检测肝癌的标志基因组合物、试剂盒和用途的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种评估肝癌风险和/或检测肝癌的生物标志基因组合、试剂盒和用途。


背景技术：

2.2018年，人类癌症导致了全世界大量死亡，其中大多数被诊断为晚期。到目前为止，在远端转移之前进行干预提供了改善预后的最大机会，因此开发在症状出现之前检测癌症的敏感、可靠和微创的试验是非常合乎需要的。在众多癌种中，肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc)作为一种严重危害人类健康的重大疾病，不仅发病率高，而且隐匿、进展快、复发率和死亡率高，被称为“癌中之王”。到医院就诊的肝癌患者大多为中或晚期，若不治疗自然病程仅3-6个月。目前，中国ivd市场暂无已获批的肝癌辅助诊断试剂盒，肝癌主要的诊断方式为腹部mri和ct等影像学检查。与市场上的其他诊断方法相比，这种方法检测结果相对精确，是临床肝癌诊断的金标准。但其缺点也比较明显，其主要缺点为：
3.(1)影像学所需设备价格高，难以在基层医院应用；
4.(2)检测费用相对较高，需求经验丰富的临床医生进行操作及诊断；
5.(3)ct对于小于1cm或者密度近似正常肝实质的肝癌难以显示；
6.(4)ct具有放射性；
7.(5)mri：体内有金属异物时无法检测。
8.另外，针对肝癌早期检测，目前国内外指南仅推荐肝癌发病风险升高的人群每6个月进行b超检查(也可以用ct或mri代替)，可同时选择甲胎蛋白(a-fetoprotein,afp)检测。但b超在肝癌早期缺乏良好的敏感性，容易发生漏诊，且容易受到操作者、仪器等多种因素的影响。血清afp特异性和敏感性均不高，慢性或活动性肝炎、肝硬化、睾丸或卵巢胚胎源性肿瘤均会导致afp升高，而约30％的肝癌患者afp水平正常。来自中国的研究显示，在hbv感染或者慢性肝硬化的人群中，单独使用b超、单独使用afp或者两者联合进行肝癌筛查的检出率分别为84％、69％和92％，阳性预测值(positivepredictivevalue，ppv)分别为6.6％、3.9％和3.0％。现有推荐的筛查方式难以满足肝癌早期检测的需求，临床上亟需开发精准有效的针对肝癌早检的辅助诊断方式。
9.液体活检技术作为一种非侵入性的新型检测技术，在肿瘤早期筛查与诊断方面具有巨大的应用潜力。液体活检通过血液、唾液、尿液等体液样本对肿瘤信号进行检测分析，与传统组织活检相比，具有无创、实时动态监测、克服肿瘤异质性等优势。液体活检的肿瘤标志物主要包括基因组、表观遗传组、转录组、微生物组、蛋白组和代谢组等层面。肿瘤标志物在ctdna层面的特征主要包括点突变、片段化、拷贝数变异、甲基化等维度。其中dna甲基化异常是驱动癌症发生发展的重要表观遗传修饰之一，它往往在癌症病程的早期发生。肿瘤中普遍存在dna甲基化状态的改变。多项研究表明dna甲基化液体活检已成为肿瘤辅助诊断及筛查最具潜力的方法学之一。
10.因此本发明旨在提供效果良好的用于肝癌辅助诊断的体外诊断标志物和试剂盒，
以用于临床上对疑似肝癌患者的辅助诊断。


技术实现要素：

11.本发明提供了一种评估肝癌风险和/或检测肝癌的生物标志基因组合、试剂盒和用途，通过对来自个体的核酸样本中生物标志基因组合的甲基化水平进行检测，并将标志基因的甲基化水平与内参基因进行比较，根据比较结果判断个体是否具有肝癌风险或患有肝癌，为肝癌形成风险的相关性评估提供了一种低成本、高精确度的方法。
12.在一方面，本发明提供了一种用于评估肝癌风险和/或检测肝癌的生物标志基因组合，其中，该生物标志基因组合包含选自ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5中的任意至少4个基因。
13.另一方面，本发明提供了一种用于检测肝癌的试剂盒，其中，该试剂盒包含用于检测上述生物标志物基因组合的甲基化水平的检测试剂。
14.另一方面，本发明提供了一种检测上述生物标志基因组合的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，该试剂盒用于评估个体患有肝癌的风险和/或检测肝癌。
附图说明
15.通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其他特征、目的和优点将会变得更明显。附图仅用于示出具体实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
