特异性结合SARSCoV2刺突蛋白的抗体及其制造方法与流程

特异性结合sarscov2刺突蛋白的抗体及其制造方法
技术领域
1.本技术涉及特异性结合sars cov2刺突蛋白的抗体及其制造方法。
2.通过引用并入
3.本技术中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文献据此出于所有目的全文以引用方式并入，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其它文献被单独地指示出于所有目的以引用方式并入。引用主要意在实现目的。在引入本文的一个或多个参考文献的教导与本公开之间存在任何不一致的情况下，本说明书的教导是预期的。


背景技术：

4.严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)是引起冠状病毒病2019(covid-19，一种呼吸道疾患)的冠状病毒株。它俗称冠状病毒，此前被提及为其临时名称2019新型冠状病毒(2019-ncov)。正如国立卫生研究院(national institutes of health)所述，它是sars-cov-1的继任者。sars-cov-2是一种正义单链rna病毒。它在人类中呈接触传染性，并且世界卫生组织(world health organization，who)已将持续的covid-19大流行病指定为国际关注的突发公共卫生事件(public health emergency of international concern)。
5.在分类学上，sars-cov-2是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(sarsr-cov)的毒株。据信它具有动物源性起源，并且与蝙蝠冠状病毒具有密切的遗传相似性，表明其出现自蝙蝠携带的病毒。该病毒几乎未显示遗传多样性，指示sars-cov-2引入人类的溢出事件可能发生在2019年底。
6.基于在已知的sars-cov-2基因组序列中表现出的低可变性，认为该毒株是2019年底在人群中出现的几周内被卫生当局检测出的。在2020年1月30日，who将sars-cov-2指定为国际关注的突发公共卫生事件，且在2020年3月11日，who宣称这是一种流行病。
7.据估计病毒的基本传染数r在1.4至3.9之间。这意味着当没有社会成员免疫且没有采取预防措施时，预计每例病毒感染将导致1.4至3.9例新感染。在人口稠密的情况下，如在巡游船上所见的那些，传染数可能更高。
8.治疗covid-19疾病或预防其爆发的治疗选项是有限的。同样，除了社会距离和使用防护装备等措施外，避免sars-cov-2感染的选项也很有限。
9.而且，已经注意到，在covid-19的许多严重病例中，患者的自身免疫促成致死性病因学。例如，在sars cov-2感染后，患者分泌干扰素以支持身体的病毒防御。然而，在某种程度上，患者的反应可能变得强烈(“过冲”)到使得致其效应可能起反作用。例如，许多免疫细胞可以进入我们的肺并引起膜增厚，氧气通常从空气穿过该膜进入血液。气体的交换受到限制，并且在最坏的情况下，可能需要换气。有时这种反应可能过冲，并且也针对健康的细胞。
10.基于以上，本发明的一个目的是提供拓宽治疗选项以治疗covid-19疾病或预防其爆发的方法和组合物。
11.本发明的另一个目的是提供拓宽避免sars-cov-2感染的选项的方法和组合物。
12.本发明的另一个目的是提供这样的方法和组合物：有助于控制伴随有严重covid 19病因学的过冲免疫反应，或当施用给患者时不导致过冲免疫反应。
附图说明
13.表1显示了可用于免疫的包含seq id no:1-seq id no:10中任一者的肽的优选长度范围。需注意，seq id no 1、2、5、6、或7的长度范围也适用于其相应的突变对应物seq id no 11、12、13、14或15。
14.图1示意性显示了根据本发明的igy抗体的生成。
15.图2显示了五种物种的igg、iga和igm在初乳(外圆)和乳(内圆)中的相对分布。圆圈的相对大小代表在物种中发现的总免疫球蛋白的总浓度以及初乳相对乳中的浓度。
16.图3显示了seq id no:1-10的序列比对。s1/s2切割位点和s2'的序列基序在seq id no:1中以粗体下划线显示。
17.图4显示了sars cov2刺突蛋白的结构域结构。该蛋白质由结构域s1和s2组成。s1含有负责与ace2结合的受体结合结构域。s2负责与宿主细胞的融合。在与ace2结合时，诱导了刺突的构象变化，并且tmprss在s1/s2和s2'处切割。tm＝跨膜结构域。hr-1＝七肽重复区1(n-定位的)；hr 2＝七肽重复区2(c-定位的)；fp＝融合肽。
18.图5显示了sars-cov2刺突蛋白结合测定的结果。
19.图6显示了cpe中和测定的结果。
20.图7显示了荧光噬斑减少测定的结果。
21.图8显示了实施例6中使用的多联体。
22.发明详述
23.本发明尤其提供了一种用于分离或产生抗sars cov 2刺突蛋白的抗体的方法。下面将详细讨论本发明及其特征的一般优势。
24.根据本发明的一个方面，提供了一种用于分离或产生抗体的方法，该方法包括：
25.·
通过施用至少一种蛋白质或肽对雌性脊椎动物进行免疫，该蛋白质或肽包含至少一种选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的氨基酸序列，
