肽交联剂以及通过该交联剂交联的交联肽

1.本发明涉及一种交联肽的制备方法等。


背景技术：

2.蛋白质药物及肽药物是目前最受关注的生物药物产品之一。尤其是近年来，以igg抗体为中心的抗体药物或肽药物被用于药物领域，在工业、制药用途中的重要性日益提高。
3.此前，本发明人报告称，为了构建用作抗体药物产品的纯化用途的蛋白a柱的代替系统，可利用如下柱将igg纯化，所述柱是将由17个残基组成的igg肽利用二硫键环化而成的包含特定序列的肽配体固定化而得到的(专利文献1)。然而，igg肽柱存在如下问题：由于存在于肽内的二硫键对碱性的耐受性较低，因此无法重复利用。因此，本发明人为了解决肽或蛋白质中的二硫键对于碱洗涤的化学性质较弱的问题，对提高耐碱性的方法反复进行研究，结果发现如下igg结合肽，其通过使用1,3-二氯丙酮使肽或蛋白质中的半胱氨酸残基中的硫醇基团之间交联，飞跃性地提高了对于碱洗涤的耐受性(专利文献2)。然而，所述交联虽然耐碱性较强，但出现了对于igg的亲和性较低(kd＝4.9μm)，功能性受损的新的问题。因此，尝试改良交联结构，即，通过对交联结构进行再设计，能够不产生如二氯丙酮交联那样的较大的功能性的降低而保持耐碱性，结果发现，通过将二硫化物的硫醇基团一方变更为甲基，将ss键转换为ch
3-s键，亲和性虽仍略低，但kd值达到340nm，接近具有耐碱性的实用的交联结构(专利文献3)。然而，所述方法由于暂时将肽中的高丝氨酸氯化后使其与半胱氨酸的硫醇基团反应，因此存在制作收率较低的问题。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：国际公布第2013/027796号公报
7.专利文献2：国际公布第2018/092867号公报
8.专利文献3：国际公布第2020/075670号公报
9.发明概述
10.发明所要解决的问题
11.因此，本发明的目的在于提供一种通过进一步对交联结构进行再设计，以较高的收率制作不伴随较大的亲和性的降低，耐碱性较高且保持功能性的交联结构的方法。
12.解决问题的技术手段
13.本发明人进一步反复进行与交联剂的结构相关的改良，结果通过使用由于反应性较高而通常不在水溶液中使用的1,1-二氯丙酮及其衍生物作为交联剂，成功制作出耐碱性以及对于igg保持较高的亲和性(kd＝45nm)的igg结合肽。通过本发明，成功提供了能够实用化为药物产品、收率较高、具有耐碱性、并且能够维持蛋白质和肽的功能的交联技术。
14.本发明的第1方面是一种蛋白质或肽用交联剂，其以下式(i)表示。
15.[化1]
[0016][0017]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、或苯基]
[0018]
本发明的第2方面是一种制备交联的蛋白质或肽的方法，所述交联的蛋白质或肽是由单一或分离的蛋白质或肽具有的至少2个硫醇基团结合而得到的，以下式表示，
[0019]
[化2]
[0020][0021]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]
[0022]
所述方法包括：
[0023]
使所述蛋白质或肽与上述本发明的第1方面的交联剂反应，使所述2个硫醇基团经由以下的基团相互结合，
[0024]
[化3]
[0025][0026]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。
[0027]
也可设为：所述蛋白质或肽为所述至少2个硫醇基团的全部或一部分形成二硫键的蛋白质或肽，所述方法包括：通过将所述二硫键还原而产生2个硫醇基团。
[0028]
本发明的第3方面是一种改善蛋白质或肽的耐碱性的方法，其包括：通过上述本发明的第2方面的方法，使所述蛋白质或肽内的硫醇基团结合而获得交联的蛋白质或肽。
[0029]
本发明的第4方面是一种制备蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，
[0030]
[化4]
[0031][0032]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]
[0033]
所述方法包括：
[0034]
通过上述本发明的第2方面的方法获得交联的蛋白质或肽；以及
[0035]
通过使获得的交联的蛋白质或肽与nh
2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的蛋白质或肽的交联部分导入反应性官能基。
[0036]
本发明的第5方面是一种制备蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，
[0037]
[化5]
[0038][0039]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]
[0040]
所述方法包括：
[0041]
通过使以下式表示的交联的蛋白质或肽与nh
2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的蛋白质或肽的交联部分导入反应性官能基，
[0042]
[化6]
[0043][0044]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]。
[0045]
本发明的第6方面是一种制备蛋白质或肽与药物的复合物的方法，所述复合物以下式表示，
[0046]
[化7]
[0047][0048]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]
[0049]
所述方法包括：
[0050]
通过本发明的第4或第5方面的方法获得结合有反应性官能基的蛋白质或肽；以及
[0051]
通过使获得的结合有反应性官能基的蛋白质或肽与具有能够与所述反应性官能基反应的官能基的药物反应，使所述药物与所述交联的蛋白质或肽的交联部分结合。
[0052]
本发明的第7方面是一种制备蛋白质或肽与药物的复合物的方法，所述复合物以下式表示，
[0053]
[化8]
[0054][0055]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]
[0056]
所述方法包括：
[0057]
通过使以下式表示的结合有反应性官能基的蛋白质或肽与具有能够与所述反应性官能基反应的官能基的药物反应，使所述药物与交联的蛋白质或肽的交联部分结合，
[0058]
[化9]
[0059][0060]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]。
[0061]
在上述本发明的第4至第7方面的方法中，所述连接基也可以包含能够利用蛋白质分解酶切断的部分。
[0062]
在上述本发明的第2至第7方面的方法中，所述蛋白质或肽也可以为5～50个氨基酸的肽。
[0063]
在上述本发明的第2至第7方面的方法中，被交联的硫醇基团也可以为存在于单一蛋白质或肽内的硫醇基团。
[0064]
在上述本发明的第2至第7方面的方法中，所述蛋白质或肽也可以为fc结合性肽。
[0065]
在上述本发明的第2至第7方面的方法中，被交联的硫醇基团也可以为存在于分离的蛋白质或肽内的硫醇基团。
[0066]
本发明的第8的方面是一种交联的蛋白质或肽，其以下式表示。
[0067]
[化10]
[0068][0069]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]
[0070]
本发明的第9方面是一种蛋白质或肽，其结合有反应性官能基，以下式表示。
[0071]
[化11]
[0072][0073]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]
[0074]
本发明的第10方面是一种蛋白质或肽与药物的复合物，所述复合物以下式表示，
[0075]
[化12]
[0076][0077]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]。
[0078]
在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，所述连接基也可以包含能够利用蛋白质分解酶切断的部分。
[0079]
在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，所述蛋白质或肽也可以为5～50个氨基酸的肽。
[0080]
在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，被交联的硫醇基团也可以为存在于单一蛋白质或肽内的硫醇基团。
[0081]
在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，所述蛋白质或肽也可以为fc结合性肽。
[0082]
fc结合性肽中的赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸、二氨基丙酸、精氨酸残基或第1位氨基酸的氨基也可以用dsg(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、dss(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、dma(二亚胺代己二酸二甲酯二盐酸盐)、dmp(庚二酰亚胺酸二甲酯二盐酸盐)、dms(辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、dtbp(3,3
’‑
二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、或dsp(二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯)修饰。
[0083]
在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，被交联的硫醇基团也可以为存在于分离的蛋白质或肽内的硫醇基团。
[0084]
本发明的第11方面是一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有交联的fc结合性肽，所述方法包括：使具有igg的fc区的分子与本发明的第8或第9方面的蛋白质、肽或本发明的第10方面的复合物接触。
[0085]
本发明的第12方面是一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有交联的fc结合性肽，所述方法包括：
[0086]
使与具有igg的fc区的分子结合的fc结合性肽与本发明的第1方面的交联剂反应，使所述fc结合性肽中的2个硫醇基团经由以下的基团相互结合，
[0087]
[化13]
[0088][0089]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。
[0090]
本发明的第13方面是一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有fc结合性肽，所述fc结合性肽结合有反应性官能基z，以下式表示，
[0091]
[化14]
[0092][0093]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，l表示连接基，z表示反应性官能基]
[0094]
所述方法包括：
[0095]
通过使结合有以下式表示的交联的fc结合性肽的具有igg的fc区的分子与nh
2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的fc结合性肽中的交联部分导入反应性官能基，
[0096]
[化15]
[0097][0098]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。
[0099]
本发明的第14方面是一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有fc结合性肽，所述fc结合性肽结合有药物d，以下式表示，
[0100]
[化16]
[0101][0102]
所述方法包括：
[0103]
通过使结合有以下式表示的结合有反应性官能基z的fc结合性肽的具有igg的fc区的分子与具有能够与所述反应性官能基z反应的官能基的药物反应，使药物与交联的蛋白质或肽的交联部分结合，
[0104]
[化17]
[0105][0106]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，l表示连接基，z表示反应性官能基]。
[0107]
上述本发明的第11～14方面的方法还可以进一步包括：使所述fc结合性肽与所述具有igg的fc区的分子共价结合。
[0108]
本发明的第15方面是一种具有igg的fc区的分子，其结合有本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、或本发明的第10方面的复合物。
[0109]
关于本发明的第15方面的分子，所述fc结合性肽与所述具有igg的fc区的分子也可以共价结合。
[0110]
本发明的第16方面是一种载体，其结合有本发明的第8或第9方面的肽。
[0111]
本发明的第17方面是一种具有igg的fc区的分子的纯化方法，其包括：
[0112]
使含有具有igg的fc区的分子的液体与上述本发明的第16方面的载体接触；
[0113]
通过洗涤将不与所述载体结合的成分去除；以及
[0114]
与所述载体结合的成分洗脱，回收所述具有igg的fc区的分子。
[0115]
本发明的第18方面是一种制备交联的蛋白质或肽的方法，所述交联的蛋白质或肽是由蛋白质或肽具有的至少2个硫醇基团结合而得到的，以下式表示，
[0116]
[化18]
[0117][0118]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽]