16.图1示出了单一基因进行检测的roc曲线。
17.图2示出了单一基因进行检测的肝癌、肝硬化和健康人样本组间差异显著性。
18.图3示出了8个基因组合进行检测的roc曲线。
19.图4示出了8个基因组合进行检测的肝癌、肝硬化和健康人样本组间差异显著性。
20.图5示出了8个基因组合进行检测，当sum(δct)阈值为151.4时，各组的特异性和敏感度。
21.图6示出了本发明提供的检测方法与afp方法的性能对比。
具体实施方式
22.i.定义
23.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
24.如本文所用，术语“特异性(specificity)”，也称“真阴性率(true negative rate，tnr)”，是指以诊断结果阴性为真阴性条件，来评估检测结果为阴性的准确率。即：在同一类样本中，检测结果中的阴性数量，除以诊断结果中的阴性数量。
25.如本文所用，术语“敏感度(sensitivity)”，也称“真阳性率(true positive rate，tpr)”，是指以诊断结果阳性为真阳性条件，来评估检测结果为阳性的准确率。即：在同一类样本中，检测结果中的阳性数量，除以诊断结果中的阳性数量。
26.如本文所用，术语“甲基化”通常是指本技术中基因片段、核苷酸或其碱基具有的甲基化状态。例如，本技术中基因所在的dna片段可以在一条链或多条链上具有甲基化。例如，本技术中基因所在的dna片段可以在一个位点或多个位点上具有甲基化。
27.如本文所用，术语“下一代测序”(next generation sequencing，ngs)，指确定个体核酸分子(例如，在单个分子测序中)或以高通量模式克隆扩增的个体核酸分子的代替物(例如，同时测序多于103、104、105或更多分子)的核苷酸序列的任何测序方法。下一代测序平台包括但不限于已有的illumina等测序平台。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置用于本方法。下一代测序方法包括，例如，通过合成技术(illumina)测序、大规模平行签名测序(massively parallel signature sequencing，mpss)、聚合酶克隆(polony sequencing)、焦磷酸测序(454)、离子半导体技术(离子激流测序)(ion semi conductor sequencing)、dna纳米球测序(dna nano-ball sequencing)、complete genomics的dna纳米阵列与组合探针锚定连接测序法、单分子实时测序(pacific biosciences)和通过连接测序(solid测序)等。上述下一代测序可以使对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。例如，本发明的方法同样可以应用于一代基因测序、二代基因测序、三代基因测序或单分子测序(sms)。
28.如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”是可互换使用的。它们表示具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸)的多聚形式，或其类似物。多核苷酸可以具有任何立体结构，并且可以发挥任何功能，无论是已知的还是未知的。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、根据连锁分析所限定的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna(trna)、核糖体rna(rrna)、短干扰rna(sirna)、短-发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、核糖酶、cdna、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的dna、具有任何序列的分离的rna、核酸探针、引物和接头。多核苷酸可以包括一个或多个修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。
29.如本文所用，术语“游离dna样本”或“cfdna样本”包括从个体中获取的包含cfdna的血液样本或血浆样本，还包括对上述血液样本或血浆样本以任何方式处理并提取cfdna后得到的样本，例如用试剂、洗脱、吸附或富集特定类型的分子(例如，核酸分子)等方式处理过的样本。
