人参皂苷在制备治疗肩袖撕裂和/或改善肩袖撕裂患者预后药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及人参皂苷在制备治疗肩袖撕裂和/或改善肩袖撕裂患者预后药物中的应用。


背景技术：

2.肩部疼痛在所有因为骨骼肌疼痛而就诊的症状中排在第三名，而肩袖撕裂是导致肩部疼痛的主要病因之一。肩袖撕裂后，肩袖肌群将会出现肌肉间脂肪浸润(fatty infiltration,fi)和肌肉纤维化等退变，而fi和肌肉纤维化会严重影响肩关节功能，减弱肩袖肌群力量，增加患者疼痛程度。而大量的临床研究发现，即使在成功的肩袖修复手术之后，肩袖肌群中的fi和肌肉纤维化依然存在，并且与不良的功能预后以及再撕裂风险相关。然而目前临床指南中没有给予任何有效的方案进行肩袖撕裂手术后肌肉退变的管理。因此，找到改善肩袖撕裂手术后患者不良预后的治疗手段显得尤为关键。
3.人参(panax ginseng ca mey)是一种使用历史悠久的中草药成分，在多年前的《本草纲目》中已有其使用记载。人参具有抗癌、增强免疫系统功能、预防心脑血管疾病、促进健康等多种作用，在世界范围内被广泛的使用。人参皂苷是人参中提取出的有效的提取成分。人参皂苷可以通过调节氧化应激、炎症反应、自噬、抗细胞凋亡等作用调控糖尿病、心血管疾病、癌症、代谢综合征等疾病和病理状态。
4.现有技术cn202210041184.0指出，包含人参提取物的用于促进肌肉分化及预防肌肉损伤的组合物、食品组合物及药物组合物可用于促进肌肉分化及预防肌肉损伤。这些肌肉分化过程中发生的问题而出现的肌肉疾病之一的肌肉减少症是因恶液质(cachexia)而引起的。恶液质是一种慢性消耗性复合综合征，其指可见于癌症、结核和血友病等的晚期的高度的全身衰弱症状。尤其，恶液质的发生伴随恶性肿瘤、慢性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭等慢性病，并出现伴随食欲减退的体重减少、肌肉量和体脂减少、炎症反应等。这种恶液质引起的肌肉减少表现为骨骼肌量的持续减少和功能受损引起的复合综合征，与出现肌肉量逐渐且缓慢地流失的衰老及肌肉分化障碍引起的肌肉减少疾病不同，出现急性肌肉减少症状。此发明通过包含人参的非皂苷基成分来促进肌肉分化，并可通过增加与肌肉调节相关的蛋白质的表达来使受损肌肉的恢复加速进行。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供人参在制备治疗肩袖撕裂和/或改善肩袖撕裂患者预后药物中的应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
7.人参皂苷在制备治疗肩袖撕裂和/或改善肩袖撕裂患者预后药物中的应用。
8.优选的，所述应用包括：改善肩袖撕裂术前或术后出现的冈上肌退变。
9.优选的，所述应用包括：改善肩袖撕裂术前或术后出现的肩袖肌脂肪浸润、肌肉纤
维化。
10.优选的，所述应用包括：改善肩握力、步幅、平衡能力、行走速度、步行周期和右前足迹平均强度。
11.优选的，所述人参皂苷包括rb1、rc、rd、rf和rg2。
12.优选的，所述治疗肩袖撕裂和/或改善肩袖撕裂患者预后药物为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂制剂中的一种，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：peg6000，peg4000，虫蜡等。
13.下面对本发明做进一步的解释：