[0119]
所述方法包括：
[0120]
通过fmoc法合成所述蛋白质或肽；以及
[0121]
在所述合成中，使用以下式表示的化合物代替至少1个半胱氨酸残基，
[0122]
[化19]
[0123][0124]
本发明的第19方面是一种制备蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，
[0125]
[化20]
[0126][0127]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，l表示连接基，z表示反应性官能基，d表示药物]
[0128]
所述方法包括：
[0129]
通过fmoc法合成所述蛋白质或肽；以及
[0130]
在所述合成中，使用以下式表示的化合物代替至少1个半胱氨酸残基，
[0131]
[化21]
[0132][0133]
发明效果
[0134]
通过本发明的方法获得的氨基酸中的sh彼此的键可收率较高地形成交联结构。另外，由于耐碱性优异，因此即便暴露于碱性条件下键也不会被切断。因此，可提供一种耐碱性较强的蛋白质及肽，且可用于在碱性条件下使用或洗涤的蛋白质及肽。另外，由于利用交联结构维持原始的蛋白质及肽具有的结构，功能不会受损，因此可用于各种肽及蛋白质的稳定化。
[0135]
附图简述
[0136]
图1为分子内ss键的模式图。a表示天然蛋白质或肽中的ss键。b表示现有技术中的交联键。c表示本发明的交联键。
[0137]
图2是表示使用1,1-二氯丙酮交联肽衍生物固定化柱的dbc(dynamic binding capacity，动态结合容量)的评价结果的图。纵轴表示280nm的吸光度，横轴表示洗脱时间。短划线表示10％临界点(breakthrough point)。实线表示1次至5次碱洗涤的结果(较深的线的洗涤次数较多)，点划线表示10次至30次碱洗涤的结果(较深的线的洗涤次数较多)。
[0138]
图3是表示由碱洗涤所引起的肽固定化柱的dbc的变化的图。纵轴表示变动率(％)，横轴表示洗涤次数。
[0139]
图4为本发明的交联肽的模式图。
[0140]
图5是表示实施例11中的催产素的交联反应前及交联反应后的基于液相层析质谱仪(lc-ms)的分析结果的图。a及b分别是表示交联反应前的催产素ss氧化型及交联反应后的反应物的洗脱层析的图。
[0141]
图6是表示实施例12中的血管升压素的交联反应前及交联反应后的基于lc-ms的分析结果的图。a及b分别是表示交联反应前的血管升压素ss氧化型及交联反应后的反应物的洗脱层析的图。
[0142]
图7是表示实施例13中的暴露于α-胰凝乳蛋白酶后的催产素ss氧化型的基于反相高效液相层析法(hplc)的分析结果的图。
[0143]
图8是表示实施例13中的暴露于α-胰凝乳蛋白酶后的催产素sh还原型的基于反相hplc的分析结果的图。
[0144]
图9是表示实施例13中的暴露于α-胰凝乳蛋白酶后的2,2-二氯苯乙酮交联型反应物的基于反相hplc的分析结果的图。
[0145]
图10是表示实施例13中的添加α-胰凝乳蛋白酶后的各分子种类的变化量的图。
具体实施方式
[0146]
(交联剂)
[0147]
一个实施方式的蛋白质或肽交联用交联剂以下式(i)表示。
[0148]
[化22]
[0149][0150]
[式中，hal表示卤素原子，2个卤素原子可以相同也可以不同，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、或苯基]
[0151]
在本说明书中，[烷基]意思是指直链、分支、或环状饱和烃基。在本说明书中c表示碳原子数，c1～6烷基表示碳原子数为1～6个的烷基。作为烷基，例如可以例举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基、异戊基、2,3-二甲基丙基、己基、以及环己基等。
[0152]
基团a中的c1～6烷基具有的取代基的数量可以设为1～10个、1～8个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、3个、2个、以及/或者1个，例如可例举三氟甲烷。
[0153]
[卤素原子]意思是指氟原子、氯原子、溴原子、以及碘原子，优选为氟原子、氯原子、以及溴原子，更优选为氟原子、或氯原子。
[0154]
优选2个hal为相同的卤素原子，例如可以均为氟原子、均为氯原子、或均为溴原子。
[0155]
作为上述交联剂，例如可以例举：1,1-二氯丙酮、1,1-二氯频哪酮、以及2,2-二氯苯乙酮。
[0156]
[化23]
[0157][0158]
(交联剂的合成方法)
[0159]
a为烷基链时的二氯化可以依据gallucci等人的文献(gallucci,r.r.and going,r.,journal of organic chemistry,1981,vol.46,#12,p.2532-2538)而进行合成。另一方面，a为苯基时的二氯化可以依据zhang等人的文献(shao-lin zhang,zheng yang,xiaohui hu,kin yip tam,bioorganic&medicinal chemistry letters,vol.28,issue 21,15november 2018,p.3441-3445)而进行合成。
[0160]
(交联的蛋白质或肽的制备方法)
[0161]
一个实施方式是制备交联的蛋白质或肽的方法，所述交联的蛋白质或肽是由单一或分离的蛋白质或肽具有的至少2个硫醇基结合而得到的，以下式表示，
[0162]
[化24]
[0163]
[0164]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]
[0165]
所述方法包括：
[0166]
使蛋白质或肽与本实施方式的交联剂反应，使所述2个硫醇基团经由以下的基团相互结合，
[0167]
[化25]
[0168][0169]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。
[0170]
交联的蛋白质的制备方法例如可以由以下的反应式表示。
[0171]
[化26]
[0172][0173]
交联剂与硫醇基团间的交联反应可以根据需要向蛋白质或肽溶液中添加溶解于乙腈的交联剂，并在室温搅拌30分钟～1天而进行，所述蛋白质或肽溶液是通过添加以pbs等缓冲液溶解后的tcep
·
hcl等，在室温搅拌30分钟～1天进行还原，切断二硫键产生sh基团而得到的。反应溶液可以根据需要利用hplc等进行纯化。成为原料的蛋白质或肽可以根
据需要用fmoc保护，这种情况下，为了对反应后的蛋白质或肽的fmoc保护基进行去保护而添加哌啶等碱。反应溶液可以根据需要进一步利用hplc(c18反相柱)进行纯化。是否产生交联的蛋白质或肽例如可以通过利用lc-ms分析确认分子量而加以确认。
[0174]
本实施方式的交联剂可以使存在于分离的2个蛋白质或肽内的sh基团彼此交联，这种情况下，使2个蛋白质或肽与交联剂反应而进行结合(a)。2个分子可以为相同种类的分子，也可以为不同种类的分子。或者，本交联方法可以使存在于单一分子内的2个sh基团交联，这种情况下，使1个蛋白质或肽与交联剂反应而进行交联(c)。
[0175]
本说明书的交联剂使2个硫醇基团彼此交联。[硫醇基团]或[sh基团]通常来源于构成蛋白质或肽的半胱氨酸残基，但也可以为利用人工氨基酸等而人工导入的基团。2个硫醇基团可以在天然或交联前的状态下形成二硫键，也可以不形成二硫键。
[0176]
当2个硫醇基团在天然或交联前的状态下形成二硫键时，也可以包括实施上述交联方法前将该二硫键还原而产生硫醇基团的步骤(b及d)。例如，二硫键的还原例如可以使用三(2-羰基乙基)膦(tcep)、其盐酸盐、二硫乙醇(dtt)、2-巯基乙醇、以及半胱氨酸盐酸盐(cys-hcl)等市售的蛋白质二硫化物用还原剂进行。另外，2个硫醇基团可以为存在于单一蛋白质或肽中所含的半胱氨酸残基中的硫醇基团，也可以为分离的蛋白质或肽(包含蛋白质彼此、肽彼此、蛋白质与肽的组合)的硫醇基团。当使在单一蛋白质或肽内形成二硫键的硫醇基团交联时，该交联后的结构合意地提供与所述二硫键同样的立体结构。
[0177]
交联的蛋白质或肽在分子内交联时具有至少2个sh基团，在分子间交联时具有至少1个sh基团。蛋白质或肽例如可以在分子内或分子间具有1个以上(例如1～10个、2～8个、4～6个、1个、2个、3个、4个、5个、或6个)二硫键。例如，该蛋白质可以为500da以上、1000da以上、2000da以上、并且/或者500,000da以下、200,000da以下、或100,000da以下的蛋白质。例如，作为这样的蛋白质，可以为酶、糖蛋白(促红细胞生成素等)、细胞因子、毒素、佐剂、结构蛋白、抗体、fc融合蛋白、抗体片段(f(ab')2、fab'、fab、fab3、单链fv(scfv)、(串联)双特异性单链fv(sc(fv)2)、单链三抗体、纳米抗体、二价vhh、五价vhh、微型抗体、(双链)双功能抗体、串联双功能抗体、双特异性三抗体、双特异性双抗体、双亲和性重靶向分子(dart)、三抗体(或三体)、四抗体(或[sc(fv)2]2)、或(scfv-sa)4)二硫键fv、紧凑型igg、重链抗体、或这些的聚合物等)。另外，例如，肽可以为5～5000个氨基酸、5～1000个氨基酸、5～500个氨基酸、5～100个氨基酸、5～50个氨基酸、或10～40个氨基酸的肽。另外，肽可以为环状或线性中的任一种。作为这样的肽，可以例举：疫苗、微抗体、以及抗菌性肽等。在本说明书中，将包含抗体的fc区的蛋白质及肽称为[抗体等]。
[0178]
上述交联方法可以形成单一或相同的交联结构，也可以形成多个交联结构。通过使多个蛋白质或肽间交联，可以使相同或不同的3个以上蛋白质以及/或者肽交联。另外，交联可以为分子内交联与分子间交联的组合，例如可以进行后述的fc结合性肽内的分子内交联、以及该肽与抗体的fc区之间的分子间交联这两种交联。
[0179]
(基于肽合成的交联的蛋白质或肽的制备方法)
[0180]
或者，另一个实施方式的交联方法是一种制备交联的蛋白质或肽的方法，所述交联的蛋白质或肽是由蛋白质或肽具有的至少2个硫醇基团结合而得到的，以下式表示，
[0181]
[化27]
[0182][0183]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽]
[0184]
所述方法包括：
[0185]
通过fmoc法合成蛋白质或肽；以及
[0186]
在所述合成中，使用以下式表示的化合物代替至少1个半胱氨酸残基。
[0187]
[化28]
[0188][0189]
更具体而言，本方法在肽合成树脂(resin)等载体上通过fmoc法，自c末端合成待交联的包含2个cys的肽。第一个的cys的结合是使用通常的cys(根据需要sh基团可以被保护)进行，至剩余的另一个cys的前1个氨基酸为止通过通常的fmoc法进行合成。合成途中的肽中所含的cys受到保护时，对保护基进行去保护，之后添加1,1-二氯丙酮衍生物(1,1-二氯丙酮、1,1-二氯频哪酮、或2,2-二氯苯乙酮等)与sh基团结合得到的fmoc化半胱氨酸(例：fmoc化氯乙酰苯基半胱氨酸)进行连接(流程b的步骤d)。通过对fmoc进行去保护(流程b的步骤e)，使产生的肽的n末端α氨基与乙酰苯基半胱氨酸侧的α羧基偶联(流程b的步骤f)，1,1-二氯丙酮衍生物与sh基团结合得到的半胱氨酸与肽链结合。通过fmoc法连接来合成剩余的氨基酸(流程b的步骤g)，从而制成交联的肽链。
[0190]
[化29]
[0191][0192]
(反应性官能基导入方法)
[0193]
可以向通过上述方法获得的交联剂中再导入反应性官能基。因此，一个实施方式中的制备蛋白质或肽的方法是制备如下蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性
官能基，以下式表示，
[0194]
[化30]
[0195][0196]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]
[0197]
所述方法包括：
[0198]
通过所述方法获得交联的蛋白质或肽；以及
[0199]
通过使获得的交联的蛋白质或肽与nh
2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的蛋白质或肽的交联部分导入反应性官能基。
[0200]
[化31]
[0201][0202]
或者，在另一个实施方式中，制备结合有反应性官能基的蛋白质或肽的方法可以使用已交联的物质进行。因此，在另一个实施方式中，也可以为制备结合有反应性官能基的蛋白质或肽的方法，
[0203]
[化32]
[0204][0205]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]
[0206]
所述方法包括：
[0207]
通过使以下式表示的交联的蛋白质或肽与nh
2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的蛋白质或肽的交联部分导入反应性官能基。
[0208]
[化33]
[0209][0210]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]
[0211]
[化34]
[0212][0213]
另外，另一个实施方式中的制备蛋白质或肽的方法是制备如下蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，
[0214]
[化35]
[0215][0216]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，l表示连接基，z表示反应性官能基，d表示药物]
[0217]
所述方法包括：
[0218]
通过fmoc法合成所述蛋白质或肽；以及
[0219]
在所述合成中，使用以下式表示的化合物代替至少1个半胱氨酸残基。
[0220]
[化36]
[0221][0222]