26.·
从免疫后的动物收集一种或多种泌乳或排卵产物，以及
27.·
从产物中分离或纯化至少一种抗体，
28.其中蛋白质或肽是sars cov 2刺突蛋白，包含sars cov 2刺突蛋白，或是其片段。
29.需注意，seq id no 1-10对应于野生型刺突蛋白、或其片段或表位。需注意，seq id no 11-15相对于seq id no 1、2、5、6或7包含一个或两个置换。
30.在seq id no:11、12、13和15中，如在相应的野生型蛋白质或肽中，在肽基序“ars”中的精氨酸残基(r)被丙氨酸残基(a)取代，以得到肽基序“aas”。
31.这同样适用于seq id no:11、12和14，其中如在相应的野生型蛋白质或肽中，在肽基序“krs”中的精氨酸残基(r)被丙氨酸残基(a)取代，以得到肽基序“kas”。
32.下表提供了野生型序列及其突变对应物的概述。
[0033][0034]
如在相应的野生型蛋白质或肽中，肽基序ar和kr代表蛋白酶，例如弗林蛋白酶和/或tmprss2(跨膜丝氨酸蛋白酶2型)和其它相关蛋白酶的切割位点。为了稳定化针对蛋白水解切割的位置，发明人突变了用于免疫的蛋白质和肽中的相应位点。术语“s1”和“s2”的解释参见正文中的别处。
[0035]
如本文所用，术语“肽”涉及由通过肽键彼此结合的2个或更多个氨基酸组成的分子。
[0036]
如本文所用，术语“寡肽”涉及长度在≥2至≤20个氨基酸之间的肽。
[0037]
如本文所用，术语“多肽”涉及长度在》20至≤50个氨基酸之间的肽。
[0038]
如本文所用，术语“蛋白质”涉及长度》50个氨基酸的肽，或包含彼此共价(例如，通过接头或二硫桥)或非共价缔合的两个或更多个肽。
[0039]
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)是引起冠状病毒病2019(covid-19，一种呼吸道疾患)的病毒株。它俗称冠状病毒，并且此前被提及为其临时名称2019新型冠状病毒(2019-ncov)。sars-cov-2是一种正义单链rna病毒。它在人类中呈接触传染性。
[0040]
在分类学上，sars-cov-2是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(sars-cov)的毒株。据信它具有动物源性起源，并且与蝙蝠冠状病毒具有密切的遗传相似性，表明其出现自蝙蝠携带的病毒。还认为中间动物储主(如穿山甲)涉及病毒向人类的引入。该病毒几乎未显示遗传多样性，指示sars-cov-2引入人类的溢出事件可能发生在2019年底。
[0041]
sars-cov-2病毒体的直径大约为50-200纳米。与其它冠状病毒一样，sars-cov-2具有四种结构蛋白，称为s(刺突)、e(包膜)、m(膜)和n(核衣壳)蛋白；n蛋白容纳rna基因组，并且s、e和m蛋白一起产生病毒包膜。使用低温电子显微镜在原子水平上成像的刺突蛋白是负责使病毒能够附着于宿主细胞的膜并与之融合的蛋白质。
[0042]
刺突蛋白质由结构域s1、s2和s2`组成(参见图4)。s1含有负责与ace2结合的受体结合结构域。s2负责与宿主细胞的融合。在与ace2结合时，诱导了刺突的构象变化，并且tmprss在s1/s2和s2`处切割。
[0043]
sars-cov-2刺突蛋白对人细胞上的受体血管紧张素转化酶2(ace2)具有亲和力，以将它们用作细胞进入机制。在sars-cov-2病毒体附着于靶细胞后，细胞的蛋白酶tmprss2切开病毒的刺突蛋白，暴露出融合肽。病毒体然后向细胞中释放rna并迫使细胞产生和传播病毒的拷贝，这些拷贝感染更多的细胞。
[0044]
冠状病毒刺突蛋白是i类融合蛋白，并形成三聚体。三聚体s蛋白的每个单体为约180kda。α螺旋卷曲螺旋结构的形成是这类融合蛋白的特征，这种融合蛋白在其c末端部分含有预期具有α螺旋二级结构并形成卷曲螺旋的区域。
[0045]
s1含有两个亚结构域，即n末端结构域(ntd)和c末端结构域(ctd)。两者均能够用作受体结合结构域(rbd)并且结合多种蛋白质和糖。
[0046]
冠状病毒刺突蛋白在其s2结构域中含有两个七肽重复区，这是i类病毒融合蛋白的典型特征。七肽重复区包含重复的七肽abcdefg，其中a和d是参与融合过程的卷曲螺旋形成的特征性疏水残基。对于sars-cov，已经解释了hr的融合后结构；它们形成特征性六螺旋束。
[0047]
研究显示sars-cov-2对人ace2的亲和力高于原始sars病毒株。
[0048]
下表显示了用于免疫的一些肽。
[0049][0050][0051]
在这些序列中，seq id no:1包含刺突结构域的跨膜部分，而其它序列仅包含缺乏跨膜结构域的胞外结构域的部分。
[0052]
一些肽包含刺突蛋白中与病毒感染功能上相关(例如，与ace2结合，或被蛋白酶引发)的序列。
[0053]
根据本发明的方法特别是在对如covid 19的全球性大流行病作出反应时具有显著的优点。采用这种方法，抗体可以高速大量产生，因此快速反应是可能的。
[0054]
此外，它不需要使用细胞培养物，不需要对卵进行耗时的单独免疫。一旦免疫的雌性鸟可以产生大量的包含抗体的卵，并且通过重复免疫，该产生就可以维持较长的一段时间。
[0055]
在一个实施方案中，从泌乳或排卵产物中分离的抗体是多克隆抗体。
[0056]
根据依据本发明方法的一个实施方案，动物是雌性的鸟。