14.本发明在小鼠体内制造出模拟临床病人出现肩袖撕裂术后肌肉退变的模型。目前在小鼠体内有多种模型可以用于研究肩袖撕裂后产生的fi和纤维化现象。其中常见的模型有物理手术损伤模型，化学损伤模型、肥胖小鼠模型以及老年模型等。发明人课题组前期进行了多种动物造模的研究，发现小鼠冈上肌肌腱撕裂模型(tendon tear,tt)能较好的模拟肩袖撕裂后冈上肌出现的fi、纤维化等退变。tt造模后六周时检测小鼠冈上肌，油红o染色检测发现tt造模组小鼠冈上肌内的脂滴大小及数量较对照组明显增多，masson三色染色检测发现tt组冈上肌间纤维含量较对照组增加，同时肌肉横截面积较对照组减小。此外，步态分析仪器分析发现造模后小鼠的前肢握力、步幅、平衡能力等肩关节能力较对照组有所减弱。以上研究说明在小鼠进行了tt造模后，其肩关节fi、纤维化以及肩关节功能随着时间的推移有逐渐恶化的趋势，与临床肩袖撕裂患者出现的肩袖肌术后退变情况较为一致。因此选择tt模型作为本研究主要的小鼠模型。
15.对tt造模的c57小鼠使用多种人参皂苷组分(rb1、rc、rd、rf、rg2)进行了为期六周的治疗后取冈上肌进行检测，油红o染色发现与对照组相比，rb1、rf治疗组小鼠冈上肌内的脂滴较对照组及其他人参皂苷组分治疗组，其大小、数量均有减少。masson染色发现rb1治疗组的肌肉间纤维含量减少，且肌肉纤维横截面积较对照组及其余组增加。这说明人参皂苷rb1对于损伤后冈上肌fi、肌肉纤维化有着明显的改善作用，且很大程度上改善了fi和肌肉纤维化造成的冈上肌萎缩损伤。此外，通过小鼠步态分析检测发现给予人参皂苷rb1治疗后，小鼠的步行速度、患肢握力、步幅、步行周期及转棒时间均有所改善。以上研究说明，人参皂苷rb1治疗可以改善肩袖撕裂术后出现的冈上肌退变。
附图说明
16.图1为对小鼠进行假手术干预以及冈上肌肌腱撕裂(tt)干预6周后的油红o染色和马松染色及步态分析结果图。
17.图2为不同人参皂苷亚型对于小鼠肩袖肌脂肪浸润及纤维化的治疗效果；
18.图3为不同浓度人参皂苷rb1对于冈上肌脂肪浸润、纤维化及肩关节功能的影响。
具体实施方式
19.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
20.以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：
21.实施例1
22.(1)冈上肌肌腱撕裂模型造模
23.对50只于湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买的六周龄c57/bl6小鼠进行了冈上肌肌腱撕裂模型造模，造模前，将小鼠在饲养条件中喂养适应1周(自由饮水、进食，保持温度恒温在18-22摄氏度，相对湿度50％-70％，每日日光灯照射十二小时，黑灯十二小时。)，并将不同处理条件小鼠分笼后使用耳标标记并记录每只小鼠的编号。确保每只小鼠的形态参数和体液参数均正常后，使用0.4ml/100g计量的2％戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉后将小鼠置于侧卧位，通过肩部的前外侧部分做一个纵向切口，展露出三角肌，将三角肌切开后展露出小鼠冈上肌肌腱。使用手术刀小心的在冈上肌腱与肱骨大结节处进行离断，在确保肱骨大结节与冈上肌肌腱完全离断后，使用5-0缝合线缝合小鼠皮肤切口，使用电吹风保持小鼠体温以避免造模创伤引起小鼠死亡。
24.tt造模后三周时检测小鼠冈上肌，油红o染色检测发现tt造模组小鼠冈上肌内的脂滴大小及数量较对照组明显增多，masson三色染色检测发现tt组冈上肌间纤维含量较对照组增加，同时肌肉横截面积较对照组减小。此外，步态分析仪器分析发现造模后小鼠的前肢握力、步幅、平衡能力等肩关节能力较对照组有所减弱。而在六周时，tt造模组小鼠的冈上肌内脂肪含量和纤维含量的增加以及肩关节功能的下降较对照组更为明显。以上研究说明在小鼠进行了tt造模后，其肩关节fi、纤维化以及肩关节功能随着时间的推移有逐渐恶化的趋势，与临床肩袖撕裂患者出现的肩袖肌术后退变情况较为一致。说明造模成功。因此选择tt模型作为本研究主要的小鼠模型。
25.(2)小鼠人参皂苷给药
26.在tt小鼠造模后对造模成功的小鼠进行腹腔注射人参皂苷，给药的同时使用普通维持饲料喂养，给予充足水分，保持温度恒温在18-22摄氏度，相对湿度50％-70％，每日日光灯照射十二小时，黑灯十二小时。分为如下四组进行处理：
27.1.假手术组(sham)5只。于冈上肌上皮肤切开后，拨开冈上肌上覆盖的三角肌，显露出冈上肌后，关闭皮肤切口并缝合切口。
