一株BrevibacillusaydinogluensisPMBT001及其应用的制作方法

一株brevibacillus aydinogluensis pmbt001及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株brevibacillus aydinogluensis pmbt001及其应用。


背景技术：

2.目前，高温好氧堆肥化处理是解决固体废物问题的一个重要途径，具有保护环境，节约原材料和能源、投资少、运行费用低等优点。已有的研究表明，堆肥过程中存在较长时间的高温期，在堆肥高温阶段，堆肥中绝大部分的寄生虫、虫卵、孢子和病原菌等被杀死，高温期既是有机大分子分解的主要阶段，也是保证堆肥无害化的重要阶段。在这个时期微生物极易受到高温因素的影响，其种群数量和活性会普遍降低，有机物的快速分解遭到抑制。大量的研究表明，堆体温度应控制在45℃-65℃之间，尤其是在55℃-60℃时是木质纤维素等大分子物质降解的最适温度。研究该温度范围内的微生物及其活动特性对堆肥技术的提高具有重要意义。因此，耐高温菌的研究成为了热点。在堆肥处理中接种高温菌，可增加高温期徽生物的数量，促进某些难降解有机物的快速转化，进而有效提高堆肥效率。有研究表明添加高温菌提高有机物的转化，加速堆肥进程，减少有气味的气体排放，稳定堆肥产品，提高堆肥质量。
3.农业固体废物，主要是农作物秸秆、禽畜粪便和病死畜禽尸体，含有大量的纤维素、蛋白和脂肪类物质等，其成分复杂，难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。研究表明，纤维素降解菌应用于堆肥中，能有效提高堆肥温度，加快堆肥进程，加快秸秆的降解，提高堆肥中腐殖质的含量，从而提高堆肥品质；而蛋白和脂肪降解菌应用于堆肥中，能有效降解病死畜禽尸体及畜禽粪便，消除堆肥臭气，活化养分，从而有效杀灭病原微生物，达到无害化要求。因此筛选耐高温的高效纤维素、蛋白及脂肪降解菌，将其接种至堆肥中可以促进堆肥腐熟、提高堆肥产品品质。现今关于高温菌株好氧堆肥的研究非常活跃，但以往关于高温菌株的研究主要集中于其淀粉酶活与产抗生素等方面，而关于具有纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶降解能力的高温菌株的研究还极少。
4.细菌培养周期短，生长速度快，可以依靠廉价的氮源和碳源作为能源产酶，酶表达量相对较高，相对容易获得，且酶的热稳定性好，原核表达控制系统相对简单方便。因此，细菌在降解纤维素、蛋白和脂肪方面有其独特的优势。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一株brevibacillus aydinogluensis pmbt001及其应用，本发明筛选得到的brevibacillus aydinogluensis pmbt001是一种能产纤维素酶、蛋白酶及脂肪酶的高温细菌，将该菌株应用到好氧堆肥中，可以加速粪便堆肥进程、增加养分含量。
6.为了解决现有技术存在的问题，本发明采用的技术方案如下：
7.第一个方面，本发明提供一株brevibacillus aydinogluensis pmbt001，其保藏
编号为gdmcc.no：63294；保藏单位为广东省科学院微生物研究所(广东省微生物菌种保藏中心)，保藏单位地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期为2022年03月27日。
8.进一步地，所述brevibacillus aydinogluensis pmbt001的基因序列如seq id no.1所示。
9.第二个方面，本发明提供brevibacillus aydinogluensis pmbt0011在制备微生物菌剂上的应用。
10.第三个方面，本发明提供一种微生物菌剂，含有上述第一个方面所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001。
11.进一步地，所述brevibacillus aydinogluensis pmbt001在所述微生物菌剂中的活菌数为1.0
×
10
8-5.0
×
108cfu/g。
12.优选地，所述brevibacillus aydinogluensis pmbt001在所述微生物菌剂中的活菌数为1.3
×
108cfu/g，ph值为6.0-8.0。
13.第四个方面，本发明提供上述第三个方面所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