本方法除使用的半胱氨酸残基为上述化合物这一点以外，可以通过与上述(基于肽合成的交联的蛋白质或肽的制备方法)同样的方法进行。
[0223]
(反应性官能基)
[0224]
具体而言，反应性官能基可以通过如下方法导入：使以本实施方式的交联剂交联的蛋白质或肽与具有该反应性官能基的氨基化合物(nh
2-l-z)反应而形成肟(肟法)。使用的具有反应性官能基的氨基化合物可以设为nh
2-x-l'-z(此处，x为o、nh、或n(c1～4烷基))。
[0225]
(连接基)
[0226]
在本说明书中，l及l'表示连接基。在本说明书中，[连接基]只要为与连接基结合的反应性官能基或药物能够与交联的蛋白质或肽结合的长度，且为不会对交联反应造成影响的结构，则并无特别限定，也可以不存在(可以显示为键)。作为一例，连接基可以包含1个或多个亚烷基、亚烯基、以及亚炔基。所述亚烷基、亚烯基、以及亚炔基可以为直链、分支、环状。亚烷基中的碳原子数可以设为1～20、1～10、1～6、1～4、1～3、1～2、2、或1个，亚烯基、以及亚炔基中的碳原子数可以设为2～20、2～10、2～6、2～4、2～3、或2个。另外，连接基也可以包含1个或多个-o-、-s-、-s-s-、-nh-、-n((c1～c6)烷基)-、-nh-c(o)-nh-、-c(o)-nh-、-nh-c(o)-、亚苯基、亚杂芳基、以及/或者亚杂环烯基。另外，连接基也可以包含1个或多个氨基酸部分，例如也可以包含1～100、1～50、1～25、1～20、1～15、1～10、1～5、1～4、1～3、1～2、2、或1个氨基酸部分。在构成连接基的基团中，与碳原子结合的氢原子可以用卤素原子取代。在以本交联剂最终与药物结合，且在特定条件下释放出该药物为目的的情况下(例如在意图使本交联剂与对特定的靶具有指向性的肽或蛋白质(例如具有fc区的分子等)结合(例如抗体药物复合物(adc)等)，并在富含该靶的局部释放出药物的情况下)，连接基优选包含能够利用生物体内的特定条件、优选为在该局部具有特征性的条件切断的部分。这样的条件例如可以例举酶的存在和ph值等。例如，连接基也可以包含利用蛋白酶或酯酶切断的肽键(例如利用溶酶体酶切断的ggfg等，参照marcin poreba、the febs journal(2020)287:1936-1969)或酯。这种情况下，连接基也可以包含利用上述蛋白酶切断的肽键以外的氨基酸部分。
[0227]
在本说明书中，[亚烷基]表示从所述烷基去除1个氢原子而成的二价基。作为亚烷基，可以例举：c1～20直链或分支亚烷基以及c3～7亚环烷基，例如可以例举：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、以及亚环己基。亚烷基根据需要可以用羟基、卤素原子、以及氨基等取代，这种情况下，亚烷基具有的取代基的数量可以设为1～10个、1～8个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、3个、2个、以及/或者1个。
[0228]
[亚烯基]意思是指从具有1个以上碳-碳间的双键的直链、分支、或环状不饱和烃的任意碳原子去除2个氢原子而成的二价基。作为亚烯基，可以例举c2～20亚烯基，例如可以例举：亚乙烯基、亚丙烯基、亚异丙烯基、亚丁烯基、亚戊烯基、亚己烯基、亚庚烯基、亚辛烯基、亚壬烯基、以及亚癸烯基。
[0229]
[亚炔基]意思是指从具有1个以上碳-碳间的三键的直链或支链状不饱和烃的任意碳原子去除2个氢原子而成的二价基。作为亚炔基，可以例举c2～20亚炔基，例如可以例举：亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚戊炔基、亚己炔基、以及亚苯基亚乙炔基。
[0230]
[亚杂芳基]及[亚杂环烯基]分别意思是指芳香族及非芳香族的包含至少1个选自氮原子、氧原子、以及硫原子中的1种以上杂原子的5～14元的二价单环式杂环基或稠合杂环基。5～14元的杂环基所含的杂原子的数量例如可以为1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、2个、或1个。单环式杂环基优选为5～6元环。缩合杂环基优选为8～10元环。作为亚杂芳基以及亚杂环烯基，例如可以例举：哌啶基、哌嗪基、吗啉基、奎宁环、吡咯烷基、吖丁啶基、亚氧杂环丁烷基(oxetylene)、亚氮丙啶基、亚托烷基(tropanylene)、亚呋喃基、亚四氢呋喃基、亚噻吩基、亚吡咯基、亚吡咯啉基、亚吡咯烷基、亚二氧戊环基、亚噁唑基、亚噁唑啉基(oxazolinylene)、亚异噁唑基、亚噻唑基、亚噻唑啉基、亚异噻唑基、亚咪唑基、亚咪唑啉基、亚咪唑啶基、亚噁唑啶基、亚噻唑烷基、亚吡唑基、亚吡唑啉基、亚吡唑啶基、亚噁二唑
基、亚呋吖基(furazanylene)、亚噻二唑基、亚三唑基、亚四唑基、亚吡喃基、亚吡啶基、亚哌啶基、亚哒嗪基、亚嘧啶基、亚吡嗪基、亚哌嗪基、亚二氧杂环己基、亚噁嗪基(oxazinylene)、亚吗啉基、亚噻嗪基、亚三嗪基、亚苯并呋喃基、亚异苯并呋喃基、亚二氢苯并呋喃基、亚二氢异苯并呋喃基、亚苯并噻吩基、亚异苯并噻吩基、亚二氢苯并噻吩基、亚二氢异苯并噻吩基、亚四氢苯并噻吩基、亚喹啉基、亚异喹啉基、亚喹唑啉基、亚酞嗪基、亚喋啶基、亚香豆基、亚色酮基、亚吲哚啉基、亚异吲哚啉基、亚苯并咪唑基(benzimidazoylene)、亚苯并呋喃基、亚嘌呤基、亚吖啶基、亚啡噁嗪基、亚啡噻嗪基、亚苯并噁唑基、亚苯并噻唑基、亚吲唑基、亚苯并咪唑基(benzimidazolylene)、亚苯并二氧戊环基、亚苯并二氧杂环己基苯并哌喃基(benzodioxanylchromenylene)、亚色满基、亚异色满基、亚色满酮基(chromanonylene)、亚噌啉基、亚喹喔啉基、亚吲哚嗪基、亚喹嗪基、亚咪唑并吡啶基、亚萘啶基、亚二氢苯并噁嗪基、亚二氢苯并噁唑啉基(dihydrobenzoxazolinonylene)、亚二氢苯并噁嗪酮基(dihydrobenzoxazinonylene)、以及亚苯并噻噁烷基(benzothioxanilene)。
[0231]
在本说明书中，[包含]一词记载为意图包括[由
…
构成]的情况，可以改称为[由
…
构成]。
[0232]
在本说明书中，[反应性官能基]或用[z]表示的基团意指可以在比较平稳的条件下，与肽、蛋白质、核酸、或低分子药物等反应而结合的基团。作为反应性官能基，可以例举：顺丁烯二酰亚胺、硫醇或者受保护硫醇、醇、丙烯酸酯、丙烯酰胺、胺或者受保护的胺、羧酸或者受保护的羧酸、叠氮、包含环炔烃基的炔烃、包含环戊二烯及呋喃的1,3-二烯、α-卤代羰基、n-羟基琥珀酰亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺、硝基苯酯、碳酸酯、二苯环辛炔(dbco)、四嗪、甲基四嗪(mtz)、反式环辛烯(tco)、叠氮基、羧基、甲苯磺酰基、氨基、环氧基、酰基、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰叠氮基、nhs(n-hydroxysuccinimide，n-羟基琥珀酰亚胺)酯、酰氯基、醛、乙二醛、环氧基、环氧乙烷基、碳酸酯、芳基化剂、酰亚胺酯、碳二亚胺、酸酐、卤代乙酰基、烷基卤化物、顺丁烯二酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化剂、重氮烷基、重氮乙酰化合物、羰基、酮、碳二亚胺、环氧基、环氧乙烷、羰基二咪唑、n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、氯甲酸n-羟基琥珀酰亚胺、卤代烷基、异氰酸酯、肼基、希夫碱、还原性氨基化产物、曼尼希缩合产物、重氮衍生物、曼尼希缩合产物、碘化反应产物、芳基叠氮化物、卤化芳基叠氮化物、二苯甲酮、重氮化合物、以及二氮杂环丙烯衍生物等。
[0233]
作为反应性官能基，作为与药物的结合形态，可以为产生由酰胺键、二硫键、硫醚键、硫酯键、腙键、酯键、醚键或氨基甲酸酯键形成的共价结合的基团。例如，作为适于和伯胺反应的反应物，有n-琥珀酰亚胺酯或n-磺基琥珀酰亚胺酯，作为适于和氨基反应的反应物，有对硝基苯酯、二硝基苯酯或五氟苯酯，作为适于和巯基反应的反应物，有顺丁烯二酰亚胺基、羧酰氯基、吡啶二硫基、硝基吡啶二硫基、卤烷基、以及卤代乙酰基，作为适于和羟基反应的反应物，有异氰酸酯基(isocyanate)(greg t.hermanson,bioconjugate techiniques second edition,p234-345)。
[0234]
另外，反应性官能基也包含参与如下反应(能够进行该反应)的反应性官能基：通过与烷氧基胺的反应形成肟键的反应、利用cu(i)催化剂与炔烃(alkyne)或叠氮化合物(azide)反应的huisgen的1,3-偶极环加成反应([点击]反应(click反应))、反电子需求型diels-alder反应、迈克尔反应、复分解反应、过渡金属催化的交叉偶联反应、自由基聚合反
应、氧化偶联反应、酰基转移反应或光点击反应(kim ch et al,curr opin chem biol.2013jun；17(3):412-9)。
[0235]
作为一例，反应性官能基导入可以通过如下方法进行：通过使经由交联剂相互结合而得到的上述蛋白质或上述肽或其融合物与羟基胺衍生物在pbs(ph值7.4)等缓冲液中，在4℃至常温中的任一种环境下反应30分钟～一晚，导入炔烃基等反应性官能基。
[0236]
[化37]
[0237][0238]
(药物结合方法)
[0239]
可以利用本实施方式的交联剂，向蛋白质或肽或其融合物中导入药物(有效载荷)。具体而言，通过使导入有上述反应性官能基的蛋白质或肽或其融合物的反应性官能基与药物(有效载荷)反应而结合，可以向蛋白质或肽或其融合物中导入药物(有效载荷)。
[0240]
因此，在一个实施方式中，制备蛋白质或肽与药物的复合物的方法是制备以下式表示的蛋白质或肽与药物的复合物的方法，
[0241]
[化38]
[0242][0243]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]
[0244]
所述方法包括：
[0245]
通过所述方法获得结合有反应性官能基的蛋白质或肽；以及
[0246]
通过使获得的结合有反应性官能基的蛋白质或肽与具有能够与所述反应性官能基反应的官能基的药物反应，使药物与所述交联的蛋白质或肽的交联部分结合。
[0247]
或者，上述制备蛋白质或肽与药物的复合物的方法可以使用已导入反应性官能基的蛋白质以及/或者肽来进行。因此，另一个实施方式中的制备蛋白质或肽与药物的复合物的方法是制备以下式表示的蛋白质或肽与药物的复合物的方法，
[0248]
[化39]
[0249][0250]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]
[0251]
所述方法包括：
[0252]
通过使以下式表示的结合有反应性官能基的蛋白质或肽与具有能够与所述反应性官能基反应的官能基的药物反应，使药物与所述交联的蛋白质或肽的交联部分结合，
[0253]
[化40]
[0254][0255]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]。
[0256]
[化41]
[0257][0258]
在本说明书中，[药物]只要为导入至蛋白质或肽中而利用的药物，则并无特别限定，例如可以例举：治疗剂、预防剂、靶向剂、标记剂、或诊断剂。例如，作为治疗剂或预防剂，可以例举：单甲基澳瑞他汀、澳瑞他汀、美登素、美坦辛、多柔比星、博莱霉素、奥唑米星、维多汀、pasudotox、德鲁替康、美登醇卡奇霉素、依喜替康、吡咯并苯二氮杂二聚体、杜卡霉素、艾日布林、sn-38、pnu-159682、美坦辛(dm1)、mertansine或上述药物的衍生物等抗癌剂；
90
y等放射性同位素；能够与血脑屏障上的受体结合并向中枢神经移行的药物；能够与癌细胞等结合并向抗体的细胞内移行的药物等靶向剂；放射能标记、酶、荧光标记、生物发光标记、以及化学发光标记金属等能够检测的标记。
[0259]
作为一例，可以通过如下方法导入药物：使预先通过肟反应导入顺丁烯二酰亚胺基作为反应性官能基的蛋白质或肽或其融合物与向作为药物的抗癌剂即mertansine的sh基团导入有叠氮基的反应物，在pbs(ph值7.4)等缓冲液中，在4℃至常温中的任一种环境下
反应30分钟～一晚。
[0260]
[化42]
[0261][0262]
(交联的蛋白质或肽)
[0263]
在一个实施方式中，提供一种通过上述交联剂交联的蛋白质以及/或者肽。在另一个实施方式中，提供一种存在于分离的蛋白质以及/或者肽中的2个硫醇基团经由上述交联剂相互结合而得到的具有以下结构的融合蛋白或融合肽。以下，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以为相互不同的物质，也可以为相同的物质。
[0264]
[化43]
[0265][0266]
[式中，a与式(i)中同样地定义]
[0267]
另外，在另一个实施方式中，提供一种存在于单一蛋白质或肽内的2个硫醇基团经由本发明的交联剂相互结合而得到的具有以下结构的蛋白质或肽。
[0268]
[化44]
[0269][0270]
[式中，a与式(i)中同样地定义]
[0271]
通过本实施方式的交联剂与反应性官能基或药物结合，可以对所需的蛋白质、肽或其复合物导入官能基或药物。因此，上述交联蛋白质及肽可以为经由交联剂结合有反应性官能基的蛋白质或肽、或经由交联剂结合有药物的蛋白质或肽，且包含以下式表示的分子。
[0272]
[化45]
[0273]
[0274]
[式中，l表示连接基，z表示反应性官能基，d表示药物]
[0275]
在本说明书中，连接基通过具有分支结构，可以与多个官能基z或药物d结合。与本实施方式的交联剂结合的官能基z或药物d的数量可以设为1～20个、1～10个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或1个。例如，在官能基z或药物d的数量为2个时，可设为以下的结构(l1及l2表示连接基。连接基与上述定义相同)。