[0057]
根据依据本发明方法的一个实施方案，动物是雁形目的鸟。
[0058]
根据依据本发明方法的一个实施方案，动物是鸡。
[0059]
根据依据本发明方法的一个实施方案，从动物收集的排卵产物是一个或多个卵。
[0060]
根据依据本发明方法的一个实施方案，从卵纯化的抗体是igy。
[0061]
免疫球蛋白y(缩写为igy)是免疫球蛋白的一种类型，是鸟、爬行动物和肺鱼血液中的主要抗体。其还以高浓度存在于鸡卵黄中。如同其它免疫球蛋白，igy是由免疫系统与某些外来物质反应形成的一类蛋白质，并且特异性地识别外来物质。
[0062]
igy在结构和功能上均与哺乳动物igg不同，并且不与针对哺乳动物igg产生的抗体交叉反应。
[0063]
免疫的鸟的卵的卵黄含有高浓度的igy，以便使后代针对相应的病原体免疫。卵黄是水(50％)、脂质(32-35％)和蛋白质(16％)的复杂混合物。存在于卵黄内的蛋白质为4种类型：卵黄脂磷蛋白，即含磷脂蛋白(40％)；apovitellenins，含有较少的磷但较多的脂质(37.3％)；卵黄高磷蛋白，即磷蛋白(13.4％)；以及卵黄蛋白(9.3％)，其中igy是其一部分。卵黄脂质和脂蛋白的移除留下了水溶性级分，该水溶性级分含有igy和连同其它蛋白质，就免疫测定中的可用性而言，可以粗略地与动物血清进行比较。
[0064]
另一个优点是igy不与人免疫系统的fcγ受体结合。因此，它们不能结合补体或被巨噬细胞摄取，这意味着它们在抗病毒治疗中的作用被减少为仅仅抑制细胞进入。因此，降低了过冲免疫反应的风险——在covid 19患者中通常致命的症状。
[0065]
根据依据本发明方法的一个实施方案，动物是哺乳动物。
[0066]
根据依据本发明方法的一个实施方案，动物是反刍动物。
[0067]
根据依据本发明方法的一个实施方案，动物是母牛、猪、骆驼、马、驴、山羊或绵羊。
[0068]
根据依据本发明方法的一个实施方案，从动物收集的泌乳产物是乳清、乳或初乳。
[0069]
根据依据本发明方法的一个实施方案，抗体是iga、igg和igm中的至少一种。
[0070]
对于哺乳动物后代，包含在哺乳动物乳、乳清和初乳中的免疫球蛋白提供了针对微生物感染的主要抗微生物保护，并因此赋予新生儿被动免疫，直到其自身免疫系统成熟。
[0071]
通过用这些病原体或其抗原对雌性哺乳动物(如母牛)进行免疫，可以提高针对病原体的特异性抗体在奶和初乳中的浓度。
[0072]
图2显示了五种哺乳动物物种的igg、iga和igm在初乳(外圆)和乳(内圆)中的相对分布。圆圈的相对大小代表在物种中发现的总免疫球蛋白的总浓度以及初乳相对乳中的浓度。
[0073]
根据依据本发明方法的一个实施方案，蛋白质或肽具有如表1所示的最大长度，该蛋白质或肽包含至少一种选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的氨基酸序列。需注意，seq id no 1、2、5、6、或7的长度范围也适用于其相应的突变对应物seq id no 11、12、13、14或15。
[0074]
根据依据本发明方法的一个实施方案，两种或更多种蛋白质或肽被用于免疫动物，该蛋白质或肽包含至少一种选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的氨基酸序列。
[0075]
在若干实施方案中，以下组合对于免疫动物是优选的：
[0076]
(1)包含至少一种选自seq id no:3-seq id no:5和seq id no 15的氨基酸序列
的至少一种蛋白质或肽，以及包含至少一种选自seq id no:6-seq id no:10和seq id no:14-seq id no:15的氨基酸序列的至少一种蛋白质或肽，
[0077]
(2)包含至少一种选自seq id no:1-seq id no:3和seq id no:11-seq id no:12的氨基酸序列的至少一种蛋白质或肽，
[0078]
(3)以及包含至少一种选自seq id no:4-seq id no:10和seq id no:13-seq id no:15的氨基酸序列的至少一种蛋白质或肽，
[0079]
两种或更多种蛋白质或肽的这样的使用可以包括同时施用不同的蛋白质或肽，或相继施用不同的蛋白质或肽。
[0080]
如本文所用，同时施用意指两种肽在大致相同的时间以相同的剂量单位或不同的剂量单位施用，但间隔为≤3小时、≤2小时、≤1小时或≤30分钟。
[0081]
如本文所用，相继施用意指两种肽在不同时间点施用，且间隔》3小时、》10小时、》24小时、》2天、》4天、》7天、》2周或》4周。
[0082]
根据依据本发明方法的一个实施方案，
[0083]
a)至少一种单链蛋白质或肽被用于免疫，其包含两个或更多个子序列，其各自包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的氨基酸序列，以及
[0084]
b)至少一种同源或异源二聚体、同源或异源低聚体或同源或异源多聚体被用于免疫，其包含两条或更多条链，所述链各自包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no 29中任一项的氨基酸序列。
[0085]
关于选项a)，两个或更多个子序列可以是相同的(即，包含具有相同seq id no的氨基酸序列)，或不同的(即，包含具有不同seq id no的氨基酸序列)。