14.将brevibacillus aydinogluensis pmbt001接种于tsb培养基中，于50-60℃、160-200r/min培养1天，得到种子液；将所述种子液按照5％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，于50-60℃160-200r/min振荡培养1-2天，得到微生物菌剂；
15.所述发酵培养基的成分为：蛋白脉7g，牛肉膏1g，氯化钠5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml。
16.第五个方面，本发明提供上述第一个方面所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001或上述第三个方面所述的微生物菌剂在制备微生物肥上的应用。
17.第六个方面，本发明提供一种微生物肥，含有上述第一个方面所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001或上述第三个方面所述的微生物菌剂。
18.第七个方面，本发明提供上述第一个方面所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001或上述第三个方面所述的微生物菌剂或上述第六个方面所述的微生物肥在粪便高温好氧堆肥化处理上的应用。
19.第八个方面，本发明提供一种高温好氧堆肥化处理方法，包括以下步骤：
20.s1：将新鲜粪肥与尿素、木屑和刨花均匀混合形成混合粪便，混合粪便最终含有质量分数为0.05-0.4％尿素、20-30％的木屑和刨花；
21.s2：按照混合粪便体积的0.3-1.0％添加上述第三个方面所述的微生物菌剂，然后采用堆垛法发酵10-30天。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.本发明以熊猫粪便为分离源，采用高温分离筛选出一株具有三种酶活用于好氧堆肥发酵的细菌菌株brevibacillus aydinogluensis pmbt001，它适宜生长的温度范围为40-70℃，具有产纤维素酶、蛋白酶及脂肪酶的功能。具有较高纤维素酶活与蛋白酶活，可在50℃高温下，达到纤维素相对酶活性21.7μmol/ml，蛋白酶相对酶活性0.26μmol/ml，脂肪酶相对酶活性10.00μmol/ml。细菌菌株pmbt001通过在昭觉县牛粪堆肥上的应用，获得能够促进堆肥效率的提高和有机废弃物利用的效果，本发明筛选高温产酶菌株为粪便降解微生物
菌剂的研发提供优势菌种，有利于解决堆肥过程中导致的空气污染、土壤污染和水体污染等问题，活化养分，提高堆肥效果，对有机废弃物的处理有较好的应用潜力。
24.本发明brevibacillus aydinogluensis pmbt001的保藏信息如下：
25.保藏编号：gdmcc.no：63294；
26.分类学名称：brevibacillus aydinogluensis；
27.保藏单位：广东省科学院微生物研究所(广东省微生物菌种保藏中心)；
28.保藏单位地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；
29.保藏日期：2022年03月27日。
附图说明
30.图1为brevibacillus aydinogluensis pmbt001在tsa培养基上的菌落形态和菌体显微图；
31.图2为基于16s rrna基因序列构建的brevibacillus aydinogluensis pmbt001系统发育树；
32.图3为brevibacillus aydinogluensis pmbt001的产酶功能测定，其中，(左)纤维素降解初筛结果；(中)蛋白降解初筛结果；(右)脂肪降解初筛结果；
33.图4为堆肥样品温度变化；
34.图5为堆肥样品c/n变化；
35.图6为堆肥样品种子发芽率(gi)变化；
36.图7为堆肥样品ph变化；
37.图8为堆肥样品全磷；
38.图9为堆肥样品全钾变化；
39.图10为堆肥过程中细菌群落的动态变化，其中a为pls-da分析图、b为门水平物种丰度柱状图、c为属水平物种丰度柱状图。
具体实施方式
40.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
41.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.本技术中：
43.胰酪大豆胨琼脂培养基(tsa培养基)：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，nacl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