[0276]
[化46]
[0277][0278]
本实施方式的交联剂能够以强化所需的蛋白质、肽或其复合物的结合稳定性为目的而使用。例如，上述交联蛋白质或肽的基团a可以为氢原子，且包含以下式表示的分子。
[0279]
[化47]
[0280][0281]
上述说明中，连接基l、反应性官能基z、药物d与上述定义相同。交联的分子是与二硫键相比，耐碱性得以改善，且实现稳定化的分子。另外，经由上述交联剂的键可为1个，也可以为2个以上。存在2个以上交联时，可以为单一蛋白质或肽内的交联，也可以为分离的蛋白质以及/或者肽内的交联，也可以组合单一蛋白质或肽内的交联和分离的蛋白质以及/或者肽内的交联。存在2个以上分离的蛋白质或肽内的交联时，可以使相同的2个蛋白质以及/或者肽间交联，也可以使多个蛋白质以及/或者肽间交联，使3个以上蛋白质以及/或者肽通过交联而结合。
[0282]
(交联fc结合性肽)
[0283]
在本说明书中，交联的肽也可以为fc结合性肽。因此，在另一个实施方式中，提供一种以下式(式中，a、l、z、以及d与上述定义相同)表示的通过上述交联剂交联的fc结合性肽或其制备方法。
[0284]
[化48]
[0285][0286]
[化49]
[0287][0288]
[化50]
[0289][0290]
在本说明书中，[fc结合性肽]意思是指与igg的fc区特异性地结合的肽。在本说明
书中，[igg的fc区]典型地意思是指作为igg的蛋白质分解酶木瓜蛋白酶加工品获得的c末端侧的片段。作为fc结合性肽，优选为与选自fc中的依据eu编号(eu numbering)的lys248、lys246、lys338、lys288、lys290、lys360、lys414、以及lys439的位点以及/或者其邻近区域、优选为lys248以及/或者其邻近区域结合、或与蛋白a的结合区结合的肽。例如，fc结合性肽也可以为具有fc结合能力的蛋白a的部分肽或其突变体。这种肽的具体实例记载于国际公布第2008/054030号、国际公布第2013/027796号、国际公布第2016/186206号、国际公布第2018/230257号、以及kyohei muguruma等人,acs omega(2019)；4(11):14390-14397.中，这些可以依据各文献中所记载的方法适宜地制备。fc结合性肽优选为最接近c末端的半胱氨酸及最接近n末端的半胱氨酸这2个半胱氨酸残基彼此通过本说明书的交联剂交联。
[0291]
在本说明书中，[igg]可以为哺乳动物、例如人及黑猩猩等灵长类，大鼠、小鼠、以及兔等实验动物，猪、牛、马、绵羊、以及山羊等家畜动物，以及狗及猫等宠物的igg，优选为人的igg(igg1、igg2、igg3或igg4)。作为本说明书中的igg，优选为人igg1、igg2或igg4，或兔igg，特别优选为人igg1、igg2或igg4。
[0292]
具体而言，fc结合性肽也可以为选自以下的(i)～(iv)中的肽：
[0293]
(i)以下式(i)表示的肽：
[0294]
nh
2-(接头)-(x
11-3
)-c-(x2)-(x3)-(x4)-(x5)-g-(x6)-l-(x7)-w-c-(x
81-3
)
[0295](i)[0296]
[式(i)中，(接头)表示连接基，1～3个x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、以及1～3个x8分别相互独立地表示相同或不同的氨基酸残基，
[0297]
各x1、x2、x3及各x8相互独立地表示相同或不同的c以外的任意氨基酸残基，
[0298]
x4为h、r、s、或d，
[0299]
x5为选自k、c、d、e、r、v、f、l、2-氨基辛二酸、dpr、orn、acorn、acdab、dab、nle、nva、tle、ala(t-bu)、以及cha中的1个氨基酸残基，
[0300]
x6为e、n、r、或d，
[0301]
x7为i或v]；
[0302]
(ii)以下式(ii)表示的肽；或包含如下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列是在(ii)的氨基酸序列中，在x9～x
13
以外的位置增加、缺失、以及/或者置换1个或数个氨基酸而得到的：
[0303]
x
91-2
nmqcqrrfyealhdpnlneeqrnax
11
ix
12
sirddc-(接头2)-conh2(seq id no:2)(ii)
[0304]
[式(ii)中，(接头2)表示连接基，x
91-2
选自由gf、af、vf、lf、if、mf、pf、ff、wf、kf、orn-f、cf、df、ef、βala-f、2-氨基辛二酸-f、dpr-f、以及nh
2-(peg)
n-co(n＝1～50)-f、f、k、orn、c、d、e、2-氨基辛二酸残基、以及dpr组成的组，
[0305]
x
11
及x
12
分别独立地选自由r、h、d、e、s、t、n、q、y、以及c组成的组]；
[0306]
(iii)以下式(i')或(i”)表示的肽：
[0307]
z-[(接头3)-(x
11-3
)-c-(x2)-(x3)-(x4)-(x5)-g-(x6)-l-(x7)-w-c-(x
81-3
)]
[0308]
(i')
[0309]
[(x
11-3
)-c-(x2)-(x3)-(x4)-(x5)-g-(x6)-l-(x7)-w-c-(x
81-3
)-(接头3)]-z
[0310]
(i”)
[0311]
[式(i')及式(i”)中，
[0312]
z表示反应性官能基，
[0313]
(接头3)表示连接基，
[0314]
1～3个x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、以及1～3个x8分别相互独立地表示相同或不同的氨基酸残基，
[0315]
各x1、x2、x3及各x8相互独立地表示相同或不同的c以外的任意氨基酸残基，
[0316]
x4为h、r、s、或d，
[0317]
x5为选自k、c、d、e、r、v、f、l、2-氨基辛二酸、dpr、orn、acorn、acdab、dab、nle、nva、tle、ala(t-bu)、以及cha中的1个氨基酸残基，
[0318]
x6为e、n、r、或d，
[0319]
x7为i或v]
[0320]
(iv)以下式(ii')表示的包含氨基酸序列的肽；或包含如下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列是在(ii')的氨基酸序列中，在x9～x
14
以外的位置增加、缺失、以及/或者置换1个或数个氨基酸而得到的：
[0321]
x
91-2
nmqcqx
14
rfyealhdpnlneeqrnax
11
ix
12
sirddc-(接头2)-nh2(seq id no:3)(ii')
[0322]
[式(ii')中，(接头2)表示连接基，x
91-2
选自由gf、af、vf、lf、if、mf、pf、ff、wf、kf、orn-f、cf、df、ef、βala-f、2-氨基辛二酸-f、dpr-f、以及nh
2-(peg)
n-co(n＝1～50)-f、f、k、orn、c、d、e、2-氨基辛二酸残基、dpr、以及乙酰基-k组成的组，
[0323]
x
11
及x
12
分别独立地选自由r、h、d、e、s、t、n、q、y、c、以及k(z)组成的组，
[0324]
x
14
为r、c、k(z)，
[0325]
z为反应性官能基]。
[0326]
在本说明书中，xm(m为整数)表示氨基酸。[x
mn
]表示n个氨基酸xm进行结合，未记载n的[xm]表示存在1个氨基酸xm。在此，n为2以上时，多个xm可以分别独立地为相同或不同的氨基酸。另外，n为[p-q]时，表示存在p～q个氨基酸xm。另外，在本说明书记载的氨基酸序列中，a为丙氨酸残基，r为精氨酸残基，n为天冬酰胺残基，d为天冬氨酸残基，c为半胱氨酸残基，q为谷氨酰胺残基，e为谷氨酸残基，g为甘氨酸残基，h为组氨酸残基，i为异亮氨酸残基，l为亮氨酸残基，k为赖氨酸残基，m为甲硫氨酸残基，f为苯丙氨酸残基，p为脯氨酸残基，s为丝氨酸残基，t为苏氨酸残基，w为色氨酸残基，y为酪氨酸残基，v为缬氨酸残基。另外，hcy为高半胱氨酸，dpr为二氨基丙酸，orn为鸟氨酸残基，βala为β丙氨酸残基，dab为2,4-二氨基丁酸残基，nle为正亮氨酸残基，nva为正缬氨酸残基，tle为叔亮氨酸残基，ala(t-bu)为叔丁基丙氨酸残基，且cha为环己基丙氨酸残基。另外，在侧链具有氨基的残基(赖氨酸残基、鸟氨酸残基、2,4-二氨基丁酸残基)中的氨基可以根据需要乙酰化。本说明书中，天然及人工氨基酸的乙酰化形态，有时记载为在上述氨基酸标记上还带有ac的前缀，但是可以理解为，除了如此理解尤其矛盾的情况以外，即便不记载为ac也可以包含乙酰化形态。本说明书中，k(z)意思是指官能基结合赖氨酸残基，k(z)优选为k(azide)。k(azide)表示叠氮基结合赖氨酸残基。
[0327]
本说明书中，fc结合性肽可以为以和载体结合而使抗体与载体结合为目的的载体结合用肽，也可以为以经由肽使药物与抗体结合为目的的药物结合用肽。载体结合用肽的
情况下，优选为上述(i)或(ii)的肽。
[0328]
式(i)中，接头为(gsggs)
1-3
、(sgsgs)
1-3
、(ggggs)
1-3
、或(peg)
2-10
(优选为(peg)4)、或不存在。另外，为了与载体结合，氨基可以与式(i)的c末端的羧基末端(-cooh)结合而形成(-c(＝o)nh2)基团，也可以任意地在该羧基末端与氨基之间插入接头(与上述相同地进行定义)。c末端存在接头时，n末端侧的接头可以不存在。即，可以形成(x
11-3
)-c-(x2)-(x3)-(x4)-(x5)-g-(x6)-l-(x7)-w-c-(x
81-3
)-(接头)-nh2。另外，式(i)中，n末端的氨基也可以乙酰化(这种情况下，在n末端侧的接头中的n末端附近的适当位置导入lys残基)。
[0329]
作为以所述式(i)表示的肽，优选地可以例举以下的肽。
[0330]
[1]x
11-3
为以(s、g、f或无)-(d、g、a、s、p、hcy或无)-(s、d、t、n、e或r)表示的氨基酸序列。
[0331]
[2]x
11-3
为d、gpd、r、gpr、spd、gdd、gps、sdd、rgn、g-hcy-d、rgp或gpd。
[0332]
[3]x
11-3
为d或gpd。
[0333]
[4]x2为a、s或t。
[0334]
[5]x2为a或t。
[0335]
[6]x2为a。
[0336]
[7]x3为y或w。
[0337]
[8]x3为y。
[0338]
[9]x4为h。
[0339]
[10]x5为选自a、r、k、c、d、e、l、2-氨基辛二酸、dpr、r、f、2-氨基辛二酸、dpr、acorn、acdab、dab、nle、nva、ala(t-bu)、以及cha中的1个氨基酸残基。
[0340]
[11]x5为k、r、acorn。
[0341]
[12]x5为选自v、dab、f、r、l、nva、nle、ala(t-bu)、以及cha中的1个氨基酸残基。
[0342]
[13]x5为选自f、r、l、nva、nle、ala(t-bu)、以及cha中的1个氨基酸残基。
[0343]
[14]x5为选自l、ala(t-bu)、以及cha中的1个氨基酸残基。
[0344]
[15]x6为e或n。
[0345]
[16]x6为e。
[0346]
[17]x7为v。
[0347]
[18]x
81-3
为(s、t、或d)-(h、g、y、t、n、d、f、hcy、或无)-(y、f、h、m、或无)。
[0348]
[19]x
81-3
为t、tfh、s、sfh、thh、tfy、tyh、或t-hcy-h。
[0349]
[20]x
81-3
为t或tfh。
[0350]
作为以所述式(i)表示的肽，可以为以上条件的任意1个或2个以上的组合，例如可以为满足以下记载的条件的肽：[8]与[9]；[8]与[17]；[9]与[17]；[8]、[9]及[17]；或者这些与[10]～[14]中的任一个的组合。
[0351]
更具体而言，可以例举以下的肽(以下，x5与上述相同，可以在n末端具有nh
2-(接头)-基团，也可以在c末端具有-nh2基团或nh
2-(接头)-基团)：
[0352]
1)dcayhx5gelvwct(seq id no:4)
[0353]
2)gpdcayhx5gelvwctfh(seq id no:5)
[0354]
3)rcayhx5gelvwcs(seq id no:6)
[0355]
4)gprcayhx5gelvwcsfh(seq id no:7)
[0356]
5)spdcayhx5gelvwctfh(seq id no:8)
[0357]
6)gddcayhx5gelvwctfh(seq id no:9)
[0358]
7)gpscayhx5gelvwctfh(seq id no:10)
[0359]
8)gpdcayhx5gelvwcsfh(seq id no:11)
[0360]
9)gpdcayhx5gelvwcthh(seq id no:12)
[0361]
10)gpdcayhx5gelvwctfy(seq id no:13)
[0362]
11)spdcayhx5gelvwctfy(seq id no:14)
[0363]
12)sddcayhx5gelvwctfy(seq id no:15)
[0364]
13)rgncayhx5gqlvwctyh(seq id no:16)
[0365]
14)g-hcy-dcayhx5gelvwct-hcy-h(seq id no:17)
[0366]
15)rrgpdcayhx5gelvwctfh(seq id no:18)
[0367]
16)dctyhx5gnlvwct(seq id no:19)
[0368]
17)dcayhx5gnlvwct(seq id no:20)
[0369]
18)dctyhx5gelvwct(seq id no:21)
[0370]
19)dcawhx5gelvwct(seq id no:22)