[0086]
这样的包含两个或更多个子序列的单链蛋白或肽优选地为如本文别处所述的多联体。
[0087]
多联体是含有直接地或通过接头(例如gs接头)串联连接的相同肽序列的多个拷贝的肽或蛋白质分子。
[0088]
这样的单链蛋白或肽优选地包含根据seq id no 30-35中任一项的氨基酸序列。这些多联体以及公开为seq id no 36-41的它们的子序列(“结构单元(building clocks)”)显示于图8中。
[0089]
多联体被选择成包含表位的重复序列，抗体对该表位的结合被认为具有病毒增殖的抑制效应。通过使用这些表位的若干重复序列，实现了使多联体呈免疫原性的临界质量，使得可以达到显著的免疫反应。
[0090]
重要的是提及到所述多联体可以是线性和/或变性肽蛋白(为此，如本文的序列表中所显示，在一些结构单元中，cys已被gly置换，以避免二硫桥的形成)。
[0091]
与此相反，根据seq id no 1-5、seq id no 11-13、或seq id no 17-29中任一者的肽和蛋白质优选地为完全折叠的蛋白质。
[0092]
进一步重要的是应理解，除了本文所公开的一般概念之一(即用于在雌性脊椎动物的泌乳或排卵产物中分离或产生抗体的方法)以外，提供如本文所述的多联体，特别是根
据seq id no 30-35中任一项的多联体和/或如seq id no 36-41所公开的子序列(“结构单元”)的实施方案也可用于动物或人的直接免疫，例如，以便生成针对sars cov 2病毒的免疫力，以便通过杂交瘤技术形成单克隆抗体，或以便疫苗接种人或动物。本文在别处所讨论的优点和优选的实施方案也转化为这样的应用。
[0093]
关于选项b)，两条或更多条链可以是相同的(即，包含具有相同seq id no的氨基酸序列)，或不同的(即，包含具有不同seq id no的氨基酸序列)。两条或更多条链可以通过一个或多个肽接头或通过一个或多个二硫桥彼此连接。
[0094]
根据依据本发明方法的一个实施方案，用于免疫的至少一种蛋白质或肽与已知在被免疫的动物中呈免疫原性的第二分子缀合。
[0095]
以这种方式，由蛋白质或肽的潜在长度不足导致免疫原性不足而引起的潜在问题得到了解决。因此，如果蛋白质或肽的长度是免疫原性不足的，则其是特别有用的。
[0096]
在一个实施方案中，这种第二分子是蛋白质(也称为“载体蛋白”)。这种载体蛋白的实例包括但不限于钥孔戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。
[0097]
根据依据本发明方法的一个实施方案，抗体的分离或纯化包括以下步骤：
[0098]
a)从卵黄移除大部分脂质和脂蛋白(“去脂”)，以及
[0099]
b)浓缩或纯化igy级分。
[0100]
许多移除大多数脂质/脂蛋白的方法如下所显示：
[0101]
·
聚乙二醇沉淀
[0102]
·
硫酸葡聚糖沉淀
[0103]
·
有机溶剂脂质溶解
[0104]
·
天然树胶、黄原胶/角叉菜胶沉淀
[0105]
·
脂质稀释/超滤
[0106]
·
磷酸盐：triton x去脂
[0107]
在卵黄去脂后，然后可以以多种方式对几乎不含脂质的溶液进行处理，以浓缩/纯化igy级分：
[0108]
·
聚乙二醇沉淀
[0109]
·
硫酸钠沉淀
[0110]
·
超滤/硫酸铵沉淀
[0111]
·
制备型电泳
[0112]
·
氯化钠沉淀
[0113]
这些方法已经在kovacs-nolan和mine(2004)，以及akita和nakai(1993)中进行了综述，其内容以引用方式并入本文。其它方法公开于tan等人(2001)、hodek等人(2013)以及和larsson(2001)中，其内容以引用方式并入本文。
[0114]
存在使用一种或多种上述方法的多种市售的igy纯化试剂盒：
[0115][0116]
根据依据本发明方法的一个实施方案，在免疫之前，收集待免疫的鸟的一个或多个卵。以这种方式，从这些卵中纯化的igy随后可用作表征目的的对照igy。
[0117]
根据依据本发明方法的一个实施方案，免疫借助于将蛋白质或肽注入鸟的胸部组织中来进行。
[0118]
根据依据本发明方法的一个实施方案，对于免疫，将剂量≥0.02且≤0.5mg的蛋白质或肽注入鸟。
[0119]
根据依据本发明方法的一个实施方案，抗体的分离或纯化包括以下步骤：
[0120]
a)任选地，通过移除脂肪而使乳或初乳脱脂，
[0121]
b)例如通过添加酸使ph降至4.6来移除酪蛋白，以及
[0122]
c)收集液相并且浓缩或纯化抗体级分。
[0123]
这样的方法例如描述于aich等人(2015)，其内容以引用方式并入本文。
[0124]
针对免疫原性蛋白的多克隆抗体分子可以从泌乳产物中分离出，并且通过公知的技术(如使用蛋白a或蛋白g的亲和层析)进一步纯化，该过程主要提供包含在泌乳产物中的igg级分。
[0125]
随后或替代地，将sars cov-2刺突蛋白或其片段固定在柱或珠上来充当捕获剂，以通过免疫亲和层析来纯化相应的抗体。
[0126]
在一个实施方案中，所述捕获剂包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的序列。
[0127]
根据依据本发明方法的一个实施方案，在免疫之前，收集待免疫的哺乳动物的乳、初乳或乳清的一个或多个样品。以这种方式，由其纯化的抗体随后可用作表征目的的对照。