44.胰酪大豆胨液体培养基(tsb培养基)：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，nacl 5g，k2hpo
4 2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
45.刚果红固体培养基：cmc-na 2.0g，kh2po
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.25g，(nh4)2so
4 1.0g，刚果红0.2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
46.碳源为cmc-na的复筛培养基：cmc-na 5.0g，kh2po
4 1.0g，nano
3 3.0g，kcl 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，fecl3·
6h2o 0.01g，蒸馏水1000ml。
47.脱脂牛奶固体培养基：酵母膏2.5g，蛋白胨2g，酸水解酪蛋白1.5g，干酪素1.5g，脱脂牛奶40g，琼脂20g，葡萄糖1g，蒸馏水1000ml。
48.蛋白酶种子培养基：葡萄糖10g，酵母粉20g，nacl 5g，k2hpo
4 1g，mgso
4 0.4g，ph7.0，蒸馏水1000ml。
49.蛋白酶基础发酵培养基：葡萄糖5g，酵母粉10g，(nh4)2so
4 1g，cacl
2 1g，nacl 1g，kh2po
4 0.5g，mgso
4 0.3g，ph7.0，蒸馏水1000ml。
50.维多利亚蓝b固体培养基：蛋白脉10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，橄榄油25ml，蒸馏水1000ml，维多利亚蓝(4mg/100ml)。
51.实施例1
52.本实施例提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂的制备方法如下：
53.将brevibacillus aydinogluensis pmbt001平板划线接种于tsa培养基，并挑取单菌落接种于tsb培养基中，于50-60℃、160-200r/min培养1天，得到种子液；将所述种子液按照5％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，于50-60℃、160-200r/min振荡培养1-2天，得到微生物菌剂，其有效活菌数为1.3
×
108cfu/g，ph值为6.0-8.0。
54.所述发酵培养基的成分为：蛋白脉5-10g，牛肉膏1g，氯化钠5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml。
55.实施例2
56.本实施例提供一种高温好氧堆肥化处理方法，包括以下步骤：
57.s1：将来自于中国四川省昭觉县的一家大型国家农场的新鲜牛粪与辅料尿素、木屑和刨花均匀混合形成混合粪便，混合粪便最终含有质量分数为0.2％的尿素、25％的木屑和刨花。混合粪便中含有质量分数为0.2％尿素、25％的木屑和刨花有助于调节碳氮比。
58.s2：按混合粪便体积的0.5％添加实施例1所述的微生物菌剂。
59.s3：混合粪便在粪肥处理厂采用堆垛法发酵14天。在整个堆肥过程中，将堆肥彻底混合两次，当堆垛温度到达50℃以上时，进行第一次翻堆；当温度高达60℃时，进行第二次翻堆，以保持好氧条件和均匀性，促进物质降解。
60.实验例1高温细菌pmbt001的分离纯化
61.1.1好氧堆肥高温细菌的分离
62.2021年于四川省都江堰熊猫中心采集熊猫粪便堆肥(堆肥温度≥50℃)，装于无菌采样袋中，封口，置于冰盒中保存，运回实验室，24h内进行分菌处理。
63.称取新鲜堆肥样品于无菌水中振荡1h，采用10倍稀释法制备成10-3-10-6
菌悬液，分别取100μl各稀释梯度菌悬液，平板涂布法，用胰酪大豆胨琼脂培养基(tsa)进行高温菌的分离培养，培养温度50℃
±
2℃，培养时间48h，期间观察菌落的生长情况并记录；挑取在此培养条件下，菌落生长迅速，菌落较大的单个的菌落转接于胰酪大豆胨琼脂培养基(tsa)中，用稀释平板划线法，纯化直至获得纯化菌株。挑取1-2个单菌落，将纯化菌株转接于胰酪大豆胨液体培养基(tsb)中，加50％甘油保存在-80℃冰箱。
64.1.2菌株鉴定
65.1.2.1菌株形态
66.挑取1-2个单菌落，接种于tsa培养基上，置于50℃培养1天，观察菌株的菌落形态。