[0371]
20)dctytx5gnlvwct(seq id no:23)
[0372]
21)dcaytx5gnlvwct(seq id no:24)
[0373]
22)dcsytx5gnlvwct(seq id no:25)
[0374]
23)dctwtx5gnlvwct(seq id no:26)
[0375]
24)dctyhx5gnlvwct(seq id no:27)
[0376]
25)dctyrx5gnlvwct(seq id no:28)
[0377]
26)dctysx5gnlvwct(seq id no:29)
[0378]
27)dctytx5gnlvwct(seq id no:30)
[0379]
28)dctytx5gelvwct(seq id no:31)
[0380]
29)dctytx5grlvwct(seq id no:32)
[0381]
30)dctytx5gdlvwct(seq id no:33)
[0382]
31)dctytx5gnliwct(seq id no:34)
[0383]
32)dcayhrgelvwct(seq id no:35)
[0384]
33)gpdcayhrgelvwctfh(seq id no:36)
[0385]
34)rcayhrgelvwcs(seq id no:37)
[0386]
35)gprcayhrgelvwcsfh(seq id no:38)
[0387]
36)spdcayhrgelvwctfh(seq id no:39)
[0388]
37)gddcayhrgelvwctfh(seq id no:40)
[0389]
38)gpscayhrgelvwctfh(seq id no:41)
[0390]
39)gpdcayhrgelvwcsfh(seq id no:42)
[0391]
40)gpdcayhrgelvwcthh(seq id no:43)
[0392]
41)gpdcayhrgelvwctfy(seq id no:44)
[0393]
42)spdcayhrgelvwctfy(seq id no:45)
[0394]
43)sddcayhrgelvwctfy(seq id no:46)
[0395]
44)dctyhrgnlvwct(seq id no:47)
[0396]
45)dcayhrgnlvwct(seq id no:48)
[0397]
46)dctyhrgelvwct(seq id no:49)
[0398]
47)dcawhrgelvwct(seq id no:50)
[0399]
48)dctytngnlvwct(seq id no:51)
[0400]
49)dcaytngnlvwct(seq id no:52)
[0401]
50)dcsytngnlvwct(seq id no:53)
[0402]
51)dctwtngnlvwct(seq id no:54)
[0403]
52)dctyhngnlvwct(seq id no:55)
[0404]
53)dctyrngnlvwct(seq id no:56)
[0405]
54)dctysngnlvwct(seq id no:57)
[0406]
55)dctytrgnlvwct(seq id no:58)
[0407]
56)dctytngelvwct(seq id no:59)
[0408]
57)dctytngrlvwct(seq id no:60)
[0409]
58)dctytngdlvwct(seq id no:61)
[0410]
59)dctytngnliwct(seq id no:62)
[0411]
作为一例，可以使用具有以下结构的肽作为载体键。gsggs-gpdcayhrgelvwctfh-nh2(peg)
4-gpdcayhrgelvwctfh-nh2gsggs-dcayhrgelvwct-nh2[0412]
(peg)
4-dcayhrgelvwct-nh2[0413]
式(ii)中，接头2为(gsggs)
1-3
、(sgsgs)
1-3
、(ggggs)
1-3
、或(peg)
2-10-lys(优选为peg)
4-lys)、或不存在。另外，式(ii)的n末端氨基酸的末端(-nh2)也可以乙酰化而形成(ch
3-c(＝o)-nh-)基团。另外，接头2可以与氨基末端结合(这种情况下，在n末端侧的接头中的n末端附近的适当位置导入lys残基)，这种情况下，c末端的接头2可以存在也可以不存在。
[0414]
作为以所述式(ii)表示的具有氨基酸序列的肽，优选为可以例举以下的肽。
[0415]
[21]x9为选自由gf、af、βalaf、nh
2-(peg)
n-co(n＝2～10)-f、f、k、orn、c、以及dpr组成的组。
[0416]
[22]x9为选自由gf、f、以及k组成的组。
[0417]
[23]x
11
及x
12
分别独立地选自由r、h、以及e组成的组。
[0418]
[24]x
11
及x
12
为r。
[0419]
作为以上述式(ii)表示的具有氨基酸序列的肽，更具体而言，可以例举以下的肽：
[0420]
60)fnmqcqrrfyealhdpnlneeqrnarirsirddc(seq id no:63)、
[0421]
61)gfnmqcqrrfyealhdpnlneeqrnarirsirddc(seq id no:64)、
[0422]
62)knmqcqrrfyealhdpnlneeqrnarirsirddc(seq id no:65)、
[0423]
63)gfnmqcqkrfyealhdpnlneeqrnarirsirddc(seq id no:66)、
[0424]
64)knmqcqkrfyealhdpnlneeqrnarirsirddc(seq id no:67)、
[0425]
或
[0426]
66)gknmqcqrrfyealhdpnlneeqrnarirsirddc(seq id no:68)。
[0427]
例如可以使用具有以下结构的肽作为载体结合用肽。
[0488]
fnmqcqk(z)rfyealhdpnlneeqrnarirsirddc-nh2[0489]
乙酰基-knmqcqk(z)rfyealhdpnlneeqrnarirsirddc-srrk(z)r-nh2
[0490]
gfnmqcqk(z)rfyealhdpnlneeqrnarirsirddc-srrk(z)rr k(z)rrk(z)-nh2[0491]
乙酰基-knmqcqk(z)rfyealhdpnlneeqrnarirsirddc-srrk(z)rrk(z)rrk(z)-nh2[0492]
gfnmqcqk(z)rfyealhdpnlneeqrnarirsirddc-srrk(z)rr k(z)rrk(z)-nh2[0493]
除此以外，作为fc结合性肽，可以例举以下的肽(图4)。
[0494]
1)cawhlgelvwc(seq id no:70)
[0495]
2)dcawhlgelvwct(seq id no:71)
[0496]
3)dcawhlgelvfct(seq id no:72)
[0497]
4)dcawhlgelvxct(seq id no:73)
[0498]
x＝1-萘甲酰基、2-萘甲酰基、苄基、或苯并噻吩
[0499]
5)cdcawhlgelvwctc(seq id no:74)
[0500]
6)cayhlgelvwc(seq id no:75)
[0501]
7)dcayhlgelvwctf(2-pya)(seq id no:76)
[0502]
例如，本说明书的药物结合用肽可以根据需要经由连接基在n末端或c末端(优选为n末端)与反应性官能基(优选为叠氮基)结合。例如于在肽的n末端以及/或者c末端进而结合有1～3个(优选为2个)谷氨酸的肽的末端具有反应性官能基(例如叠氮基)。具有叠氮基的肽可以通过与具有二苯环辛炔(dbco)、炔、tco的其他功能性分子进行点击反应，使该其他功能性分子与肽连接。另外，肽与其他功能性物质的结合也可以通过本领域技术人员公知的其他方法、例如顺丁烯二酰亚胺基与巯基的反应等进行。
[0503]
本说明书的肽可以与其他功能性分子结合。例如，这种其他分子也可以经由上述反应性官能基(例如与氨基末端等)结合，肽中的氨基酸(例如赖氨酸残基)具有反应性官能基时，可以与该反应性官能基(例如具有赖氨酸残基作为取代基的叠氮基)结合，或者也可以经由顺丁烯二酰亚胺基与肽中的cys残基(例如接头2中的cys残基)结合。
[0504]
作为可以与本说明书的肽结合的其他功能性分子，包括含有肽、蛋白质、核酸、或低分子药物的标记物质或医疗用药物，但并不限定于这些。可以将能够应用fc分子的抗原特异性或其他特性的所有分子作为其他分子而进行结合。作为这样的物质，可以例举：抗癌剂、低分子药物产品、放射性标记、荧光标记、核酸药物、基因治疗药物、肽药物、iga或vhh等抗体等。
[0505]
药物结合用肽为了与抗体的共价结合而具有至少一个氨基(-nh2)。这样的氨基可以为氨基末端的氨基，也可以为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸、二氨基丙酸、以及精氨酸残基的侧链氨基。
[0506]
利用上述交联剂进行的交联由于对碱的耐受性较强，因此本实施方式的交联方法可以成为改善具有2个以上sh基团的蛋白质或肽或其融合物的耐碱性的方法。本实施方式的交联方法例如也可以成为改善二硫键的耐碱性的方法、改善分子内具有二硫键的蛋白质或肽的耐碱性的方法或提高稳定性的方法。具体而言，提供一种改善蛋白质或肽的耐碱性的方法，包括通过上述方法使所述蛋白质或肽内的2个硫醇基团结合。
[0507]
(结合有交联fc结合性肽的具有igg的fc区的分子)
[0508]
fc结合性肽可以与具有igg的fc区的分子结合。因此，另一实施方式的复合物是fc
结合性肽与具有igg的fc区的分子利用上述交联剂进行分子内交联的复合物。该复合物包括：利用包含药物的上述交联剂交联的fc结合性肽与具有igg的fc区的分子结合而得到的复合物；以及利用包含反应性官能基的上述交联剂交联的fc结合性肽与具有igg的fc区的分子结合而得到的复合物。
[0509]
另外，本实施方式的交联剂也可以使fc结合性肽与具有igg的fc区的分子间交联。具体而言，上述fc结合性肽也可以经由交联剂与抗体等中所含的半胱氨酸残基的sh基团结合。这种抗体等-fc结合性肽交联物中的fc结合性肽还可以在分子内进行交联，例如可以通过分子内交联，反应性官能基/药物与fc结合性肽结合，该fc结合性肽进一步与抗体等具有fc区的分子交联。因此，另一实施方式的复合物为利用上述交联剂交联的fc结合性肽与具有igg的fc区的分子的复合物。该复合物包括：具有igg的fc区的分子与fc结合性肽利用包含药物的上述交联剂交联而得到的复合物；以及具有igg的fc区的分子与fc结合性肽利用包含反应性官能基的所述交联剂交联而得到的复合物。
[0510]
[化51]
[0511][0512]
本说明书中，[具有igg的fc区的分子]意指包含igg的fc区的肽、蛋白质、或其他复合物，除野生型或人工igg或其突变体以外，还包含以fc融合蛋白为代表的igg的fc区与其他物质(活性成分、药物、蛋白质、低分子化合物、中分子化合物、高分子化合物、基质、脂质、脂质体、纳米颗粒、dds(drug delivery system，药物递送系统)用媒介物、核酸以及/或者肽)的融合体、以及仅包含fc区的分子。例如，fc分子为fc融合蛋白时，作为与fc融合的蛋白质或肽，可以例举：受体、细胞因子、白介素、凝血因子viii、ctla4(cytotoxic t lymphocyte-associated antigen 4，细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4)、人乳铁蛋白、tnf
(tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子)受体、或lfa-3(lymphocyte function antigen 3，淋巴细胞功能抗原3)、或其一部分(优选为靶结合部分)等。
[0513]
上述复合物可以通过使利用上述交联剂交联的fc结合性肽与具有igg的fc区的分子接触来制备。因此，融合有药物的具有igg的fc区的分子的制备方法包括如下步骤：使具有igg的fc区的分子与利用上述交联剂交联的fc结合性肽接触。或者，该复合物可以通过如下方法制备：使fc结合性肽与具有igg的fc区的分子结合，之后利用上述交联剂使分子内以及/或者分子间交联。
[0514]
因此，具有igg的fc区的分子的制备方法是结合有交联的fc结合性肽的具有igg的fc区的分子的制备方法，所述方法包括：
[0515]
使与具有igg的fc区的分子结合的fc结合性肽与上述交联剂反应，使上述fc结合性肽中的2个硫醇基团经由以下的基团相互结合，
[0516]
[化52]
[0517][0518]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。
[0519]
另外，具有igg的fc区的分子的制备方法是结合有fc结合性肽的具有igg的fc区的分子的制备方法，所述fc结合性肽结合有反应性官能基z，以下式表示，
[0520]
[化53]
[0521][0522]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，l表示连接基，z表示反应性官能基]
[0523]
所述方法包括：
[0524]
通过使结合有以下式表示的交联的fc结合性肽的具有igg的fc区的分子与nh
2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向上述交联的fc结合性肽中的交联部分导入反应性官能基，
[0525]
[化54]
[0526][0527]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。
[0528]