30.如本文所用，术语“约登指数(youden index)”，也称正确指数，是评价筛查试验真实性的方法，假设其假阴性(漏诊率)和假阳性(误诊率)的危害性同等意义时，即可应用约登指数。约登指数是敏感性与特异性之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大。术语“约登指数最佳”也就是敏感性与特异性之和减去1之后的值最大的情况。
31.ii.具体实施方案详述
32.在一方面，本发明提供了一种用于评估肝癌风险和/或检测肝癌的生物标志基因组合，其中，生物标志基因组合包含选自ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5中的任意至少4个基因。
33.在一些优选的实施方式中，上述生物标志基因组合包含选自表10基因组合一栏所
示的任意一组中4个基因的组合。
34.在一些优选的实施方式中，上述生物标志物基因组合包含选自ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5中的任意至少6个基因。
35.在一些更优选的实施方式中，上述生物标志基因组合包含选自表11基因组合一栏所示的任意一组中6个基因的组合。
36.在一些优选的实施方式中，上述生物标志基因组合包含ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5。
37.另一方面，本发明提供了一种用于检测肝癌的试剂盒，其中，该试剂盒包含用于检测上述生物标志物基因组合的甲基化水平的检测试剂。
38.在一些实施方式中，上述试剂盒包含内参基因的甲基化水平的检测试剂。
39.在一些优选的实施方式中，内参基因为actb。
40.在一些实施方式中，上述检测试剂包含用于检测所述生物标志基因组合中各个基因和/或内参基因甲基化水平的正向引物、反向引物和/或探针。
41.在一些优选的实施方式中，正向引物包含选自seq id no:1、4、7、10、13、16、19、22和25所示的至少一个正向引物。
42.在一些优选的实施方式中，反向引物包含选自seq id no:2、5、8、11、14、17、20、23和26所示的至少一个反向引物。
43.在一些优选的实施方式中，探针包含选自seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24和27所示的至少一个探针。
44.在一些更优选的实施方式中，检测试剂包含选自seq id no:1、4、7、10、13、16、19、22和25所示的至少一个正向引物、选自seq id no:2、5、8、11、14、17、20、23和26所示的至少一个反向引物和选自seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24和27所示的至少一个探针。
45.在一些更优选的实施方式中，检测试剂包含如seq id no:1、4、7、10、13、16、19、22和25所示的正向引物、如seq id no:2、5、8、11、14、17、20、23和26所示的反向引物和如seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24和27所示的探针。
46.另一方面，本发明提供了一种检测上述任一方面生物标志基因组合的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，该试剂盒用于评估个体患有肝癌的风险和/或检测肝癌。
47.在一些实施方式中，评估个体患有肝癌的风险和/或检测肝癌包括：
48.(1)在来自个体的核酸样本中检测生物标志基因组合中每个基因的甲基化水平；
49.(2)将每个基因的甲基化水平与内参基因进行比较，根据比较结果判断该核酸样本是否具有肝癌风险或患有肝癌。
50.在一些实施方式中，其中，上述(2)进一步包括：
51.计算生物标志基因组合中在qpcr扩增后的每个基因的ct值与内参基因的ct值的差值δct；
52.根据生物标志基因组合中的每个基因对应的差值与第一预设阈值的大小，对每个基因对应的差值进行标准化，得到生物标志基因组合中的每个基因对应的标准化差值；
53.将生物标志基因组合中的全部基因对应的标准化差值求和；
54.比较求和结果与第二预设阈值的大小，判断核酸样本是否具有肝癌风险或患有肝癌。