67.1.2.2菌株的分子鉴定
68.(1)试剂：无菌双蒸水，mix(天根生化科技北京有限公司)。
69.(2)引物
70.8-27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’(seq id no.2)和
71.1492-1523r：5
’‑
tac-gacttaaccccaatcgc-3’(seq id no.3)。
72.(3)细菌dna提取
73.取少许菌体于无菌的1.5ml eppendorf管中，加入500μl的无菌双蒸水，采用液氮将离心管冷冻后，置于99℃水浴5min，取出后涡旋30s，重复上述操作1次，12000r/min离心，以上清液作为模板，并于-20℃保存；1％琼脂糖凝胶电泳检测。
74.(4)细菌16s rrna基因扩增
75.16s rrna基因扩增条件：通用引物8-27f：和1492-1523r对提取的细菌rna进行基因扩增，95℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延1.5min，30个循环，72℃总延伸20min。pcr产物经上海生工ez spin column pcr product purification kit unlq-1柱式pcr产物纯化试剂盒(sk1142-n)纯化，按操作指南进行，纯化产物送生工生物工程有限公司测序。
76.(5)16s rrna基因序列分析及系统发育树构建
77.将测序后所得序列利用blast软件在ncbi中进行相似性搜索，选取相似性最高已发表菌株的16s rrna基因序列作为参比序列，采用clustal x软件进行多序列比对分析，并通过mega 7.0软件以n-j法构建系统发育树，确定细菌的分类地位。
78.1.3实验结果
79.从熊猫粪便堆肥中分离获得细菌pmbt001，在tsa培养基上50℃培养1d后，菌落为扁平圆形，表面光滑，边缘薄，不透明，基本整齐，菌落颜色呈乳白色，易挑取。革兰氏染色阴性，好氧，菌体呈杆状，具有芽孢，一端膨大，菌体大小为2-4nm，见图1。
80.菌株pmbt001进行16s rrna序列测定，在ncbi数据库中进行blast同源性比对，该菌株与brevibacillus aydinogluensis的相似性度达100％。综合形态特征、生理生化特征以及16s rrna序列同源性分析等实验结果，鉴定pmbt001为brevibacillus aydinogluensis，见图2。
81.brevibacillus aydinogluensis pmbt001[27f]序列长度1251bp，brevibacillus aydinogluensis pmbt001的16s rrna基因序列如seq id no.1所示。
[0082]
实验例2高温细菌pmbt001的生长温度及产酶功能测定
[0083]
2.1温度生长范围测定
[0084]
取10μl甘油保藏的菌株接种于tsa培养基上进行活化培养，分别放置于30℃至80℃范围下，培养48h，观察并记录其生长情况，根据测定结果，以5℃为单元，进一步精确，直至测定出其最高生长温度与最低生长温度。
[0085]
2.2纤维素降解能力测定
[0086]
2.2.1纤维素降解能力初筛
[0087]
挑取活化后的细菌3-5个单菌落，加入3ml无菌水，制备成菌悬液，取50μl菌液均匀涂布于tsa培养基上，放置于50℃生化培养箱中培养，观察到培养基表面菌株生长均匀，用
直径为5mm的打孔器将均匀生长的菌株连同培养基一起打孔制成菌饼并接种于刚果红固体培养基上，置于50℃生化培养箱中培养3-5d后，观察培养基接菌处是否产生透明的水解圈，并测定水解圈直径，设置3个重复。
[0088]
若菌株不能在刚果红培养基上产生水解圈及产生水解圈直径不超过5mm的菌株，视为其不具备纤维素降解能力，记为-；若菌株产生水解圈直径大于5mm，视为其具备纤维素降解能力，记为+；若菌株产生水解圈直径大于3cm，视为其具备较强的纤维素降解能力，记为+++。
[0089]
2.2.2羧甲基纤维素酶(cmcase)活性测定
[0090]
将经过初筛的菌株接种于tsb培养基中，制成菌浓度约108cfu的种子菌悬液，按10％(v/v)的接种量接种于碳源为cmc-na的复筛培养基的三角瓶中，50℃恒温震荡培养，分别测定3、4、5、6、7d菌株的羧甲基纤维素酶(cmcase)活力，设置3个重复。
[0091]
(1)标准曲线的绘制
[0092]