使fc结合性肽与抗体等结合的方法可以参照国际公布第2013/027796号、国际公布第2018/092867号、国际公布第2020/075670号等来进行。
[0529]
fc结合性肽中的赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸、二氨基丙酸、精氨酸残基(优选为赖氨酸残基)或第1位氨基酸的氨基可以任意地利用用于与抗体共价结合的部分修饰，该肽与抗体等结合时，能够利用该部分与抗体等共价
结合。本说明书中，有时将利用这种部分修饰后的fc结合性肽称为[ccap(crustacean cardioactive peptide，甲壳类心脏活性肽)试剂]。本说明书中，[用于与抗体共价结合的部分]是用于利用共价键连接fc结合性肽与具有igg的fc区的分子的化学结构，可以设为具有至少1个能够与所需的氨基酸(例如赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸、二氨基丙酸、精氨酸残基等)结合的位点的化学结构。作为产生这样的用于与抗体共价结合的部分的化合物，可以例举：dsg(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、dss(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、dma(二亚胺代己二酸二甲酯二盐酸盐)、dmp(庚二酰亚胺酸二甲酯二盐酸盐)、dms(辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、dtbp(3,3
’‑
二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、以及dsp(二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯)，优选为dsg、dss、或dsp。例如，dss或dsg等丁二酰亚胺基为了与存在于赖氨酸残基的侧链及多肽的n末端的伯胺反应，可以通过将fc结合性肽的n末端封端后与dss或dsg反应，利用dss或dsg仅特异性地修饰igbp的赖氨酸残基的侧链。fc结合性肽与igg间的交联例如可以在fc结合性肽的上述x5、x9、x
11
、x
12
、x
14
的氨基酸残基与igg的fc区的lys248或lys246、优选为lys248之间位点特异性地产生。
[0530]
作为ccap试剂的fc结合性肽与抗体等结合，只要是在产生交联反应的条件下进行的结合，则并无特别限定，例如可以通过将fc结合性肽与抗体等在适当的缓冲液中，在室温(例如约15℃～30℃)混合而使其反应。该混合步骤可以根据需要适量添加促进交联反应的催化剂而进行。该混合步骤中的fc结合性肽与抗体等的混合比，作为示例，fc结合性肽：抗体等的摩尔比可以设为1∶1～20∶1、优选为2∶1～20∶1或5∶1～10∶1。该混合步骤的混合时间(反应时间)例如可以设为1分钟～5小时、优选为10分钟～2小时或15分钟～1小时。获得的结合物还可以根据需要进行纯化。
[0531]
igg等的fc区通常以2条形成成对的对称的重链恒定区，因此可以存在2个fc结合性肽进行结合的位点。因此，可以由1～2个fc结合性肽与1分子具有igg的fc区的分子进行结合，优选为1个。
[0532]
(交联fc结合性肽结合载体)
[0533]
另外，fc结合性肽可以通过与柱等载体结合，用于抗体等的纯化。本发明的交联法为了提高对碱的耐受性，可以通过使用利用本发明的交联剂交联的fc结合性肽，进行1次或多次碱洗涤而将载体再利用。因此，在一个实施方式中，提供一种结合有fc结合性肽的载体，所述fc结合性肽是利用上述交联剂进行分子内交联而得到的。肽对载体的结合例如可以通过使肽与载体反应而进行，所述载体具有能够与氨基反应的官能基。反应在两者充分地结合的条件下进行，例如可以通过在缓冲液中，在室温接触1～5小时(优选为2.5～3.5小时)而进行。
[0534]
作为载体，可以例举：凝胶(例如柱用凝胶)、颗粒、珠粒、纳米颗粒、微粒、大珠粒、膜、微孔板、以及阵列等形状，作为其材质，可以例举：磁性物质、乳胶、琼脂糖、玻璃、纤维素、琼脂糖凝胶、硝基纤维素、聚苯乙烯、以及其他高分子材料。该载体优选为柱用凝胶(柱层析法)。作为载体，例如可以使用hitrap nhs-activated hp(ge healthcare)等。
[0535]
另外，提供一种利用上述载体的具有igg的fc区的分子的纯化方法。一个实施方式中的抗体等的纯化方法包括如下步骤：使含抗体等的溶液与上述载体接触，使抗体等与载体结合；通过洗涤将不与载体结合的成分去除；以及使与载体结合的成分洗脱并回收。
[0536]
含抗体等的溶液与载体的接触在两者能够充分接触的条件下进行。例如，载体为
柱时，通过将含抗体等的溶液注射至柱中而进行。去除不与载体结合的成分可以通过常法进行，例如可以通过利用缓冲液(ph值约7.0)洗涤与抗体等结合的载体而进行。与载体结合的抗体等的回收可以在ph值2.5以上进行，但为了防止抗体等的改性，酸度合意地是较弱的，优选为ph值3.6以上，例如可以设为ph值3.6～ph值4.3。或者，使用珠粒作为载体时，使载体与抗体等接触后，通过离心分离等回收珠粒，并使其再悬浮于洗脱液中，由此可以回收抗体等。
[0537]
(医疗用组合物)
[0538]
在另一个实施方式中，提供一种含有利用上述交联剂交联的肽以及/或者蛋白质、或者结合有利用本发明的交联剂交联的fc结合性肽的具有igg的fc区的分子作为有效成分的医疗用组合物，尤其是治疗药物、预防药物、或诊断试剂。利用结合有具有治疗或预防效果的药物的交联剂交联的肽或蛋白质可以用作医疗用(治疗用或预防用)组合物。
[0539]
上述说明中，肽以及/或者蛋白质、或经由交联剂结合的药物d是具有作为治疗药物、预防药物、或疫苗的功能的药物时，所述交联的肽以及/或者蛋白质、或结合有所述肽以及/或者蛋白质的抗体等可以用作治疗用或预防用。
[0540]
上述说明中，肽以及/或者蛋白质、或经由交联剂结合的药物d是具有作为标记的功能的药物时，所述交联的肽以及/或者蛋白质、或结合有所述肽以及/或者蛋白质的抗体等可以用作诊断用或检测用。
[0541]
上述组合物为治疗用或预防用组合物时，上述药物为治疗剂或预防剂，上述组合物为诊断试剂时，上述药物为标记物质。可以通过选择医疗用组合物的对象疾病所使用的肽、蛋白质、或抗体等或结合药物而适当设定，例如可以例举：癌症、炎症性疾病、感染症、以及神经退行性疾病。
[0542]
例如，医疗用组合物可以用作注射剂，包含静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这种注射剂可以通过依据公知的方法，例如使有效成分溶解于通常注射剂中使用的无菌的水性或者油性液中，并使其悬浮或乳化而制备。制备的注射液通常填充至适当的安瓿、小瓶或注射器中。另外，也可以通过向有效成分中添加适当的赋形剂，制备冷冻干燥制剂，使用时用注射用水、生理盐水等溶解而制成注射液。此外，通常抗体等蛋白质的经口施用由于会被消化系统分解，因此认为不易进行，但通过抗体片段或修饰后的抗体片段与剂型的创意钻研，也有可能经口施用。作为经口施用的制剂，例如可以例举：胶囊剂、片剂、糖浆剂及颗粒剂等。
[0543]
医疗用组合物适宜为制备为像适合活性成分的施用量这样的用药单位的剂型。作为这样的用药单位的剂型，可以例示注射剂(安瓿、小瓶、预填充式注射器)，每用药单位剂型通常可以含有5～500mg、5～100mg、10～250mg的有效成分或药物。
[0544]
医疗用组合物的施用途径可以为局部性，也可以为全身性。施用方法并无特别限制，如上所述，以非经口方式或经口方式施用。作为非经口施用途径，可以例举向皮下、腹腔内、血中(静脉内或动脉内)或脊髓液的注射或点滴等，优选为向血中施用。医疗用或诊断用组合物可以暂时施用，也可以持续性或间断性地施用。例如，施用也可以进行1分钟～2周的持续施用。医疗用组合物的施用方案只要为获得所需的治疗效果或预防效果的施用量及施用时期，则并无特别限定，可以根据症状、性别、年龄等适当确定。例如，适宜为在产生上述疾病的临床症状前以及/或者后，每月1～10次左右、优选为每月1～5次左右，通过静脉注
射，通常施用以有效成分的1次量计的0.01～20mg/kg体重左右、优选为0.1～10mg/kg体重左右、更优选为0.1～5mg/kg体重左右。其他非经口施用及经口施用时，也可以施用以此为基准的量。
[0545]
以下通过实施例更具体地说明本发明，但本发明并不受实施例限定。此外，本技术说明书全文中引用的文献是通过参照将其整体编入本技术说明书中。
[0546]
(实施例1)1,1-二氯丙酮交联环状肽的制备
[0547]
原料肽[序列：fmoc-hn-gsggs-gpdcayhrgelvwctfh(seq id no:1)：iggbp-长gs或iggbp-lgs]是通过固相肽合成法(fmoc法)委托合成的(eurofins公司)。使上述原料肽5mg(1.95μmol)溶解于1500μl的dmf(dimethyl formamide，二甲基甲酰胺)中，在其中添加预先以2ml pbs(ph值7.4)溶解的tcep
·
hcl(1.12mg，3.9μmol，2当量摩尔)，在室温搅拌30分钟，伴随进行还原反应。之后，添加溶解于乙腈120μl中的1,1-二氯-2-丙酮(0.495mg，3.9μmol，2当量摩尔)，并在室温搅拌。1小时后，通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认反应结束，利用hplc(c18反相柱)将反应溶液纯化，由此获得fmoc环化肽(2mg，0.76μmol，收率40％)。之后，为了对fmoc保护基进行去保护，添加2％哌啶，10分钟后通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认反应结束，直接利用hplc(c18反相柱)将反应溶液纯化，由此获得环化肽(1mg，0.38μmol，收率20％)。最终纯化肽是通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认分子量，并进行冷冻干燥。
[0548]
(实施例2)1,1-二氯频哪酮交联环状肽的制备
[0549]
原料肽[序列：fmoc-hn-gsggs-gpdcayhrgelvwctfh(seq id no:1)]是通过固相肽合成法(fmoc法)委托合成的(eurofins公司)。使上述原料肽10mg(3.9μmol)溶解于1500μl的dmf中，在其中添加预先以2ml pbs(ph值7.4)溶解的tcep
·
hcl(2.24mg，7.8μmol，2当量摩尔)，在室温搅拌30分钟，伴随进行还原反应。之后，添加溶解于乙腈120μl中的1,1-二氯频哪酮(1.32mg，7.8μmol，2当量摩尔)，并在室温搅拌。1小时后，通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认反应结束，利用hplc(c18反相柱)将反应溶液纯化，由此获得fmoc环化肽(7mg，2.7μmol)。之后，为了对fmoc保护基进行去保护，添加2％哌啶，10分钟后通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认反应结束，直接利用hplc(c18反相柱)将反应溶液纯化，由此获得环化肽(5mg，2.04μmol，收率50％)。最终纯化肽是通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认分子量，并进行冷冻干燥。
[0550]
(实施例3)2,2-二氯苯乙酮交联环状肽的制备
[0551]
原料肽[序列：fmoc-hn-gsggs-gpdcayhrgelvwctfh(seq id no:1)]是通过固相肽合成法(fmoc法)委托合成(eurofins公司)。使上述原料肽2.5mg(1.00μmol)溶解于1500μl的dmf中，在其中添加预先以2ml pbs(ph值7.4)溶解的tcep
·
hcl(0.506mg，2.0μmol，2当量摩尔)，在室温搅拌30分钟，伴随进行还原反应。之后，添加溶解于乙腈120μl中的2,2-二氯苯乙酮(0.38mg，2.0μmol，2当量摩尔)，并在室温搅拌。1小时后，通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认反应结束，利用hplc(c18反相柱)将反应溶液纯化，由此获得约2mg的fmoc环化肽。之后，为了对fmoc保护基进行去保护，添加2％哌啶，10分钟后通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认反应结束，直接利用hplc(c18反相柱)将反应溶液纯化，由此获得环化肽(1.2mg，0.49μmol，收率49％)。最终纯化肽是通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认分子量，并进行冷冻干燥。
[0552]
(实施例4)交联环状肽的结合亲和性的测定
[0553]
亲和性分析通过以下方法进行。首先，向设置于biacoret200(ge healthcare)的cm5感测芯片上，以10μl/ml的流量向感测芯片注射等量混合后的0.4m 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)与0.1m磺基-n-羟基丁二酰亚胺(sulfo-nhs)溶液，由此使感测芯片活化。之后，在ph值5.5(10mm乙酸钠)的条件下，将igg固定在感测芯片上。测定使用hbs-ep缓冲液(10mm hepes(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙磺酸)、150mm nacl、0.005％ tween20、3mm edta(ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)、ph值7.4)，以流量50μl/ml注射15.625、31.2、62.5、125、250、500nm的肽180秒钟，由此观察结合反应。测定解离反应时，仅注射缓冲液600秒钟。相互作用参数的分析是使用biaevalution t100软件进行。