28.2.冈上肌肌腱撕裂组+dmso对照组(tt+dmso)：于冈上肌上皮肤切开后，拨开冈上肌上覆盖的三角肌，显露出冈上肌后，在肱骨头处将冈上肌腱与肱骨头完全离断，关闭切口，缝合。每只小鼠每天腹腔注射100ul5％dmso。
29.3.低浓度人参皂苷(tt+rb1 20μmol/kg)：对小鼠tt造模后，将人参皂苷rb1溶于5％dmso后使用生理盐水稀释，每只小鼠注射浓度为20μmol/kg。
30.4.高浓度人参皂苷(tt+rb1 60μmol/kg、tt+rc 60μmol/kg、tt+rd 60μmol/kg、tt+rf 60μmol/kg、tt+rg2 60μmol/kg)：对小鼠tt造模后，将人参皂苷rb1(rc、rd、rf、rg2)溶于
5％dmso后使用生理盐水稀释，每只小鼠注射浓度为60μmol/kg。
31.将人参皂苷溶解于pbs溶液中，使用10ml注射器于小鼠右侧腹部斜行进针，回抽无血后，缓缓推入人参皂苷溶液。注射后观察小鼠状态，确定1.小鼠注射药物后，注射部位没有产生皮丘(注射部位错误)。2.小鼠注射药物后，没有液体从皮肤渗出(液体没有成功注射进入腹腔)。3.小鼠注射后可以正常活动，没有出现拒绝进食、拒绝行走等症状(进针没有造成小鼠的内脏器官损伤)。每给药五天停两天，总共给药6周后进行对小鼠进行步态分析检测其肩关节功能改变，接下来处死小鼠后取小鼠造模侧及对照测冈上肌进行检测。
32.(3)冈上肌取材及保存
33.1)配置黄芪胶：使用自来水配置10％的黄芪胶，充分搅拌后置于4摄氏度静止过夜，即可获得均匀黄芪胶胶质物。
34.2)记录小鼠编号后，快速脱颈处死小鼠后，从小鼠背侧剪开小鼠皮肤，由头部将小鼠皮肤剥下暴露下部肌肉组织。小心分离肩关节周围脂肪组织后暴露小鼠三角肌。将三角肌和部分覆盖的背阔肌剥除后，暴露冈上肌。使用眼科剪沿肩胛冈分离冈上肌与其余肩袖肌以及肩胛骨间的筋膜结构，分别在止点肱骨头处和起点冈上窝内侧将冈上肌离断，即可获得一侧完整冈上肌。对侧同样操作。取小鼠完整两侧冈上肌，置于冰上带盖培养皿中短暂保存。
35.3)电子天平记录小鼠冈上肌湿肌重，计算小鼠冈上肌湿肌重变化率。
36.4)肌肉固定：使用镊子夹取适量黄芪胶胶质物置于木片上(木片直径20mm，木片厚3-5mm)，将完整的冈上肌用小镊子夹取其肌腱侧(肱骨头止点)，将肌腱侧埋于黄芪胶胶质物中，剩余肌肉保持与木片垂直。确定肌肉不会脱离后即为成功固定。
37.5)肌肉速冻：装有异戊烷的烧杯浸入液氮中，待底部出现白色固体后，将肌肉浸入异戊烷中。此时肌肉已事先用黄芪胶固定于木片上。静止冷冻1min。
38.6)速冻完成后的肌肉样本可使用50ml离心管密封后于-80摄氏度环境长期保存。
39.(4)马松(masson)染色，依次进行以下步骤：
40.1)溶液配制：p/p酸溶液：1.25g磷钼酸+1.25g磷钨酸溶于100ml去离子水中，新鲜配置的p/p酸溶液呈柠檬黄色。
41.2)新鲜肌肉冰冻切片浸入bouin固定液中，室温固定过夜(16-20h)。自来水室温浸泡至黄色基本完全褪去，用时大约20-30min。
42.3)立春红品红染液(solarbio试剂盒)浸染30min-2h。自来水反复浸洗后浸泡10min，以尽量洗去红色。
43.4)p/p酸浸染5-7min。
44.5)将切片从p/p酸中取出后，用手握住切片未浸入染色缸的一侧，于废液缸上甩干6-10次，观察切片上黄色的p/p酸溶液基本干燥(没有流动的p/p酸溶液)后即可。将切片浸入苯胺蓝染色液30s-1min。自来水反复浸洗，洗去浮色。
45.6)脱水，透明：依次进行浸泡95％乙醇5-10s，无水乙醇5-10s，无水乙醇1min，二甲苯3min*2。浸泡时可上下拉动染色架避免切片表面形成液膜影响脱水透明效果。
46.7)中性树脂购买自北京酷莱博科技有限公司。使用一次性巴氏吸管吸取100ul(一滴)中性树脂液体后，滴在切片的组织样本上，用镊子夹取盖玻片从一侧斜45度与中性树脂接触后，缓缓将另一侧放下，避免盖玻片与中性树脂中产生气泡影响观察。使用滤纸拭去多
