋白酶ii(美国西格玛公司)，分别于第1和4天关节腔注射造模。造模后1月分别关节腔注射mscs 4
×
106/kg，100μl，每2周1次，共3次，正常对照组和oa模型组以等量生理盐水关节腔注射。
[0112]
所有大鼠处死前禁食12h，取股动脉血约3ml置于5ml肝素钠抗凝管中，4℃保存待用。处死所有大鼠并解剖全膝关节，于髌上囊剪开约0.5cm的切口，用1ml生理盐水分3次灌洗关节腔，收集关节灌洗液置于硅化试管中。4℃下4000r/min离心10min，取上清，-20℃低温保存待用。将膝关节用4％福尔马林固定，5％甲酸脱钙，1周后取出，沿关节冠状面切取软骨。
[0113]
苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，he)染色：将各组大鼠膝关节软骨组织置于4％多聚甲醛中固定72h后，用20％乙二胺四乙酸进行脱钙处理，再将其置于梯度乙醇中脱水，随后在石蜡中包埋。将石蜡包埋的组织切成厚度为4μm的切片，于室温下进行苏木精染色2min，随后伊红染色1min。光学显微镜(日本奥林帕斯公司)下观察关节软骨组织病理学变化。胶原蛋白酶模型组关节软骨组织he染色，滑膜层和滑膜下层可见炎性细胞浸润，细胞层次可达6～13层，排列不整齐，滑膜充血，表面有大量纤维素覆盖；实施例4第10代bm-mscs移植组和对比例第5代bm-mscs移植组均出现膝关节滑膜菲薄、平滑，滑膜细胞扁、核椭圆形、常为1～3层紧密排列，无炎性细胞浸润；其中实施例4第10代bm-mscs移植组效果抑制炎症更为明显，研究结果表明本发明的bm-mscs大鼠体内实验治疗oa是有效的，抑制了炎症因子分泌和促进软骨修复等功能。
[0114]
采用mankin's法进行关节病理损伤评分，评分标准:0～1分为软骨正常，2～5分为软骨轻度损伤，6～9分为软骨中度损伤，10～14分为软骨重度损伤。图8为mankin's法关节病理损伤评分结果图，实施例4第10代msc移植组和对比例第5代msc移植组、的评分均低于胶原蛋白酶模型组，本发明的p10代bm-mscs要明显好于对比例第5代bm-mscs，统计学上均具有显著差异(*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001)，结果表明本发明制备的bm-mscs具有更好治疗oa的效果。
[0115]
番红o-固绿染色：将大鼠膝关节软骨组织石蜡切片脱蜡至水，加入新鲜配制的weigert染液染色5min，水洗，酸性分化液分化15s，随后蒸馏水洗涤10min，置入固绿染色液中染色5min，用弱酸溶液洗涤15s去除固绿，置入番红o染色液内染色5min，无水乙醇脱水，二甲苯透明，光学树脂封固。于荧光显微镜下观察。采用国际骨关节炎研究学会(osteoarthritis research society international，oarsi)半定量评分评估骨关节炎严重程度，评分标准:关节软骨结构(0～8分)、软骨基质着色(0～6分)、软骨细胞分布及数量
(0～3分)、潮线是否完整(0～1分)及有无骨赘形成(0～3分)，评分越高提示骨关节炎越严重。图9为oarsi法关节病理损伤评分结果图，实施例4第10代bm-mscs移植组和对比例第5代bm-mscs移植组的评分均低于胶原蛋白酶模型组，同时也发现本发明的p10代bm-mscs要明显好于对比例第5代bm-mscs，统计学上均具有显著地降低(**p＜0.01和***p＜0.001)，结果表明本发明制备的bm-mscs具有更好的软骨修复效果。
[0116]
炎症因子elisa检测：取收集的各组大鼠股动脉血，12000r/min离心15min，收集上清液，并取关节灌洗液，按照elisa试剂盒说明书检测血清和关节灌洗液中炎症因子tnf-α和il-1β分泌水平。图10为oa大鼠bm-mscs治疗后炎症因子分泌水平结果图，tnf-α和il-1β血清含量水平在实施例4第10代bm-mscs移植组和对比例第5代bm-mscs移植组中的均低于胶原蛋白酶模型组，且本发明的p10代bm-mscs要更低于对比例第5代bm-mscs，统计学上均具有显著地下调(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001和****p＜0.0001)，结果表明本发明制备的bm-mscs具有抑制炎症因子分泌，改善关节的炎症微环境，抑制炎症对软骨细胞的损伤。