55.在一些实施方式中，每个基因对应的δct值与第一预设阈值的对应关系如下：ak055957的第一预设阈值为8.5，bend4的第一预设阈值为5.5，dab2ip的第一预设阈值为11.5，emx1的第一预设阈值为8，otx1的第一预设阈值为11，ptpn18的第一预设阈值为8.5，rnf135的第一预设阈值为11，tspyl5的第一预设阈值为6。
56.在一些实施方式中，上述(2)还包括在比较每个基因对应的δct值与第一预设阈值的大小后，若该基因的δct值大于其第一预设阈值时，对该基因的δct值进行标准化。示例性的，对该基因的δct值赋予一定值，例如，25。
57.在一些实施方式中，上述第二预设阈值为根据roc曲线中约登指数最大值得出的阈值。约登指数是敏感度与特异性之和减去1。该值可以表征本筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。约登指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越高。示例性的，第二预设阈值为151.4。
58.在一些优选的实施方式中，当求和结果大于或等于第二预设阈值时，该核酸样本被判定为肝癌阳性，当求和结果小于第二预设阈值时，该核酸样本被判定为肝癌阴性。
59.在一些实施方式中，上述(1)包括对经过重亚硫酸氢盐处理的核酸样本进行预扩增处理。
60.在一些实施方式中，上述(1)包括：
61.(a)从个体中提取核酸样本；
62.(b)对核酸样本进行重亚硫酸氢盐处理；
63.(c)对经过重亚硫酸氢盐处理的核酸样本进行预扩增处理；
64.(d)对经过预扩增处理的核酸样本进行qpcr扩增。
65.在一些实施方式中，核酸样本是包含游离dna(cfdna)的样本，例如：血液样本、脑脊液、唾液、尿液、胸腔和腹腔积液、粪便等。
66.本发明提供了一种新的用于评估肝癌风险和/或检测肝癌的生物标志基因组合、试剂盒和用途，以及相应的新内参基因，通过对来自个体的核酸样本中生物标志基因组合的甲基化水平进行检测，并将标志基因的甲基化水平与内参基因进行比较，根据比较结果判断个体是否具有肝癌风险或患有肝癌，为肝癌形成风险的相关性评估提供了一种低成本、高精确度的方法。
67.实施例
68.实施例1：引物、探针和blocker的设计
69.针对目的基因ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5的特定区域设计甲基化特异性引物(msp)和taqman探针，内参基因选用actb，同样对actb设计引物和taqman探针，每个基因探针荧光示例性地选择如下：ak055957(ned)、bend4(ned)、dab2ip(cy5)、emx1(rox)、otx1(cy5)、ptpn18(fam)、rnf135(rox)、tspyl5(fam)。荧光基团不绑定基因位点，可以根据实施需要进行调整。同时对于ak055957、bend4、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5基因特定区域设计核苷酸阻断剂(blocker)。9个基因引物及探针序列如表1所示。
70.表1甲基化marker引物及探针序列
71.[0072][0073]
实施例2：目的基因甲基化水平的检测和判断
[0074]
1.核酸提取
[0075]
从10ml全血中分离得到血浆，用磁珠法游离dna大量提取试剂盒(厂家：美基)在血浆中提取cfdna。提取步骤如下：
[0076]
(1)提取前试剂核对和准备。
[0077]
(2)先转移200μl的蛋白酶k至5～15ml的离心管。然后转移4ml样品至离心管中。
[0078]
(3)加入200μl的sds缓冲液至样品中，颠倒混匀数次。55℃温育约30分钟，其间颠倒数次。室温放置约5分钟让消化液恢复至室温。
[0079]
(4)加入7.5ml的结合液mlk和120μl的磁珠mpf，室温颠倒混匀10分钟。转移至磁力架上，静置约5分钟吸附磁珠，吸弃溶液，短暂离心后，吸尽残液。
[0080]
(5)加入1.0ml洗涤液maw1，涡旋5秒，颠倒10～15次。转移至磁力架吸附约1分钟，吸弃溶液。
[0081]
(6)重复步骤(5)一次。
[0082]
(7)加入1.0ml洗涤液mw2，涡旋5秒，颠倒10～15次。转移至磁力架吸附1分钟，吸弃溶液。
[0083]
(8)重复步骤(7)一次。
[0084]
(9)短暂离心后，吸尽残液。37℃金属浴干燥10～15分钟让磁珠完全干燥。
[0085]