[0128]
根据依据本发明方法的一个实施方案，免疫借助于通过以下至少一种方式输注或注射来注入蛋白质或肽而进行：
[0129]
·
肌内
[0130]
·
皮下
[0131]
·
乳房内或
[0132]
·
静脉内。
no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no 29中任一项的氨基酸序列。
[0151]
关于步骤a)，这样的包含两个或更多个子序列的单链蛋白或肽优选地为如本文别处所述的根据seq id no 30-35中任一项的多联体。这些多联体以及公开为seq id no 36-41的它们的子序列(“结构单元(building clocks)”)显示于图8中。
[0152]
多联体被选择成包含表位的重复序列，抗体对该表位的结合被认为具有病毒增殖的抑制效应。通过使用这些表位的若干重复序列，实现了使多联体呈免疫原性的临界质量，使得可以达到显著的免疫反应。
[0153]
重要的是提及到所述多联体可以是线性和/或变性肽蛋白(为此，如本文的序列表中所显示，在一些结构单元中，cys已被gly置换，以避免二硫桥的形成)。
[0154]
关于步骤b)，这样的单体优选地为选自seq id no 1-5、seq id no 11-13、或seq id no 17-29中的至少一种。这些单体优选地为完全折叠的蛋白质。
[0155]
进一步重要的是应理解，除了本文所公开的一般概念之一(即用于在雌性脊椎动物的泌乳或排卵产物中分离或产生抗体的方法)以外，在第一步骤中通过施用至少一种单链蛋白质或肽(优选地多联体)免疫受试者以及在第一步骤后执行的第二步骤中通过施用至少一种单体免疫受试者的这样的概念也可用于动物或人的直接免疫，例如，以便生成针对sars cov 2病毒的免疫力，以便通过杂交瘤技术形成单克隆抗体，或以便疫苗接种人或动物。本文在别处所讨论的优点和优选的实施方案也转化为这样的应用。
[0156]
根据依据本发明方法的一个实施方案，用于免疫的蛋白质或肽中的至少一种通过肽合成或重组表达中的至少一种而产生。
[0157]
通过合成产生的肽通常比蛋白质短，并由此在大多数情况下仅呈现线性表位。较大的肽和蛋白质典型地通过使用重组技术表达而产生。
[0158]
这种较大的肽和蛋白质将形成一级、二级和可能的三级折叠，类似于天然蛋白质的折叠，并由此除线性表位以外还提供构象表位。尽管蛋白质被认为更具免疫原性，但尤其是大蛋白质具有不必要的抗原负荷——这仅对保护性免疫反应有很小贡献。肽通常需要用于递送的颗粒载体以及免疫原性的佐剂。在另一方面，与蛋白质相比，肽诱导高度靶向的免疫反应，给予将其导向其中抗体结合干扰感染过程的区域的机会。这样的基于肽的靶向可以增加产生高滴度中和抗体的机会。对于呈现这种功能的结构域的蛋白质也是如此。
[0159]
根据依据本发明方法的一个实施方案，重组表达在以下至少一种中进行：
[0160]
·
原核表达系统，如大肠杆菌(e.coli)或枯草芽孢杆菌(b.subtilis)
[0161]
·
基于真菌或酵母的表达系统，如酿酒酵母(s.cerevisiae)
[0162]
·
原生动物表达系统，如嗜热四膜虫(tetrahymena thermophila)
[0163]
·
杆状病毒/昆虫表达系统
[0164]
·
哺乳动物表达系统，如cho细胞。
[0165]
原核表达系统如大肠杆菌和芽孢杆菌用于生产重组蛋白，例如，大肠杆菌中的胰岛素。枯草芽孢杆菌额外地显示出将重组蛋白从细胞分泌到培养基中的优点。由于糖基化缺失，原核系统相对较低地但具有真核翻译后蛋白质修饰。
[0166]
真菌或酵母表达系统享有生产的简易性和低成本，并且还提供如糖基化的翻译后修饰。
[0167]
原生动物表达系统如嗜热四膜虫代表另一种真核表达系统。
[0168]
在哺乳动物细胞系统中，可以产生与其天然对应物没有差异的重组哺乳动物蛋白。缺点是在这种系统中表达的成本高，这尤其是由于纯度的努力(生产地点，培养基)以及所生产蛋白质的低时空收率。
[0169]
关于待表达的sars cov-2抗原，应注意以下方面：
[0170]
当蛋白质能够以可溶形式表达时，大肠杆菌表达系统是非常好的系统。该系统是快速且成本有效地获得大量抗原的最佳替代方案。但该系统不能使蛋白质糖基化。
[0171]
哺乳动物表达系统可以表达sars cov-2的全长刺突蛋白以及其部分。这些蛋白质则将与人中产生的那些相同，包括糖基化。如果真实的糖基化是免疫反应的重要问题，该系统会是选择。主要缺点是这种系统的成本高以及收率低。这使得这样的项目在经济上不可行。
[0172]
生产和纯化方法的进一步细节尤其公开于us8173783和us9873732中，其内容以引用方式并入本文。
[0173]
根据本发明的另一方面，一种特异性结合蛋白质或肽的抗体，该蛋白质或肽包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的序列，其中蛋白质或肽是sars cov-2刺突蛋白、包含sars cov-2刺突蛋白，或是其片段。
[0174]
根据本发明的另一方面，两种或更多种抗体的组合，该抗体特异性结合一种或多种选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的蛋白质或肽，其中蛋白质或肽是sars cov-2刺突蛋白、包含sars cov-2刺突蛋白，或是其片段。
[0175]