余中性树脂溶液，用螺母压在盖玻片上待中性树脂凝固后即可观察。显微镜下观察。
47.(5)油红o染色
48.1)配置溶液：油红o溶液：饱和油红o染色液按3:2(油红o：去离子水)加入去离子水，充分混匀，室温静置5-10min，过滤后即可使用。
49.2)新鲜冰冻切片使用4％多聚甲醛溶液固定5-10min；
50.3)自来水充分浸洗，60％异丙醇浸洗2-3s；
51.4)油红o染液浸泡染色10min；
52.5)自来水多次浸洗洗去浮色；
53.6)60％异丙醇浸泡分化至间质清晰，可在镜下观察控制至脂肪组织呈鲜红色，间质无色时为适宜，新鲜配置的60％异丙醇分化时间约3-5秒，多次回收后使用的异丙醇分化时间约为10s。自来水充分浸洗；
54.7)使用去离子水配置10％的甘油溶液后，使用一次性巴氏吸管吸取100ul(一滴)10％甘油液体后，滴在切片的组织样本上，用镊子夹取盖玻片从一侧斜45度与甘油接触后，缓缓将另一侧放下，避免盖玻片与甘油中产生气泡影响观察。使用滤纸拭去多余甘油溶液，即可镜下观察。若不能马上镜下观察，可置于4℃冰箱中保存12小时，或使用无色透明指甲油严密涂抹于盖玻片边缘进行密封。据观察，若密封良好，最长可于室温保存1周，4℃保存1月。
55.(6)步态分析
56.在造模并给予人参皂苷治疗六周后，使用大小鼠步态分析实验系统进行小鼠步态分析。大小鼠步态分析实验仪器以一个1.2米长的高架透明玻璃板为跑道，在玻璃板一侧通过荧光投射装置将荧光投射到玻璃板内部，测试过程中，当有动物踏上玻璃板后因自身重力会使玻璃板产生形变，改变小鼠站立位置玻璃板光线折射率，从而使光线投射位置发生改变。在玻璃板下方装有一个高速摄像机(100帧每秒)，使用步态分析软件gaitanalysis6.0(北京康森益友生物科技有限公司)拍摄视频，可以分辨光线的细微变化并记录下被测设小鼠步态的各项数据。步态分析测试前需对小鼠进行连续三天的训练，训练方法如：将小鼠置于步态分析仪器起点处，将其饲养笼盒置于步态分析仪器终点处。帮助动物跑向笼盒(必要时可使用镊子等工具辅助动物跑向笼盒。一天训练3-5次，每次训练30-60min)，确定在三天的训练后小鼠可以快速的跑向笼盒即可以开始测试。让他们可以适应环境，并快速穿过玻璃板跑道走向它们的饲养笼盒。测试前，通过摄像机记录动物的行走模式，如果动物未能在5秒内完成跑完全程，或在跑步过程中出现倒退行走，则需要再训练3天后重新测试，直至可成功完成测试过程。
57.(7)转棒测试
58.转棒测试仪主体为一根旋转棒(直径75毫米)，分为四个隔间，一次可对四只小鼠进行测试。测试前进行3到4天的适应训练。将小鼠置于转棒上5分钟左右，待小鼠适应并稳定后，设定转棒参数为转速10rpm，小鼠自转棒掉落自动记录时间，截止时间为240秒。小鼠休息5分钟左右，重复训练，每天训练5次，待动物转棒维持时间稳定后即可开始测试。测试操作保持与训练操作相同。收集3-5次测试时间并取平均值，异常掉落不计入测试次数。
59.试验结果及分析：
60.图1为对小鼠进行假手术干预以及冈上肌肌腱撕裂(tt)干预6周后的油红o染色和
马松染色及步态分析结果图。其中，假手术组(sham)和冈上肌肌腱撕裂组(tt)的(1a)油红o和masson染色；(1b)油红o染色脂肪面积占比；(1c)马松染色纤维面积占比；(1d)步幅长度；(1e)握力大小；(1f)转棒时间长度；(1g)行走速度；(1h)步行周期；(1i)右前足迹平均强度。**代表p《0.01，***代表p《0.001。
61.说明在对小鼠冈上肌进行了tt造模后6周时，小鼠的冈上肌内出现了明显的脂肪浸润和纤维化等病变，并且其肩关节功能出现了明显的恶化(行走速度、步幅长度、转棒时间、握力、足迹平均强度下降，步行周期上升)。