(10)加入50～80μl洗脱液eb至样品中，37℃振荡温育5分钟让dna充分溶解。转移至磁力架上吸附1分钟，把dna转移至新的离心管中。
[0086]
(11)短暂离心收集残液，再把余下的dna转移至(10)的离心管中。
[0087]
2.重亚硫酸氢盐处理(bc)
[0088]
得到的cfdna用ez-96dna methylation-lightning magprep试剂盒(zymo品牌)进行重亚硫酸氢盐处理，之后进行磁珠纯化和去磺化操作，洗脱磁珠得到9.5μl重亚硫酸氢盐处理后的cfdna。具体操作步骤如表2所示。
[0089]
表2重亚硫酸盐处理步骤
[0090][0091]
3.预扩增
[0092]
对上一步bc处理后的cfdna实施预扩增操作，体系如表3所示。
[0093]
表3预扩增反应体系
[0094]
组分体积entrans 2x qpcr probe master mix(abclonal)12.5μl9基因正反向引物与6blocker mix2μl重亚硫酸盐处理后cfdna10.5μltotal25μl
[0095]
pcr反应程序设置如表4所示(pcr仪型号：biorad t100)：
[0096]
表4预扩增反应pcr程序
[0097][0098]
4.qpcr扩增
[0099]
预扩增结束后吸取预扩增产物实施qpcr实验，每个样本qpcr检测2个孔，每孔检测4个目的基因加内参基因actb。qpcr检测平台：abi7500荧光定量pcr仪。2个qpcr分组如表5所示。
[0100]
表5qpcr扩增反应分组
[0101][0102]
qpcr反应体系如表6所示。
[0103]
表6qpcr反应体系
[0104][0105][0106]
qpcr反应程序设置如表7所示。
[0107]
表7qpcr反应程序设置
[0108][0109]
5.数据分析(sum(δct)法)
[0110]
程序结束后导出qpcr文件，对每个目的基因设定阈值后导出ct值，分别与actb计算δct(δct＝该基因ct值-actb基因ct值)，并分别对每个基因计算得到的δct值设置第一cutoff值(或称：第一阈值)，例如：以指数扩增期的初始阶段拐点处作为actb的第一阈值。其他基因阈值的设定原则为：以超过阴性质控品的最高点且处于阳性质控品扩增期的拐点处的值作为第一阈值，例如：图1中所示的各个基因的阈值，以ak055957为例，其第一阈值为15.687；类似的，bend4的第一阈值为10.465；dab2ip的第一阈值为8.847；emx1的第一阈值为18.872；otx1的第一阈值为8.774；ptpn18的第一阈值为9.368。当该基因δct值大于第一cutoff值时判断为阴性，并对阴性直接赋值为δct＝25。当该基因δct值小于第一cutoff值时判断为阳性，对阳性保留原始δct值。通过此方法将每个基因的δct值加和，得到sum(δct)。通过划定的8个基因整体sum(δct)的第二cutoff值(或称：第二阈值)判断样本检测结果为肝癌阴性或者肝癌阳性，当sum(δct)小于第二cutoff值时样本判定为肝癌阳性，当sum(δct)大于第二cutoff值时样本判定为肝癌阴性。
[0111]
实施例3：方法性能验证
[0112]
共采用275例临床样本，其中包括101例肝癌样本，43例肝硬化样本，31例乙肝患者样本，100例健康人样本对照。其中肝癌样本包括28例i期，19例ii期，32例iii期，22例iv期。
[0113]
1.单一基因的检测性能对于上述8个目的基因(ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5)(“sum8marker”)中的各个基因在肝癌(lihc)样本组中的甲基化水平以及肝炎/肝硬化(benign，良性病变)样本组和健康人(healthy)样本组中的甲基化水平差异显著(如图1、图2所示)，可见上述单个基因利用甲基化差异可实现鉴别肝癌与肝硬化或肝癌与健康人。
[0114]
2.8个基因组合的检测性能(sum(δct)法)
[0115]
2.1.临床性能
[0116]
基于sum(δct)法，利用roc曲线(图3)和约登指数(图4)，如图5所示，在sum(δct)阈值为151.4时，健康人特异性(specificity)为99.0％(95％ci:93.8％-99.9％)，乙肝患者特异性为93.5％(95％ci:77.2％-98.9％)，肝硬化患者特异性为86.0％(95％ci:71.4％-94.2％)，肝癌整体敏感度94.1％(95％ci:87.0％-97.6％)，分期敏感度为：i期89.3％(95％ci:70.6％-97.2％)，ii期94.7％(95％ci:71.9％-99.7％)，iii期96.9％(95％ci:82.0％-99.8％)，iv期95.5％(95％ci:75.1％-99.8％)(如表8所示)。