技术特征：
1.一种金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶，其特征在于，其包括将金雀异黄酮、红三叶草异黄酮和任选的细胞因子复合在琼脂糖中制备的水凝胶；优选，所述金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶对间充质干细胞增殖具有协同效应，增殖倍数达到690倍以上，对淋巴细胞具有良好的免疫调节功能。2.根据权利要求1所述的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶，其特征在于，其制备方法包括：(1)先将低熔点琼脂糖溶液混合制备琼脂糖溶液；(2)然后将金雀异黄酮、红三叶草异黄酮和任选的细胞因子与该琼脂糖溶液进行复合；优选，步骤(1)中，将低熔点琼脂糖溶液混合后，将混合液的ph值调为7.4，在37-56℃下制备琼脂糖溶液；优选，步骤(2)中，将添加细胞因子到琼脂糖中在细胞培养器上形成水凝胶。3.根据权利要求1-2所述的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：第1步，称取低熔点琼脂糖，加入去离子水中配置成1-10μg/ml低熔点琼脂糖，继续在蠕动泵作用下使溶液反复通过50-400目筛网以达到均匀状态；第2步，加入金雀异黄酮和红三叶草异黄酮：向步骤1制备的琼脂糖溶液中加入金雀异黄酮和红三叶草异黄酮，继续在蠕动泵作用下使溶液反复通过50-400目筛网以达到均匀状态；第3步，ph调节：将步骤2制备出的溶液置于0-10℃低温中，采用超滤法进行溶液置换，在超滤过程中加入超纯水或ph6.8的缓冲液，连续超滤直至透过液ph与加入的超纯水或缓冲液的ph之间的差值低于0.2；第4步，辐照：将步骤3制备的样品分装后进行辐照。4.根据权利要求1-3中任一项所述的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶，其特征在于，通过琼脂糖将金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合到琼脂糖中制备得到金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶；优选，琼脂糖水凝胶呈多孔结构，硬度在0.2-50kpa。5.根据权利要求1-3中任一项所述的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶，其特征在于，所述细胞因子包括干细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、肝细胞因子和胰岛素样生长因子中的一种或多种。6.一种间充质干细胞培养基质材料，其特征在于，所述细胞培养基质材料包含权利要求1-5中任一项所述的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶。7.根据权利要求6所述的间充质干细胞培养基质材料，其特征在于，其用于包被细胞培养器，包括如下步骤：第1步，取0.01-0.1ml/cm2的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖溶液加入到细胞培养器中，在56℃摇床上振荡30min；再加入一定量的细胞因子，37℃摇床上再振荡10min；第2步，金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖包被好的细胞培养器放置在室温或37℃放置1-3小时，或者2-8℃过夜，细胞培养器表面形成一层金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶；第3步，金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶在细胞培养器表面形成0.5-5mm薄膜；制备成包被细胞培养基质材料的间充质干细胞培养器。
8.一种在低氧分压条件培养间充质干细胞的方法，其特征在于，其使用了权利要求1-5中任一项所述的金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶或权利要求6-7中任一项所述细胞培养基质材料，以及无血清培养添加物，在低氧分压培养条件下培养间充质干细胞；优选，所述无血清培养添加物为1倍的使用浓度，即司美格鲁肽0.1-100μg/ml、乙醇胺0.1-200mmol/l、重组人胰岛素0.5-200μg/ml、重组人转铁蛋白0.1-500ng/ml和hepes缓冲液5mm。进一步优选，所述无血清培养添加物为10-200倍的保存浓度或冻干粉。9.根据权利要求1和8所述的间充质干细胞，其特征在于，其具有显著的免疫调节功能，即其与淋巴细胞共培养后促进调节性t淋巴细胞增殖达到1000倍，抑制促炎症因子白介素4和白介素17的表达至少达到60％，促进抗炎因子白介素10和转化生长因子β1的表达超过1倍以上。10.一种间充质干细的药物组合物，其特征在于，由权利要求1和8-9所述方法培养的间充质干细胞，制备成治疗免疫性疾病的药物组合物。

技术总结
本发明公开了一种金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶，由金雀异黄酮、红三叶草异黄酮和任选的细胞因子复合在琼脂糖中制得；本发明提供了由其制成的间充质干细胞培养基质材料，含司美格鲁肽、乙醇胺、胰岛素和转铁蛋白在内的无血清培养添加物，以及在低氧分压条件下用于培养间充质干细胞的方法。模拟干细胞在机体内微环境，从原代培养开始培养人间充质干细胞，具有更佳的增殖能力和抗炎活性。金雀异黄酮与红三叶草异黄酮复合琼脂糖水凝胶的间充质干细胞培养基质材料和无血清培养添加物，在低氧分压条件下用于培养人间充质干细胞、制备间充质干细胞的生物制剂，以及生产治疗免疫性疾病的药物组合物。治疗免疫性疾病的药物组合物。治疗免疫性疾病的药物组合物。


技术研发人员：黄启明 况轶群 项晨 陈乐辉 张育正 李文轩
受保护的技术使用者：江西美奥生物技术有限公司
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/9/6