无水葡萄糖80℃烘干至恒重制成1mg/ml标准葡萄糖溶液，取6支试管分别加入标准葡萄糖溶液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，补加蒸馏水至2.0ml，加入dns试剂1.5ml，沸水浴5min，冷却后定容至25ml，分光光度540nm下测定od值，绘制出标准曲线。
[0093]
(2)粗酶液的制备
[0094]
配制碳源为cmc-na复筛培养基分装于250ml的三角瓶中，每瓶45ml，接入5ml的种子菌悬液，置于28℃的摇床中培养，在培养7d后分别取1.5ml发酵液于离心管中，10000r/min离心10min得粗酶液。
[0095]
(3)酶活力测定
[0096]
酶活力测定方法：取0.1ml粗酶液，加入1.9ml质量分数为1％的cmc-na溶液。在45℃恒温下水解20min，加入1.5ml dns显色液进行沸水浴5min，定容至25ml，540nm处比色，测其吸光度(od)值，与标准葡萄糖曲线对照，由od值计算出葡萄糖量(m1)。另取粗酶液0.1ml，加水1.9ml，再加1.5ml dns显色液，沸水浴5min，定容至25ml，540nm处比色，测得粗酶液的葡萄糖量(m2)。将葡萄糖量(m1)减去葡萄糖量(m2)得到真正由cmc酶降解1％cmc溶液得到的葡萄糖量，由光密度值计算出的葡萄糖量a，通过公式计算纤维素分解菌在上述条件下的酶活力(单位：μmol/ml)：酶活力＝a
×
10
×
1000/20。
[0097]
2.3蛋白降解能力测定
[0098]
2.3.1蛋白降解能力初筛
[0099]
将菌株均匀地涂布于tsa培养基上，放置于50℃生化培养箱中培养，观察到培养基表面菌株生长均匀，用直径为5mm的打孔器将均匀生长的菌株连同培养基一起打孔制成菌饼并接种于脱脂牛奶固体培养基上，置于50℃生化培养箱中培养2-4d后，观察培养基接菌处是否产生透明的水解圈，并测定水解圈直径，设置3个重复。
[0100]
若菌株不能在脱脂牛奶培养基上产生水解圈及产生水解圈直径不超过5mm，视为其不具备蛋白降解能力，记为-；若菌株产生水解圈直径大于5mm，视为其具备蛋白降解能力，记为+；若菌株产生水解圈直径大于3cm，视为其具备较强的蛋白降解能力，记为+++。
[0101]
2.3.2菌株蛋白酶活性测定
[0102]
(1)标准曲线的绘制
[0103]
配置l-酪氨酸标准液，在稀释为100μg/ml后立即进行测定。分别取稀释后溶液各
1ml，各加0.4mol/l碳酸钠溶液5ml、1mol/l folin-酚试剂溶液1ml，振荡均匀，于40℃水浴中显色20min，分光光度计于680nm，分别测其吸光度，以吸光度a为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，利用回归方程，计算当吸光度为1时的酪氨酸量(μg)，即为吸光常数k值，k值应在95～100。
[0104]
(2)粗酶液的制备
[0105]
挑取1环保存至斜面上的纯培养物接种至蛋白酶种子培养基，50℃于摇床150rmp培养12h，按1％(v/v)接种于蛋白酶基础发酵培养基，50℃摇床150rmp培养48h后离心取上清进行酶活测定。
[0106]
(3)酶活力测定
[0107]
采用folin-酚法对粗酶液进行酶活测定。酶活力单位定义：40℃下，每分钟水解酪蛋白底物产生1μg酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。将质量分数2％酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中，预热5min；取1ml粗酶液加入1ml预热好的酪蛋白溶液中混匀后放入40℃水浴中保温10min后加入2ml 0.4mol/l三氯乙酸终止反应，取1ml上清液加入0.4mol/l na2co
3 5ml，加入1ml folin-酚试剂至40℃水浴显色20min后于660nm下测定吸光值，以加水的反应体系为空白。
[0108]
计算酶活：从标准曲线上读出最终稀释液的酶活力，单位u/ml，原液的酶活力按照下式计算：蛋白酶的活力(u/ml)＝a
×k×4÷
10
×
n。
[0109]
式中：a：发酵原液的平行实验的od值；k：吸光常数；n：蛋白酶的液的稀释倍数；4：反应试剂的总体积；10：反应时间10min；所得结果表示至整数。
[0110]
2.4脂肪降解能力测定
[0111]
2.4.1脂肪降解能力初筛
[0112]
以维多利亚蓝b为指示剂，遇酸变蓝。脂肪酶产生菌可产生脂肪酶，脂肪酶可以分解加入培养基中的橄榄油，使其转变成脂肪酸，维多利亚蓝b遇酸变蓝。所以可以根据所产生的变色圈的大小来判断其产脂肪酶的能力。
[0113]