62.图2为在tt造模的c57小鼠内使用多种人参皂苷组分(rb1、rc、rd、rf、rg2)进行了为期六周的治疗后取冈上肌进行检测，其中，分别使用(2a，2b)dmso；60μmol/kg(2c，2d)人参皂苷rb1；(2e，2f)人参皂苷rc；(2g，2h)人参皂苷rd；(2i，2j)人参皂苷rf；(2k，2l)人参皂苷rg2干预后结果；(2m)冈上肌脂肪占比统计图；(2n)冈上肌纤维占比统计图。分别比较人参皂苷各组分与tt组之间的差别，**代表p《0.01，***代表p《0.001。油红o染色发现与对照组相比，rb1、rf治疗组小鼠冈上肌内的脂滴较对照组及其他人参皂苷组分治疗组，其大小、数量均有减少。masson染色发现rb1治疗组的肌肉间纤维含量减少，且肌肉纤维横截面积较对照组及其余组增加。这说明人参皂苷rb1对于损伤后冈上肌fi有着明显的改善作用，且在一定程度上改善了fi造成的冈上肌萎缩损伤。其他四种人参皂苷rc、rd、rf、rg2不能改善fi造成的冈上肌萎缩损伤。
63.图3为在对小鼠进行假手术干预以及冈上肌肌腱撕裂(tt)干预及高低浓度人参皂苷rb1干预6周后的油红o染色和马松染色及步态分析结果图。
64.假手术组(sham)、冈上肌肌腱撕裂组(tt)、低浓度rb1处理组和高浓度处理组的(3a)油红o和masson染色；(3b)油红o染色脂肪面积占比；(3c)马松染色纤维面积占比；(3d)步幅长度；(3e)握力大小；(3f)转棒时间长度；(3g)行走速度；(3h)步行周期；(3i)右前足迹平均强度。**代表p《0.01，***代表p《0.001。
65.从图3可以看出，不管是油红o染色脂肪面积占比、松染色纤维面积占比、步幅长度、握力大小、转棒时间长度、行走速度、步行周期还是右前足迹平均强度，高浓度人参皂苷rb1组的效果均明显优于低浓度人参皂苷rb1和造模组。
66.说明在使用高浓度人参皂苷rb1干预后，肩关节的功能及肌肉退变均有明显好转。
67.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种人参皂苷在制备治疗肩袖撕裂和/或改善肩袖撕裂患者预后药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：改善肩袖撕裂术前或术后出现的冈上肌退变。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：改善肩袖撕裂术前或术后出现的肩袖肌脂肪浸润、肌肉纤维化。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：改善肩握力、步幅、平衡能力、行走速度、步行周期和右前足迹平均强度。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷包括rb1、rc、rd、rf和rg2。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗肩袖撕裂和/或改善肩袖撕裂患者预后药物为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂制剂中的一种。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗肩袖撕裂和/或改善肩袖撕裂患者预后药物还包括药学可接受的辅料。

技术总结
本发明属于医药技术领域，具体涉及人参皂苷在制备治疗肩袖撕裂和/或改善肩袖撕裂患者预后药物中的应用。本发明在小鼠体内制造出模拟临床病人出现肩袖撕裂术后肌肉退变的模型后，对TT造模的鼠使用多种人参皂苷组分(Rb1、Rc、Rd、Rf、Rg2)进行了为期六周的治疗后取冈上肌进行检测，验证得到人参皂苷Rb1对于损伤后冈上肌FI、肌肉纤维化有着明显的改善作用，且很大程度上改善了FI和肌肉纤维化造成的冈上肌萎缩损伤。此外，通过小鼠步态分析检测发现给予人参皂苷Rb1治疗后，小鼠的步行速度、患肢握力、步幅、步行周期及转棒时间均有所改善。以上研究说明，人参皂苷Rb1治疗可以改善肩袖撕裂术后出现的冈上肌退变。裂术后出现的冈上肌退变。


技术研发人员：印岳松 杨易安 李征 沈民仁 吴松
受保护的技术使用者：中南大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/9/7