[0554]
将进行了比较评价的igg结合肽衍生物示于图1。将评价这些肽与人igg1的亲和性的结果示于表1。具有二硫键的原始igg结合肽的亲和性的kd值为8.2nm，1,3-二氯丙酮交联环状肽为4.9μm，为约500倍，亲和性降低。另一方面，1,1-二氯丙酮交联环状肽的kd值为45.6nm，与原本的肽相比降低5倍，1,1-二氯频哪酮交联环状肽的kd值为112nm，与原本的肽相比降低约14倍，2,2-二氯苯乙酮交联环状肽的kd值为6.4nm，与原本的肽为相同程度。
[0555]
[表1]
[0556][0557]
(实施例5)肽固定化柱的制备及igg的纯化
[0558]
向1ml容量的nhs活化预填充柱中注入1mm盐酸5ml，去除柱内的异丙醇溶液。接下来，利用偶联溶液(20mm碳酸缓冲液、50mm氯化钠、ph值8.3)将10.0mg/ml肽溶液(溶解于dmso 100μl中)稀释10倍，注入稀释液1ml，并在室温进行4小时固定化。之后，利用5ml 1m tris(ph值8.0)将未反应的nhs在室温封闭1小时。之后，利用0.1n naoh水溶液5ml洗涤。最后，注入10ml pbs溶液(20mm磷酸缓冲液、150mm氯化钠、ph值7.4)，并用于层析评价。
[0559]
使制作的igg结合肽固定化柱与biologic lp(bio-rad公司制备)液相层析系统连接，利用pbs进行平衡化。接下来，以1ml/min的流量注入溶解于pbs中的1mg/ml的源自人血清的igg(sigma-aldrich公司制备)1min。进一步，利用pbs洗涤柱，注入洗脱溶液(100mm甘氨酸缓冲液、ph值2.8)，由此使作为吸附成分的igg洗脱。igg从柱的洗脱利用280nm的吸光度检测。
[0560]
(实施例6)肽固定化柱的动态结合容量(dbc)测定及耐碱性的评价1
[0561]
通过与上述同样的方法，制作肽固定化量1mg的柱。利用pbs使制作的柱平衡化后，以1ml/min(滞留时间1min)的流量注入溶解于pbs中的1mg/ml的源自人血清的igg(sigma-aldrich公司制备)。显示dbc是由观察到添加的样品的280nm吸光度的10％的漏出的时刻的添加蛋白质量而求出的。
[0562]
接下来，向该1mg肽固定化1ml柱中注入0.1n氢氧化钠水溶液5ml。之后，利用pbs进
行洗涤。对1,1-二氯丙酮交联环状肽重复该循环30次，对1,1-二氯频哪酮交联环状肽重复所述循环10次。在循环的第1～5次、第10次，及对1,1-二氯丙酮交联环状肽还在第20次及第30次以流量1ml/min进行dbc测定，由此评价耐碱性。另外，基于其结果，依据表2将刚制作柱后的dbc设为100％而求出dbc变动率。
[0563]
[表2]
[0564][0565][0566][0567]
另一方面，关于各肽柱的初始dbc值，原始肽为17.24mg/ml-柱，1,3-二氯丙酮交联肽为2.3mg/ml-柱，另一方面，此次的1,1-二氯丙酮交联肽为12.8mg/ml-柱，1,1-二氯频哪酮交联肽为16.70mg/ml-柱。因此，与现有的交联环状肽相比igg吸附性能明显较高。
[0568]
(实施例7)肽固定化柱的动态结合容量(dbc)测定及耐碱性的评价2
[0569]
向制作的1mg肽固定化1ml柱中注入5ml 0.1m氢氧化钠溶液，之后，利用5ml的pbs进行洗涤。将其作为1个循环，进行naoh水溶液洗涤/pbs洗涤处理1～30次后，在指定次数(第1、2、3、4、5、10、20、30次)以流量1ml/min进行dbc测定。
[0570]
将结果示于图2。可知，通过碱洗涤，关于包含二硫键的原始igg结合肽，抗体向柱的结合量降低(未图示)，关于1,1-二氯丙酮交联肽及1,1-二氯频哪酮交联肽，抗体向柱的结合量的降低极微小。
[0571]
以dbc 10％的值对该抗体结合量的变化速度进行比较，将所得的结果示于图3。关于原本的具有二硫键的igg结合肽固定化柱，通过5次碱洗涤dbc降低至50％以下，关于1,1-二氯丙酮交联肽，通过洗涤30次而维持90％以上，关于1,1-二氯频哪酮交联肽，通过洗涤10次而维持85％以上(图3)。由此可知，1,1-二氯丙酮交联肽及1,1-二氯频哪酮交联肽获得明显较高的耐碱性。另一方面，关于dbc的值本身，原始的具有二硫键的igg结合肽固定化柱为17.24mg/ml，相对于此，1,1-二氯丙酮交联肽柱为12.8mg/ml而为74％左右，1,1-二氯频哪酮交联肽柱为16.70mg/ml而为96％左右，通常dbc也会随着固定化的配体(肽)量、流量不同而大幅变化，因此认为通过此次的使用1,1-二氯丙酮交联肽及1,1-二氯频哪酮交联肽的柱也找出最佳条件，能够最后加工成适合实用的柱。
[0572]
(实施例8)反应性官能基的导入
[0573]
[化55]
[0574][0575]
利用400μl的dmf溶解制备的1,1-二氯丙酮交联环状肽0.201μmol，向其中添加预先以1.0ml的0.2m nahco3缓冲液(ph值8.3)溶解的100倍体积的o-2-丙炔羟胺盐酸盐(20.1μmol)溶液。将该反应液在室温搅拌24小时。通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认反应结束，直接利用hplc(c18反相柱)将反应溶液纯化，由此获得导入有炔官能基的交联环化肽(0.10μmol，收率50％)。最终纯化肽通过lc-ms分析(lc-ms8030，岛津公司制造)确认分子量，并进行冷冻干燥。对获得的化合物与实施例4(交联环状肽的结合亲和性的测定)同样地测定亲和性，结果观察到kd值为334nm，与原本的肽相比降低约42倍。
[0576]
(实施例9)基于1,1-二氯丙酮的vhh抗体的交联
[0577]
在100μl 950μg/ml的抗cd89vhh抗体(igarc25)(95μg，56
×
10-10
mol)的pbs溶液(ph值7.4)中，以最终浓度成为5m的方式添加尿素溶液，并在室温放置1小时。之后，添加tceptcep
·
hcl(11.2nmol，2当量摩尔)，在室温搅拌30分钟，伴随进行还原反应。之后，添加溶解于120μl乙腈中的1,1-二氯丙酮(11dca，11.2nmol，2当量摩尔)，并在室温搅拌。1小时
后，通过lc-ms分析(bio-accord系统，waters公司制造)确认反应结束。其结果为，交联前的igarc25的分子量为14,028da，11dca处理后为14,085da，增加了57da，由此确认利用11dca进行了交联。
[0578]
(实施例10)基于肽合成的具有交联结构的肽的制作
[0579]
基于以下式表示的1,1-二氯丙酮衍生物化合物(1,1-二氯丙酮、1,1-二氯频哪酮、2,2-二氯苯乙酮)
[0580]
[化56]
[0581]
的二硫键的交联反应中，通过使利用fmoc修饰n末端后的具有2个cys的肽(或者将利用fmoc修饰n末端后的具有二硫键的肽还原获得的肽)与1.0-2.0当量的1,1-二氯丙酮衍生物化合物在pbs中反应而进行交联(流程a的步骤a)，最后通过去除n末端的fmoc进行去保护(流程a的步骤b)而制备，如下式所示。另一方面，设计了不依据该方法的方法，即，如流程b所示，在fmoc法中的肽合成中进行交联反应。在肽合成树脂(树脂)上，通过fmoc法，从c末端对包含进行交联的2个cys中的一个的肽至剩余的cys的前1个为止进行合成。将肽中的cys的保护基去保护后(流程b的步骤c)，添加fmoc化氯乙酰苯基半胱氨酸进行连接(流程b的步骤d)。对fmoc进行去保护(流程b的步骤e)，使产生的肽的n末端α氨基与乙酰苯基半胱氨酸侧的α羧基偶联(流程b的步骤f)。通过fmoc法连接和合成剩余的氨基酸(流程b的步骤g)，最后，通过从树脂切断和fmoc的去保护，获得目标的肽。
[0582]
[化57]
[0583][0584]
(fmoc化烯丙基化氯乙酰苯基半胱氨酸的合成)
[0585]
通过以下方法合成本方法中使用的fmoc化氯乙酰苯基半胱氨酸(以下，称为化合物5)。其中，以下利用烯丙基保护fmoc化氯乙酰苯基半胱氨酸的α羧基。
[0586]
[化58]
[0587][0588]
在氩气气流下，在化合物1(5.00g，8.53mmol)与烯丙基溴(1.44ml，17.1mmol，2当量)的乙腈溶液(85ml)中，添加n,n-二异丙基乙胺(1.60ml，9.38mmol，1.1当量)，在室温搅拌16小时。添加水使反应停止后，将反应液浓缩，之后利用乙酸乙酯萃取，利用饱和碳酸氢钠水溶液、2当量浓度的盐酸水溶液及饱和盐水洗涤有机层后，利用硫酸钠干燥。将其浓缩而获得残渣，使用硅胶柱层析法(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)将该残渣纯化，获得化合物2(5.03g，94％)。
[0589]
[化59]
[0590][0591]
在三氟乙酸∶二氯甲烷＝1∶1溶液(30ml)中添加化合物2(5.03g，8.03mmol)与三异丙基硅烷(5.45ml，26.5mmol，3.3当量)，在室温搅拌1小时。反应结束后，使用甲苯进行共沸，之后进行浓缩而获得残渣，使用硅胶柱层析法(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)将该残渣纯化，获得化合物3(1.94g，63％)。
[0592]
[化60]
[0593][0594]
在氩气气流下，在化合物3(1.00g，2.63mmol)与苯酰甲基氯(814mg，5.27mmol，2当量)的二氯甲烷溶液(26ml)中，添加三乙基胺(0.401ml，2.90mmol，1.1当量)，在室温搅拌30分钟。添加水使反应停止后，利用二氯甲烷萃取，利用饱和盐水洗涤有机层，之后利用硫酸钠干燥。将其浓缩而获得残渣，使用硅胶柱层析法(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)将该残渣纯化，获得化合物4(1.17g，89％)。
[0595]
1h-nmr(400mhz,cdcl3,ppm)∶δ7.96(d,j＝7.8hz,2h),7.76(d,j＝7.3hz,2h),
7.64-7.57(m,3h),7.47(dd,j＝7.6,8.0hz,2h),7.40(dd,j＝7.3,7.8hz,2h),7.31(ddd,j＝1.4,7.3,7.3hz,2h),5.94-5.84(m,2h),5.33(d,j＝16.9hz,1h),5.24(dd,j＝1.4,10.1hz,1h),4.71-4.64(m,3h),4.40-4.38(m,2h),4.23(dd,j＝6.9,6.9hz,1h),3.90(s,2h),3.16-3.03(m,2h)
[0596]
hrms(fab-tof)m/z∶[(m+h)
+
]：c
29h28
n1o5s1，计算502.1688；实测502.1690.
[0597]
[化61]
[0598][0599]
在氩气气流下，添加化合物4(204mg，0.401mmol)与n-氯丁二酰亚胺(59.6mg，0.447mmol，1.1当量)的四氯化碳∶二氯甲烷＝1∶1溶液(4ml)，在室温搅拌1小时。添加水使反应停止后，利用二氯甲烷萃取水层，利用饱和盐水洗涤有机层，之后利用硫酸钠干燥。将其浓缩而获得残渣，使用硅胶柱层析法(仅二氯甲烷)将该残渣纯化，获得化合物5(210mg，97％)。
[0600]
1h-nmr(400mhz,cdcl3,ppm)∶δ7.99(d,j＝7.8hz,2h),7.76(d,j＝7.3hz,2h),7.63-7.57(m,3h),7.48(dd,j＝7.8,7.8hz,2h),7.39(dd,j＝7.3,7.8hz,2h),7.30(ddd,j＝1.0,7.3,7.3hz,2h),6.37(d,j＝25.6hz,1h),5.95-5.84(m,1h),5.63-5.58(m,1h),5.38-5.24(m,2h),4.76-4.60(m,3h),4.39(d,j＝6.9hz,2h),4.21(dd,j＝6.9,6.9hz,1h),3.51-3.14(m,2h)
[0601]
hrms(fab-tof)m/z∶[(m+h)
+
]：c
29h27
n1o5s2cl1s1，计算536.1296；实测536.1298.
[0602]
(fmoc化烯丙基化氯乙酰苯基半胱氨酸与cys的反应性)
[0603]
利用以下反应验证合成的fmoc化烯丙基化氯乙酰苯基半胱氨酸(化合物5)是否具有与cys的硫醇基团的反应性。
[0604]
[化62]
[0605][0606]
在氩气气流下，在化合物5(59.0mg，0.110mmol)与fmoc-cys-oallyl(0.046mg，0.121mmol，1.1当量)的二氯甲烷溶液(1.1ml)中，添加三乙基胺(0.017ml，0.121mmol，1.1当量)，在室温搅拌10分钟。添加水使反应停止后，利用二氯甲烷萃取水层，利用饱和盐水洗涤有机层，之后利用硫酸钠干燥。将其浓缩而获得残渣，使用硅胶柱层析法(己烷∶乙酸乙酯＝3∶1)将该残渣纯化，获得化合物6(93.8mg，97％)。
[0607]
1h-nmr(400mhz,cdcl3,ppm)∶δ7.96(d,j＝7.8hz,2h),7.75(dd,j＝2.7,7.8hz,4h),7.59-7.53(m,5h),7.41(dd,j＝7.8,7.8hz,2h),7.39-7.35(m,4h),7.30-7.26(m,4h),5.91-5.80(m,2h),5.70(dd,j＝7.8,22.0hz,2h),5.61(s,1h),5.31(d,j＝17.4hz,2h),
5.22(d,j＝11.6hz,2h),4.69-4.59(m,6h),4.41-4.29(m,4h),4.19(dd,j＝7.3,7.3hz,2h),3.33-2.97(m,4h),
[0608]
hrms(fab-tof)m/z∶[(m+na)
+
]：c
50h46
n2o9s2na，计算905.2542；实测905.2542.