将菌株均匀地涂布于tsa培养基上，放置于50℃生化培养箱中培养，观察到培养基表面菌株生长均匀，用直径为5mm的打孔器将均匀生长的菌株连同培养基一起打孔制成菌饼并接种于维多利亚蓝b固体培养基上，置于50℃生化培养箱中培养2-4d后，观察培养基接菌处是否产生蓝色，并测定变色圈直径，设置3个重复。
[0114]
若菌株不能在维多利亚蓝b培养基上产生变色圈及产生变色圈直径不超过5mm，视为其不具备脂肪降解能力，记为-；若菌株产生变色圈直径大于5mm，视为其具备脂肪降解能力，记为+；若菌株产生变色圈直径大于3cm，视为其具备较强的脂肪降解能力，记为+++。
[0115]
2.4.2菌株脂肪酶活性测定
[0116]
取100ml锥形瓶若干个，一个作为对照瓶，其他的为测定瓶，具体方法如表1。
[0117]
表1 脂肪酶活力测定方法
[0118][0119]
用0.05m标准氢氧化钠溶液滴定至微红色，记录滴定用去naoh溶液的体积。
[0120]
计算：脂肪酶比活力以在ph值7.5和40℃条件下，1g脂肪酶水解脂肪每分钟产生1μmol脂肪酸的酶量定义为一个酶活性单位。
[0121][0122]
式中：a为样品耗碱液(m1)；b为对照组耗碱液(m1)；n为碱液的浓度，即0.05μmol；f为粗酶液最终稀释倍数；t为作用时间(min)。
[0123]
2.5实验结果
[0124]
经测定，细菌brevibacillus aydinogluensis pmbt001的温度生长范围为40-70℃，并具有产纤维素酶、蛋白酶及脂肪酶的能力，结果如图3、表2所示，纤维素相对酶活性21.7μmol/ml，蛋白酶相对酶活性0.26μmol/ml，脂肪酶相对酶活性10.00μmol/ml。结果表明，高温细菌菌株pmbt001具有较好的耐高温和产酶能力，具有进一步开发应用的潜力。
[0125]
表2 菌株pmbt001产酶能力
[0126][0127]
实验例3细菌菌株pmbt001在牛粪中的应用
[0128]
3.1堆肥原料和过程
[0129]
新鲜牛粪来自于中国四川省昭觉县的一家大型国家农场。将新鲜粪肥与辅料尿素、木屑和刨花均匀混合形成混合粪便，混合粪便最终含有质量分数为0.2％的尿素、25％的木屑和刨花，将混合粪便随机分为3组，第一组不添加任何微生物接种剂作为空白对照组(ck)，第二组按体积的0.5％添加实施例1制备的微生物菌剂(pmbt001组)，第三组按体积的0.5％添加含有细菌菌株bacillus.sp y3的微生物菌剂(y3组)。参考文献为曾敏.畜禽粪便源芽孢杆菌多样性及对铜耐受性研究[j].环境科学学报，2023年，43(2)：485-495。混合粪便在粪肥处理厂采用堆垛法发酵14天。采用自动温度计监测上午8：00和下午6∶00的堆肥粪便日温度(tm)变化，并于第1、3、5、7、9、11、13、14天收集温度计周围的堆肥(三份/天)，分析其理化性质和微生物特征。在整个堆肥过程中，将堆肥彻底混合两次，当堆垛温度到达50℃以上时，进行第一次翻堆；当温度高达60℃时，进行第二次翻堆，以保持好氧条件和均匀性。
[0130]
3.2理化性质分析
[0131]
按照中国有机肥料农业行业标准(ny/t 525-2021)，对堆肥样品的ph、有机质(om)、总氮(n)、总磷(p2o5)、总钾(k2o)和种子萌发指数(gi)等理化性质进行分析。用ph计(inesa phsj-3f，china)检测1∶5水溶液的ph值。采用重铬酸钾滴定法测定了堆肥样品中有机质含量。0.25g风干粪肥在浓h2so4和h2o2中消化，测定总n、p2o5和k2o。用凯氏定氮法测定总氮，用钼蓝比色法测定总p2o5。用火焰光度法测定总k2o。所有实验均测定3次。
[0132]
3.3高通量测序分析
[0133]
3.3.1 16s rrna v3-v4测序流程
[0134]
0.25-0.3g堆肥样品，采用粪便基因组dna提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行dna的提取，并采用超微量紫外分光光度计检测dna的纯度和浓度；取质量合格的基因组dna样品30ng及对应的融合引物
[0135]
338f：5
’‑
actcctacgggaggcagcag-3’(seq id no.4)和
[0136]
806r：5
’‑
ggactachvgggtwtctaat-3’(seq id no.5)配置pcr反应体系，设置pcr反应参数进行pcr扩增，使用agencourt ampure xp磁珠对pcr扩增产物进行纯化并溶于elution buffer，贴上标签，完成建库。使用agilent 2100 bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小，选择hiseq平台进行测序。