[0117]
表8临床性能汇总
[0118][0119]
2.2.与afp方法的性能对比
[0120]
在上述275例临床样本(均为血液样本)中共计有230例样本有afp数据。如图6所示，利用roc曲线和约登指数计算得到afp在健康人中特异性为86.3％，敏感度为77.2％，auc(area under curve，即ro曲线下与坐标轴围成的面积)为0.969。远低于本发明提供的8个目的基因的检测性能。8个目的基因在检测afp异常(afp》22ng/ml)的肝硬化患者中保持了较高的特异性(specificity)85.7％(95％ci:56.2％-97.5％)。同时在afp正常的(afp《22ng/ml)肝癌患者保持了较高的敏感度(sensitivity)98.3％(95％ci:89.9％-99.9％)。
[0121]
3.不同基因组合的检测性能(十折交叉验证)
[0122]
4或6个基因组合的检测性能对于上述8个目的基因(ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5)(“sum8marker”)中的任意4或6个基因在肝癌(lihc)样本组中的甲基化水平以及肝炎/肝硬化(benign，良性病变)样本组和健康人(healthy)样本组中的甲基化水平进行建模分析，以得到基于4或6个基因组合的肝癌分类结果。
[0123]
3.1.样本概要
[0124]
分析数据包含了肝癌样本、健康人样本和良性病变样本(良性病变样本中包括肝炎和肝硬化样本)，上述样本均为血液样本，以分别得到“肝癌vs健康人”、“肝癌vs良性病变”的auc结果。其中，针对良性病变样本内的肝硬化样本也单独建模分析，以得到“肝癌vs肝硬化”的auc结果。
[0125]
表9 4或6个基因组合性能检测对应的样本
[0126][0127][0128]
在样本分组上，将所有样本拆分为了训练(train)集和独立验证(test)集。因此，每组auc结果包含训练集和独立验证集两部分，相应的auc结果均由十折交叉验证得到。
[0129]
3.2.分析结果
[0130]
表10 4个基因组合的auc结果
[0131]
[0132]
[0133]
[0134][0135]
从上述表格中的训练集auc(train_auc)和独立验证集auc(test_auc)在不同情形的对比来看，所有的4基因组合基本都是满足区分要求的。用于检测上述各4基因组合的试剂盒，可以由表1所示的各基因对应的正向引物、反向引物和探针依照对应关系构成。例如：ako-bend4-dab2ip-emx1，可由ako、bend4、dab2ip、emx1的正向引物、反向引物和探针共同构成。
[0136]
表11 6个基因组合的auc结果
[0137]
[0138][0139]
从上述表格中的训练集auc(train_auc)和独立验证集auc(test_auc)在不同情形的对比来看，所有的6基因组合基本都是满足区分要求的，且区分效果相对于4基因组合更好。用于检测上述各6基因组合的试剂盒，可以由表1所示的各基因对应的正向引物、反向引物和探针依照对应关系构成。例如：ako-bend4-dab2ip-emx1-otx1-ptpn18，可由ako、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18的正向引物、反向引物和探针共同构成。
[0140]
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本技术所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

技术特征：