[0609]
以上结果显示fmoc化烯丙基化氯乙酰苯基半胱氨酸(化合物5)具有与cys的硫醇基团的反应性，且展示了进行上述流程b的步骤d所示的反应。根据以上的结果，验证了可以实施上述b的流程中的新交联肽的合成。
[0610]
(实施例11)催产素的交联
[0611]
使用1,1-二氯丙酮，进行催产素(cys-tyr-ile-gln-asn-cys-pro-leu-gly-nh2(seq id no:77)，分子内ss键，分子量：1007.19)的交联。使以下式a表示的催产素ss氧化型(催产素-ox)的乙酸盐(toronto research chemicals公司制备)10mg(9.92μmol)溶解于3ml的0.1m hepes-hcl缓冲液(ph值8.0)中，与溶解有作为还原剂的tcep盐酸盐(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，三(2-羧乙基)膦盐酸盐)57.1mg(200μmol)的10.2ml的0.1m hepes-hcl缓冲液(ph值8.0)混合，并搅拌1小时。在其中添加溶解于乙腈0.722ml中的1,1-二氯丙酮2.77mg(21.8μmol)(相对于催产素的摩尔比2.2倍)，并搅拌1小时。
[0612]
[化63]
[0613][0614]
通过lc-ms以如下方式分析获得的反应物。利用0.1％甲酸将反应物稀释5倍后，对20μl利用连接有肽beh-c18柱(1.7μm，2.1
×
100mm，waters公司制造)的acquity uplc/sq检测系统(waters公司制造)进行分析(流量：0.2ml/min；洗脱：从包含0.1％甲酸的4％ ch3cn至70％ch3cn的线性梯度；柱温度：25℃)。
[0615]
将添加tcep盐酸盐前的催产素-ox及反应物的利用lc-ms的分析结果分别示于图5a及图5b。催产素-ox的波峰的质量的测定值为1006.3，与作为催产素-ox的理论值的1007.19几乎一致。另一方面，1,1-二氯丙酮交联反应的反应物的波峰与原本的波峰相比延迟洗脱，为质量1060.4的波峰。该质量与以式a1表示的催产素二氯丙酮交联型(催产素-da)的理论值：1063.26几乎一致，因此判断获得目标结构的交联体。
[0616]
[化64]
[0617][0618]
(实施例12)血管升压素的交联
[0619]
使用1,1-二氯丙酮，进行血管升压素(cys-tyr-phe-gln-asn-cys-pro-arg-gly-nh2(seq id no:78)，分子内ss键，分子量：1084.24)的交联。使以下式b表示的血管升压素ss氧化型(血管升压素-ox)乙酸盐(东京化成工业公司制备)5.5mg(5.07μmol)溶解于1.65ml的0.1m磷酸缓冲液(ph值8.0)中，与溶解有tcep盐酸盐24.6mg(86.0μmol)的4.4ml的0.1m磷酸缓冲液(ph值8.0)混合，并搅拌1小时。在其中添加溶解于乙腈0.371ml中的1,1-二氯丙酮1.42mg(11.2μmol)(相对于血管升压素的摩尔比2.2倍)，并搅拌1小时。
[0620]
[化65]
[0621][0622]
与实施例11同样地通过lc-ms分析获得的反应物。将添加tcep盐酸盐前的血管升压素-ox及反应物的利用lc-ms的分析结果分别示于图6a及图6b。血管升压素-ox的波峰的质量的测定值为1083.7，与血管升压素-ox的理论值：1084.24几乎一致。另一方面，1,1-二氯丙酮交联反应的反应物的波峰与原本的波峰相比延迟洗脱，为质量1139.0与质量1121.6的波峰。1139.0的质量与以下式b1表示的血管升压素二氯丙酮交联型(血管升压素-da)的理论值：1140.30几乎一致，因此判断含有目标结构的交联体。另一方面，1121.6的质量比1139.0小17.4，推定其为如下情况：以式b1表示的血管升压素-da发生由tcep所引起的还原反应，形成以下式b2表示的血管升压素二氯丙酮交联型的还原物(血管升压素-da-r)，进而发生脱水反应，形成式b3所示的血管升压素二氯丙酮交联型的还原-脱水物(血管升压素-da-rdh，质量理论值：1124.3)。
[0623]
[化66]
[0624][0625]
(实施例13)基于催产素的交联的对于蛋白酶的耐受性的获得
[0626]
为了基于交联反应的肽的稳定化评价，使用利用2,2-二氯苯乙酮交联的催产素，利用α-胰凝乳蛋白酶(源自牛胰脏，mp biomedicals公司制备)评价对于蛋白酶分解的抗性。催产素的基于2,2-二氯苯乙酮的交联是将实施例11中的1,1-二氯丙酮置换为2,2-二氯苯乙酮而同样地进行，并通过反相hplc分配目标物。详细而言，使催产素乙酸盐10mg(10μmol)溶解于0.1m hepes盐酸缓冲液(ph值8.0)3ml中，与包含tcep
·
hcl 57.4mg(200μmol)的0.1m hepes盐酸缓冲液(ph值8.0)2ml混合，并搅拌1小时。接下来，添加溶解于0.44ml的乙腈中的2,2-二氯苯乙酮8.3mg(44μmol)并混合，在室温搅拌1小时。将获得的样品应用于
和lc-forte(ymc公司制造)连接的inertsustain c18柱(5μm，14
×
250mm，glscience公司制备)(流量5ml/min)。洗脱以包含0.1％甲酸的4％至70％的线性梯度进行。分配目标物后，在负压下去除乙腈，之后进行冷冻干燥。
[0627]
以式a2表示催产素的2,2-二氯苯乙酮交联型(催产素-dp)的结构。
[0628]
[化67]
[0629][0630]
使用催产素-ox及下式a3所示的催产素sh还原型(催产素-rd)作为比较对象而进行评价。即，将以0.5mg/ml溶解于0.1m磷酸缓冲液(ph值7.0)中的催产素溶液设为催产素-ox，添加以0.5mg/ml溶解于包含0.5mg/ml的tcep的0.1m磷酸缓冲液(ph值7.0)中而得到的催产素溶液，将经过30分钟后获得的物质设为催产素-rd。向200μl这些溶液中添加1mg/ml的α-胰凝乳蛋白酶10μl(以相对于催产素的重量比计为1/10)，在37℃进行培养，并通过反相hplc进行分析。空白样品的情况下，添加磷酸缓冲液代替α-胰凝乳蛋白酶。
[0631]
另外，在包含0.5mg/ml的tcep的0.1m磷酸缓冲液(ph值7.0)中，以0.5mg/ml溶解纯化后的催产素-dp，将经过30分钟后获得的物质作为样品，同样地添加α-胰凝乳蛋白酶，并通过反相hplc进行分析。
[0632]
[化68]
[0633][0634]
如图7所示，催产素-ox经过15分钟至2小时后波峰完全不变，相对于此，图8所示的催产素-rd仅10分钟波峰就已消失。此外，15分钟附近的洗脱的宽峰被认为源自α-胰凝乳蛋白酶的波峰。
[0635]
将由催产素-dp制备的样品的反相hplc的洗脱层析图示于图9。这种情况下，出现2个波峰a及b。通过质谱分析对质量进行分析，结果波峰a为质量1126.7，波峰b为质量1106.5。这些与下式a4所示的催产素二氯苯乙酮交联型(催产素-dp)的质量的理论值
1125.34及其还原物(催产素-dp-r、下式a5)脱水后的催产素-dp-rdh(下式a6)的质量的理论值1109.33几乎一致。因此可知该样品为催产素-dp与催产素-dp-rdh的混合物。对向该样品中添加以重量比计1/10量的α-胰凝乳蛋白酶后的反应进行追踪，结果不同于催产素-rd的情况，与催产素-ox的情况同样，添加α-胰凝乳蛋白酶后也未观察到2个波峰的减少。
[0636]
为了观察添加α-胰凝乳蛋白酶后的这些各分子种类的变化量，将相对于空白样品的峰面积的相对值(％)相对于时间进行绘图，将所得的结果示于图10。催产素-rd在添加α-胰凝乳蛋白酶后波峰立即急速地消失，因此认为对于蛋白酶的耐受性极低，但是作为其ss交联体的催产素-ox，对于α-胰凝乳蛋白酶的添加也未观察到分解，具有较高的耐蛋白酶性，因此可知基于ss键的交联非常有助于耐受性。另一方面，在还原剂tcep的存在下，也观察到二氯苯乙酮交联型(oxytocin-dp与oxytocin-dp-rdh)对于α-胰凝乳蛋白酶消化的较高的耐受性。这些情况显示，本交联方法可以大为有助于肽的稳定性，尤其是对于蛋白酶的耐受性(稳定性)。
[0637]
[化69]
[0638][0639]
在不脱离本发明的广义的精神与范围的情况下，本发明能够产生各种实施方式及变形。另外，上述实施方式用于说明本发明，并不限定本发明的范围。即，本发明的范围并不由实施方式表示，而由权利要求书表示。并且，在权利要求书范围内及与其等同的发明的意义的范围内实施的各种变化被视为在本发明的范围内。
[0640]
本技术基于2020年11月9日提交的日本专利申请第2020-186833号和2021年5月14日提交的日本专利申请第2021-82739号。日本专利申请第2020-186833号和日本专利申请第2021-82739号的整个说明书、权利要求和附图作为参考并入本文。
[0641]
[工业上的可利用性]
[0642]
本发明对肽及蛋白质的交联有用。

技术特征：
1.一种蛋白质或肽用交联剂，其以下式(i)表示，[化1][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、或苯基]。2.一种制备交联的蛋白质或肽的方法，所述交联的蛋白质或肽是由单一或分离的蛋白质或肽具有的至少2个硫醇基团结合而得到的，以下式表示，[化2][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]所述方法包括：使所述蛋白质或肽与权利要求1所述的交联剂反应，使所述2个硫醇基团经由以下的基团相互结合，[化3][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质或肽为所述至少2个硫醇基团的全部或一部分形成二硫键的蛋白质或肽，所述方法包括：通过将所述二硫键还原而产生2个硫醇基团。4.一种改善蛋白质或肽的耐碱性的方法，其包括：通过权利要求2或3所述的方法，使所述蛋白质或肽内的硫醇基团结合而获得交联的蛋白质或肽。5.一种制备蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，[化4][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/
肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]所述方法包括：通过权利要求2或3所述的方法获得交联的蛋白质或肽；以及通过使获得的交联的蛋白质或肽与nh
2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的蛋白质或肽的交联部分导入反应性官能基。6.一种制备蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，[化5][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]所述方法包括：通过使以下式表示的交联的蛋白质或肽与nh
2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的蛋白质或肽的交联部分导入反应性官能基，[化6][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]。7.一种制备蛋白质或肽与药物的复合物的方法，所述复合物以下式表示，[化7][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]所述方法包括：通过权利要求5或6所述的方法获得结合有反应性官能基的蛋白质或肽；以及通过使获得的结合有反应性官能基的蛋白质或肽与具有能够与所述反应性官能基反应的官能基的药物反应，使所述药物与所述交联的蛋白质或肽的交联部分结合。8.一种制备蛋白质或肽与药物的复合物的方法，所述复合物以下式表示，
[化8][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]所述方法包括：通过使以下式表示的结合有反应性官能基的蛋白质或肽与具有能够与所述反应性官能基反应的官能基的药物反应，使所述药物与交联的蛋白质或肽的交联部分结合，[化9][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]。9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中，所述连接基包含能够利用蛋白质分解酶切断的部分。10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质或肽为5～50个氨基酸的肽。11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，被交联的硫醇基团为存在于单一蛋白质或肽内的硫醇基团。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述蛋白质或肽为fc结合性肽。13.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，被交联的硫醇基团为存在于分离的蛋白质或肽内的硫醇基团。14.一种交联的蛋白质或肽，其以下式表示，[化10][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]。15.一种蛋白质或肽，其结合有反应性官能基，以下式表示，[化11]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]。16.一种蛋白质或肽与药物的复合物，所述复合物以下式表示，[化12][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]。17.根据权利要求14所述的蛋白质或肽、权利要求15所述的蛋白质或肽、或权利要求16所述的复合物，其中，所述连接基包含能够利用蛋白质分解酶切断的部分。18.根据权利要求14至17中任一项所述的蛋白质、肽或复合物，其中，所述蛋白质或肽为5～50个氨基酸的肽。19.根据权利要求14至18中任一项所述的蛋白质、肽或复合物，其中，被交联的硫醇基团为存在于单一蛋白质或肽内的硫醇基团。20.根据权利要求19所述的蛋白质、肽或复合物，其中，所述蛋白质或肽为fc结合性肽。21.根据权利要求20所述的蛋白质、肽或复合物，其中，fc结合性肽中的赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸、二氨基丙酸、精氨酸残基或第1位氨基酸的氨基用dsg(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、dss(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、dma(二亚胺代己二酸二甲酯二盐酸盐)、dmp(庚二酰亚胺酸二甲酯二盐酸盐)、dms(辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、dtbp(3,3
’‑
二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)或dsp(二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯)修饰。22.根据权利要求14至18中任一项所述的蛋白质、肽或复合物，其中，被交联的硫醇基团为存在于分离的蛋白质或肽内的硫醇基团。23.一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有交联的fc结合性肽，所述方法包括：使具有igg的fc区的分子与权利要求20或21所述的蛋白质、肽或复合物接触。24.一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有交联的fc结合性肽，所述方法包括：使与具有igg的fc区的分子结合的fc结合性肽与权利要求1所述的交联剂反应，使所述fc结合性肽中的2个硫醇基团经由以下的基团相互结合，[化13]
[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。25.一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有fc结合性肽，所述fc结合性肽结合有反应性官能基z，以下式表示，[化14][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，l表示连接基，z表示反应性官能基]所述方法包括：通过使结合有以下式表示的交联的fc结合性肽的具有igg的fc区的分子与nh
2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的fc结合性肽中的交联部分导入反应性官能基，[化15][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。26.一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有fc结合性肽，所述fc结合性肽结合有药物d，以下式表示，[化16]所述方法包括：通过使结合有以下式表示的结合有反应性官能基z的fc结合性肽的具有igg的fc区的分子与具有能够与所述反应性官能基z反应的官能基的药物反应，使药物与交联的蛋白质或肽的交联部分结合，[化17][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，l表示连接基，z表示反应性官能基]。27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中，还包括：使所述fc结合性肽与所述具有igg的fc区的分子共价结合。28.一种具有igg的fc区的分子，其结合有权利要求20或21所述的蛋白质或肽或复合
物。29.根据权利要求28所述的分子，其中，所述fc结合性肽与所述具有igg的fc区的分子共价结合。30.一种载体，其结合有权利要求20或21所述的肽。31.一种具有igg的fc区的分子的纯化方法，其包括：使含有具有igg的fc区的分子的液体与权利要求30所述的载体接触；通过洗涤将不与所述载体结合的成分去除；以及与所述载体结合的成分洗脱，回收所述具有igg的fc区的分子。32.一种制备交联的蛋白质或肽的方法，所述交联的蛋白质或肽是由蛋白质或肽具有的至少2个硫醇基团结合而得到的，以下式表示，[化18][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽]所述方法包括：通过fmoc法合成所述蛋白质或肽；以及在所述合成中，使用以下式表示的化合物代替至少1个半胱氨酸残基，[化19]33.一种制备蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，[化20][式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，l表示连接基，z表示反应性官能基，d表示药物]所述方法包括：通过fmoc法合成所述蛋白质或肽；以及在所述合成中，使用以下式表示的化合物代替至少1个半胱氨酸残基，[化21]

技术总结
本发明的蛋白质或肽用交联剂以下式(I)表示。[式中，A为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的C1～6烷基、苯基]。苯基]。苯基]。


技术研发人员：伊东祐二 中山浩 穆罕默德
受保护的技术使用者：国立大学法人鹿儿岛大学
技术研发日：2021.10.22
技术公布日：2023/9/7