[0137]
3.3.2高通量测序信息分析流程
[0138]
下机数据过滤，剩余高质量的clean data用于后期分析；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成tags；将tags聚类成otu并与数据库比对、物种注释；基于otu和注释结果进行样品物种复杂度分析，组间物种差异分析，以及关联分析与模型预测等。
[0139]
3.4结果
[0140]
3.4.1理化结果
[0141]
(1)堆肥过程中堆肥样品温度变化如图4所示，由图4可知，实验组(pmbt001组)堆体升温更迅速，在粪便堆肥开始后的第3天迅速进入嗜热期并保持稳定，较ck(无菌组)和实验组(y3组)更快达到嗜热阶段，且能够维持更长的高温期。结果表明，在本研究中，在好氧堆肥中加入pmbt001细菌制剂可以加速粪便堆肥进入嗜热阶段并维持堆肥温度。
[0142]
(2)堆肥过程中堆肥样品c/n变化如图5所示，由图5可知，有机物一般在堆肥过程中被微生物腐殖化或矿化，加速碳以co2形式的损失。因此，堆肥样品中c/n比值的变化反映了堆体中微生物活性。如图5所示，两组堆体中c/n持续下降，ck组、y3组和pmbt001组分别从20.90、22.76和20.19下降至17.08、19.70和12.46，分别下降了3.82、3.06和7.73个数量级。这一结果是由于微生物在亲热相中对碳质化合物有很强的矿化作用。值得注意的是，pmbt001组中的c/n在14d内较ck组发生了更加显著变化，表明pmbt001组中微生物活动更加活跃。
[0143]
(3)堆肥过程中堆肥样品种子发芽率(gi)变化如图6所示，由图6可知，gi是反映堆肥成熟度的用指标。结果表明，ck组的gi在整个堆肥过程中持续下降，从第1天的79.41％下降到第14天的34.46％(图6)，说明堆肥过程中有害物质的积累抑制了种子的萌发。y3组的gi虽然在第7天到第9天有所上升，但总体呈下降趋势，堆肥阶段结束后，y3组的gi从71.29％下降到37.04％。而pmbt001的gi呈先减小后增大的趋势，说明堆肥阶段结束后，堆肥堆中的有害物质被清除。第14天，pmbt001(98.63)的gi均大于80％，表明堆肥成熟。这一
结果也说明，pmbt001可以加速粪便堆肥过程。
[0144]
(4)堆肥过程中堆肥样品ph变化如图7所示，由图7可知，ck组ph值在7.34-7.67之间，y3组ph值在7.52-7.76之间，pmbt001组ph值在7.21-7.42之间，ck组和y3组ph值略高于pmbt001组，但三组ph变化均不显著。
[0145]
(5)堆肥过程中堆肥样品全磷、全钾变化如图8、9所示，由图8、9可知总养分(全磷、全钾)随堆肥过程逐渐增加，pmbt001组堆肥样品中养分含量更丰富。pmbt001组的总磷和总钾在第14天均显著高于ck组和y3组。
[0146]
3.4.2高通量测序结果
[0147]
(1)总体菌群变化：采用高通量测序方法分析了堆肥过程中细菌群落的动态变化。如图10所示，ck组、y3组和pmbt001组总共分别获得2671、2508个和2509个otus。基于otu数据的pls-da分析表明，堆肥过程中微生物群落发生了较大变化；ck组和细菌添加组分离，说明细菌添加对发酵过程中菌群变化影响较大。
[0148]
在堆肥初始阶段，每个样品中的四种优势细菌分别是变形菌门(proteobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、厚壁菌门(firmicutes)和螺旋毛菌门(spirochaetes)。两组中变形菌门的相对丰度下降，厚壁菌门的相对丰度增加很多。pmbt001组的厚壁菌门相对丰度在堆肥第7天激增至68.39％，在第14天下降至36.69％，而ck组的厚壁菌门相对丰度在整个堆肥过程中缓慢增加(ck：16.68-42.24％)，y3组的厚壁菌门相对丰度在整个堆肥过程中持续增加(y3：6.56-54.49％)。ck组和y3组的拟杆菌门相对丰度持续下降，pmbt001组先下降后升高。
[0149]
在堆肥过程中，微生物群落在属水平上变化较大，大多数属的丰度下降。初始阶段的优势细菌属为pseudomonas、acinetobacter、petrimonas、sphaerocheta、bacteroides和arcobacter。随着堆肥过程的进行，acinetobacter、petrimonas、sphaerocheta、bacteroides和arcobacter的相对丰度基本下降。