根据本发明的另一方面，抗体
[0176]
·
抑制sars-cov2与人ace2受体的结合，和/或
[0177]
·
通过阻断刺突蛋白在s1/s2或s2
′
处的蛋白水解切割来干扰刺突蛋白的激发(priming)。
[0178]
根据本发明的一个实施方案，一种或多种抗体具有≤1
×
105的中和滴度(nt
50
)。
[0179]
在一个优选的实施方案中，一种或多种抗体具有≤5
×
104；≤5
×
104；≤1
×
104；≤5
×
103；≤1
×
103；≤5
×
102；≤1
×
102；≤5
×
101；或最优先的≤1
×
101的中和滴度(nt
50
)。
[0180]
如本文所用，术语“中和滴度”定义为与无抗体病毒相比中和病毒活性50％的抗体浓度。
[0181]
如本文所用，术语“中和”是指抗体结合病毒并降低致病原的生物活性(例如毒力)的能力。中和的最低要求是抗体结合致病原的能力。在一个实施方案中，抗体免疫特异性结合病毒的至少一个特定表位或抗原决定簇。
[0182]
中和滴度可用噬斑减少中和试验来测定。将待测试的抗体溶液稀释并与病毒悬浮液混合。将其孵育以允许抗体与病毒反应。将其倾注在宿主细胞的汇合单层上。细胞层的表面覆盖一层琼脂或羧甲基纤维素，以防止病毒不加区别地传播。噬斑形成单位的浓度可以通过数天后形成的噬斑(感染细胞的区域)的数目来估计。取决于病毒，通过显微镜观察、荧光抗体或与受感染细胞反应的特异性染料来测量噬斑形成单位。与不含抗体的病毒相比，使噬斑数目减少50％的抗体浓度给出了存在多少抗体或其有效程度的量度。
[0183]
目前其被认为是用于检测和测量能够中和引起许多疾病的病毒的抗体的“黄金标准”[2][3]
。它具有比其它测试如血细胞凝集和许多商业酶免疫测定更高的灵敏度而不损害特异性。此外，它比用于诊断某些虫媒病毒的其它血清学方法更具特异性。
[0184]
然而，相对于给出快速结果(通常数分钟至数小时)的eia试剂盒，该测试相对繁琐且费时(数天)。
[0185]
最近已确定的关于该测定的一个问题是抗体的中和能力取决于病毒体成熟状态和测定中使用的细胞类型
[4]
。因此，如果将错误的细胞系用于测定，当抗体实际上不具有中和能力时，其似乎却具有中和能力，或反之亦然，当它们实际上具有中和能力时，它们却似乎无效。
[0186]
用于测定nt
50
的一个测定描述于he等人(2005)，其内容以引用方式并入本文。简而言之，使用fugene6转染试剂(rocheapplied science)，用编码sars-cov s蛋白的质粒和编码env缺陷型荧光素酶表达hiv-1基因组的质粒(pnl4-3.luc.re)共转染293t细胞。将上清液在转染后72小时收获并用于ace2/293t细胞的单周期感染。将含有病毒的上清液与包含根据本发明的抗体的稀释系列在37℃下预孵育1小时，然后添加至细胞。24小时后添加新鲜培养基，然后用细胞裂解缓冲液(promega)裂解细胞。在添加荧光素酶底物(promega)后，在ultra 384光度计(tecan)中测定相对荧光素酶活性。计算sars病毒中和并表示为50％中和抗体滴度nt
50
(chou,2006，其内容以引用方式并入本文)。
[0187]
根据用于测定nt
50
的另一种测定，将包含根据本发明的抗体的稀释系列与等体积的sars-cov-2混合并在37℃下孵育1小时。然后在96孔板中用100ml病毒-抗体混合物感染vero e6细胞。在孵育6天后，中和滴度被确定为抗体的终点稀释度，在该稀释度下sars-cov-诱导的细胞病变效应被抑制50％。该测定描述于yusuhi等人(2014)中，其内容以引用方式并入本文。
[0188]
根据本发明的一个实施方案，一种或多种抗体与ace2竞争性结合sars-cov2刺突蛋白。
[0189]
根据本发明的一个实施方案，一种或多种抗体是多克隆抗体。
[0190]
在一个实施方案中，当从卵中纯化时，抗体是多克隆igy抗体。在另一个实施方案中，当从乳清、乳或初乳中纯化时，抗体是igg、igg或igm。
[0191]
根据本发明的一个实施方案，一种或多种抗体通过根据以上描述的方法产生。
[0192]
根据本发明的另一方面，提供了一种包含根据以上描述的至少一种抗体的产品，该产品被提供为选自以下的至少一种：
[0193]
·
锭剂
[0194]
·
口香糖
[0195]
·
片剂
[0196]
·
霜剂或凝胶剂
[0197]
·
漱口溶液剂或漱口水
[0198]
·
用于局部施用的液体溶液剂
[0199]
·
用于口内、气管内或鼻内施用的气雾剂，和/或
[0200]
·
用于静脉内、皮下或肌内施用的水性溶液剂
[0201]
根据本发明的一个实施方案，所述产品包埋或提供在选自以下的至少一项中：
[0202]
·
呼吸面罩
[0203]
·
用于流体介质，包括气体和液体的过滤器，和/或
[0204]
·
消毒剂凝胶剂、液体剂、气雾剂或喷雾剂。
[0205]
根据本发明的一个方面，根据以上描述的一种或多种抗体被提供用于治疗患有或诊断有sars cov-2感染的患者或用于预防此类病症(的药物的制造)。
[0206]
根据本发明的一个方面，根据以上描述的产品被提供用于治疗患有或诊断有sars cov-2感染的患者，或用于预防此类病症。
[0207]
根据本发明的一个方面，在根据以上描述的抗体或产品中，抗体与以下至少一种共同施用，或产品还包含以下至少一种：
[0208]
·