1.一种用于评估肝癌风险和/或检测肝癌的生物标志基因组合，其中，所述生物标志基因组合包含选自ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5中的任意至少4个基因；优选地，所述生物标志基因组合包含选自表10基因组合一栏所示的任意一组中4个基因的组合；优选地，所述生物标志物基因组合包含选自ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5中的任意至少6个基因；更优选地，所述生物标志基因组合包含选自表11基因组合一栏所示的任意一组中6个基因的组合；更优选地，所述生物标志基因组合包含ak055957、bend4、dab2ip、emx1、otx1、ptpn18、rnf135和tspyl5。2.一种用于检测肝癌的试剂盒，其中，所述试剂盒包含用于检测权利要求1中所述生物标志物基因组合的甲基化水平的检测试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含内参基因的甲基化水平的检测试剂；优选地，所述内参基因为actb。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中，所述检测试剂包含用于检测所述生物标志基因组合中各个基因和/或所述内参基因甲基化水平的正向引物、反向引物和/或探针；优选地，所述正向引物包含选自seq id no:1、4、7、10、13、16、19、22和25所示的至少一个正向引物；优选地，所述反向引物包含选自seq id no:2、5、8、11、14、17、20、23和26所示的至少一个反向引物；优选地，所述探针包含选自seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24和27所示的至少一个探针；更优选地，所述检测试剂包含选自seq id no:1、4、7、10、13、16、19、22和25所示的至少一个正向引物、选自seq id no:2、5、8、11、14、17、20、23和26所示的至少一个反向引物和选自seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24和27所示的至少一个探针；更优选地，所述检测试剂包含如seq id no:1、4、7、10、13、16、19、22和25所示的正向引物、如seq id no:2、5、8、11、14、17、20、23和26所示的反向引物和如seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24和27所示的探针。5.检测如权利要求1所述的生物标志基因组合的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估个体患有肝癌的风险和/或检测肝癌。6.根据权利要求5所述的用途，其中，评估个体患有肝癌的风险和/或检测肝癌包括：(1)在来自个体的核酸样本中检测所述生物标志基因组合中每个基因的甲基化水平；(2)将所述每个基因的甲基化水平与内参基因进行比较，根据比较结果判断所述核酸样本是否具有肝癌风险或患有肝癌。7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述(2)进一步包括：计算所述生物标志基因组合中在qpcr扩增后的每个基因的ct值与内参基因的ct值的差值δct；
根据所述生物标志基因组合中的每个基因对应的差值与第一预设阈值的大小，对所述每个基因对应的差值进行标准化，得到所述生物标志基因组合中的每个基因对应的标准化差值；将所述生物标志基因组合中的全部基因对应的标准化差值求和；比较求和结果与第二预设阈值的大小，判断所述核酸样本是否具有肝癌风险或患有肝癌；优选地，当所述求和结果大于或等于所述第二预设阈值时，所述核酸样本被判定为肝癌阳性，当所述求和结果小于所述第二预设阈值时，所述核酸样本被判定为肝癌阴性。8.根据权利要求7所述的用途，所述(1)包括对经过重亚硫酸氢盐处理的所述核酸样本进行预扩增处理。9.根据权利要求7或8所述的用途，所述(1)包括：(a)从个体中提取核酸样本；(b)对所述核酸样本进行重亚硫酸氢盐处理；(c)对经过所述重亚硫酸氢盐处理的核酸样本进行预扩增处理；(d)对经过所述预扩增处理的核酸样本进行qpcr扩增。10.根据权利要求6-9任一项所述的用途，其中，所述核酸样本是包含游离dna(cfdna)的样本。

技术总结
本发明提供了一种用于评估肝癌风险和/或检测肝癌的生物标志基因组合、试剂盒和用途，其中，该生物标志基因组合包含选自AK055957、BEND4、DAB2IP、EMX1、OTX1、PTPN18、RNF135和TSPYL5中的任意至少4个基因，为肝癌形成风险的相关性评估提供了一种低成本、高精确度的方法。法。


技术研发人员：游乾承 许佳悦 周雅 李冰思 汉雨生 张之宏
受保护的技术使用者：广州燃石医学检验所有限公司
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/9/5