[0150]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一株brevibacillus aydinogluensis pmbt001，其特征在于，其保藏编号为gdmcc.no：63294；保藏单位为广东省科学院微生物研究所(广东省微生物菌种保藏中心)，保藏单位地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期为2022年03月27日。2.根据权利要求1所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001，其特征在于，其基因序列如seq id n0.1所示。3.权利要求1或2所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001在制备微生物菌剂上的应用。4.一种微生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1或2所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001。5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于：所述brevibacillus aydinogluensis pmbt001在所述微生物菌剂中的活菌数为1.0
×
10
8-5.0
×
108cfu/g。6.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于：所述brevibacillus aydinogluensis pmbt001在所述微生物菌剂中的活菌数为1.3
×
108cfu/g，ph值为6.0-8.0。7.权利要求4-6任一项所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将brevibacillus aydinogluensis pmbt001接种于tsb培养基中，于50-60℃、160-200r/min培养1天，得到种子液；将所述种子液按照5％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，于50-60℃160-200r/min振荡培养1-2天，得到微生物菌剂；所述发酵培养基的成分为：蛋白脉5-10g，牛肉膏1g，氯化钠5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml。8.权利要求1或2所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001或权利要求4-5任一项所述的微生物菌剂在制备微生物肥上的应用。9.一种微生物肥，其特征在于：含有权利要求1或2所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001或权利要求4-5任一项所述的微生物菌剂。10.权利要求1或2所述的brevibacillus aydinogluensis pmbt001或权利要求4-5任一项所述的微生物菌剂或权利要求9所述的微生物肥在粪便高温好氧堆肥化处理上的应用。

技术总结
本发明涉及一株Brevibacillus aydinogluensis PMBT001及其应用，其保藏编号为GDMCC.No：63294；保藏单位为广东省科学院微生物研究所(广东省微生物菌种保藏中心)，保藏单位地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期为2022年03月27日。所述Brevibacillus aydinogluensis PMBT001的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以熊猫粪便为分离源，采用高温分离筛选出一株具有三种酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它适宜生长的温度范围为40-70℃，具有较高纤维素酶活与蛋白酶活，可在50℃高温下，达到纤维素相对酶活性21.7μmol/mL，蛋白酶相对酶活性0.26μmol/mL，脂肪酶相对酶活性10.00μmol/mL。脂肪酶相对酶活性10.00μmol/mL。脂肪酶相对酶活性10.00μmol/mL。


技术研发人员：赵珂 曲静雯 涂国荣 邹立扣 巫嘉伟 陈庸辉 付静霞 戢林 李果 白林 沈飞
受保护的技术使用者：四川新程悦景生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/9/5