蛋白酶抑制剂，优选地tmprss2的抑制剂或cov-2c30内肽酶(也称为mpro或3clpro)的抑制剂
[0209]
·
核苷或核苷酸类似物，优选地其被病毒rna依赖性rna聚合酶接受
[0210]
·
il-6拮抗剂，
[0211]
·
可溶性血管紧张素转化酶2，
[0212]
·
抗风湿药，和/或
[0213]
·
包含与sarscov2刺突蛋白的s1/s2序列同源的序列的肽，
[0214]
其中共同施用可以同时或连续进行。
[0215]
核苷类似物和核苷酸类似物对应于它们的核苷酸或核苷酸对应物，并且被给定dna-或rna聚合酶或转录酶接受，但是以使得聚合酶过程或转录酶过程被抑制或阻碍的方式被化学修饰。
[0216]
一种优选的核苷类似物是2-乙基丁基-(2s)-2-{[(s)-{[(2r,3s,4r,5r)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢-2-呋喃基]甲氧基}(苯氧基)磷酰基]氨基}丙酸酯(inn：瑞德西韦)。
[0217]
另一种优选的核苷类似物是1-[(2r,3r,4r,5r)-3,4-二羟基-5-羟甲基-草脲胺-2-基]-1,2,4-三唑-3-甲酰胺(inn：利巴韦林)
[0218]
另一种优选的核苷类似物是6-氟-3-羟基-2-吡嗪甲酰胺(inn：法匹拉韦)。
[0219]
一种优选的tmprss2的抑制剂是(4-{2-[2-(二甲氨基)-2-氧代乙氧基]-2-氧乙基}苯基)(4-胍基苯甲酸酯)((4-{2-[2-(dimethylamino)-2-oxoethoxy]-2-oxoethyl}phenyl)(4-carbamimidamidobenzoat))(inn：卡莫司他)
[0220]
一种优选的cov-2c30内肽酶的抑制剂是α-酮酰胺如α-酮酰13b，如描述于zhang等人(2020)，其内容以引用方式并入本文。另一种优选的cov-2c30内肽酶的抑制剂是洛匹那韦。
[0221]
il-6拮抗剂干扰il-6信号传导途径，例如通过结合il6或其受体il-6r。一种优选的il-6拮抗剂是抗体托珠单抗，也称为阿替珠单抗，它是针对白介素-6受体(il-6r)的人源化单克隆抗体。另一种优选的il-6拮抗剂是sarilumab，它是针对白介素-6受体的人单克隆抗体。
[0222]
可溶性血管紧张素转化酶2在batlle等人(2020)中描述为冠状病毒感染疗法的潜在方法，其内容以引用方式并入本文。
[0223]
合适的抗风湿药包括但不限于氯喹/羟氯喹、tnf拮抗剂如阿达木单抗、依那西普、
英夫利西单抗、塞妥珠单抗和戈利木单抗，或janus激酶抑制剂如巴瑞克替尼。
[0224]
包含与sarscov2刺突蛋白的s1/s2序列同源的序列的肽可包含根据seq id no:6或7的氨基酸序列或其片段。以这种方式，可以竞争性地抑制宿主的tmprss2，从而避免sars cov-2刺突蛋白的切割。在一个实施方案中，这样的肽可包含一个或多个d氨基酸残基以避免其切割并因此增加竞争性抑制。
实施例
[0225]
虽然已经在附图和前述描述中详细说明和描述了本发明，但是此类说明和描述被认为是说明性或示例性的而非限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。通过研究附图、公开内容和所附权利要求，本领域技术人员在实践所要求保护的本发明时可以理解和实现所公开实施方案的其他变型。在权利要求中，词语“包括”不排除其他元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。在相互不同的从属权利要求中叙述某些措施的纯粹事实并不指示不能有利地使用这些措施的组合。权利要求中的任何附图标记不应解释为限制范围。
[0226]
本文所公开的所有氨基酸序列从n末端到c末端显示。
[0227]
实施例1：sars-cov2刺突蛋白结合
[0228]
将96孔板用sars-cov2刺突蛋白预包被。将不同稀释度的对照或测试样品添加到孔中并孵育。洗涤后，将辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗鸡igg缀合物添加到孔中，其结合固定的抗sars-cov2刺突蛋白特异性抗体。然后根据标准方案使用hrp定量系统显色或化学发光对结合进行分析。结果显示于图5中。
[0229]
实施例2：cpe中和测定
[0230]
cpe(细胞病变效应)中和测定是用于筛选抗病毒剂以及中和免疫球蛋白的广泛采用的测定形式。在该测定中，易感细胞的宿主细胞死亡是病毒感染的结果，且细胞活力是替代读出。可以使用几种测定来测试细胞的活力。在这种情况下，通过洗涤从宿主细胞的汇合单层移除无活力细胞，并且用亚甲蓝对活细胞进行染色。因此，阳性免疫球蛋白制剂是保护宿主细胞免受病毒cpe的那些。
[0231]
将归一化数目的传染性sars-cov-2病毒体与系列稀释的鸡igy抗体制剂一起孵育。在病毒体/igy抗体混合物的一小时中和时段后，将其接种到含有宿主细胞的汇合细胞单层的96孔板中。在这种情况下使用的宿主细胞是vero e6细胞。将板在具有5％co2的潮湿气氛中于37℃孵育72小时。在孵育后，通过用适当的缓冲液洗涤来移除无活力细胞，而未感染的完整细胞保留下来。将保留的活细胞用甲醇固定在孔中并用亚甲蓝染色。
[0232]
可以完全抑制cpe形成的抗体稀释度越高，就认为抗体越有效。结果显示于图6中。
[0233]
实施例3：荧光噬斑减少测定
[0234]
在该噬斑减少中和测试prnt中，将标准数目的感染性sars-cov-2单位与系列稀释的鸡igy抗体制剂一起孵育。在病毒/igy抗体混合物的一小时中和时段后，将100μl的混合物添加到易感vero细胞的汇合单层中16小时(
±
2小时)。在该孵育期后，固定细胞，并将病毒感染的细胞用sars-cov-2特异性多克隆抗体，继之以第二山羊抗兔igg alexa fluor-555缀合物免疫染色。用cell imaging multi-mode读取器(biotek)分析所有孔的图像。根据zielinska等人,virol j.2005描述的方法计算50％中和滴度(vn
50
)。结果显示于图7中。
[0235]
实施例4：从法夫驹形氏酵母(komagataella phaffii)中纯化刺突蛋白
[0236]
将具有编码sars-cov2刺突蛋白的c末端his标记的全长蛋白(aa 15-1213)、s1结构域(aa 15-685)和受体结合结构域(aa 331-524)的整合序列的法夫驹形氏酵母δoch1株在30℃下以150rpm培养6天。将细胞在4℃下以5000g收获30分钟，然后将所得上清液进一步微滤(0.2μm)和超滤(10kda截留)。然后，使用ni-nta亲和层析，将超浓缩的样品纯化至表观同质性(》95％纯度，通过sds-page证实)。将洗脱级分合并，使用vivaspin turbo 15超滤离心浓缩器(10kda截留)浓缩，并再缓冲至100mm tris ph 7.8、1mm cacl2、2mm tcep。
[0237]
实施例5：从sf9昆虫细胞中纯化刺突蛋白
[0238]
将sf9昆虫细胞用编码sars-cov2刺突蛋白的c末端his标记的全长蛋白(aa 15-1213)、s1结构域(aa 15-685)和受体结合结构域(aa 319-541和aa 319-591)的重组杆状病毒进行感染。全长蛋白在c末端含有三聚化基序的折叠，继之以6x his-标记。
[0239]
基序dkve中的aa k986和v987变为脯氨酸且弗林蛋白酶切割侧682-685的aa变为agag。所有刺突蛋白构建体借助于gp67分泌信号分泌到培养基中。
[0240]
感染后，将细胞在27℃下以90rpm培养4天。将细胞在4℃下以5000g收获30分钟，然后将所得上清液进一步微滤(0.2μm)和超滤(10kda截留)。然后，使用ni-nta亲和层析，将超浓缩的样品纯化至表观同质性(》95％纯度，通过sds-page证实)。将洗脱级分合并，使用vivaspin turbo 15超滤离心浓缩器(10kda截留)浓缩，并再缓冲至100mm tris ph 7.8、1mm cacl2、2mm tcep。
[0241]
实施例6：多联体的纯化
[0242]
使含有来自sars-cov2刺突蛋白的六个不同部分(参见序列)的重复氨基酸序列的人工多联体在大肠杆菌中重组地表达为包涵体(ib)。将含有编码一种多联体的pet28a质粒的大肠杆菌bl21(de3)菌株在37℃和150rpm下培养至od
600
为0.6，然后用0.25mm iptg诱导基因表达。使细胞在30℃和150rpm下进一步生长18小时。将细胞在4℃下以5000g收获30分钟，然后使用bugbuster mastermix(merck,darmstadt)裂解1小时，随后在最大功率下超声处理5分钟。将裂解的细胞在4℃下以20000g离心30分钟，并丢弃所得上清液。将ib用100mm tris ph 7.8、1mm cacl2、2mm tcep、2m脲、5％triton x100洗涤2-3x以移除所有细胞膜、脂质和膜结合蛋白。在每个洗涤步骤后，在4℃下以20000g进行30分钟的离心步骤。然后，将ib使用100mm tris ph 7.8、1mm cacl2、2mm tcep洗涤1x以移除脲和triton x100，随后在4℃下以20000g进行30分钟离心步骤。将纯化的ib使用100mm tris ph 7.8、1mm cacl2、2mm tcep、8m盐酸胍再溶解。然后，将溶解的ib在4℃下以20000g离心30分钟。然后，将所得的上清液使用0.2μm过滤器过滤，并使用变性ni-nta亲和层析进一步纯化。将洗脱级分合并，使用vivaspin turbo 15超滤离心浓缩器(10kda截留)浓缩，并再缓冲至100mm tris ph 7.8、1mm cacl2、2mm tcep、4m盐酸胍。
[0243]
多联体显示于图8中。
[0244]
实施例7：sars-cov-2病毒中和测定
[0245]
溶解冻干测试项目
[0246]
通过在37℃下振荡15-30分钟，将冻干的igy抗体制剂溶解于预温热的dmem+2％fbs+pen-strep-g中。如果不是所有的冻干制剂都溶解，则将igy抗体-dmem溶液在rt下以3000rpm离心10分钟以移除任何未溶解的颗粒。在病毒中和测试中测试这些igy溶液之前，
使igy抗体-dmem溶液通过0.45微米过滤器。
[0247]
测定各igy制剂的起始浓度
[0248]
由于高浓度的鸡igy抗体制剂可能对vero细胞有毒性，将执行细胞毒性测定。将vero细胞与系列稀释的各鸡igy抗体制剂一起孵育3天。这些系列稀释液的第一浓度为5mg/ml。3天后，监测细胞毒性。不引起细胞毒性的各igy抗体制剂的最高浓度将用作病毒中和测试中的起始浓度。
[0249]
测试系统的描述
[0250]
经由噬斑减少(prnt)和基于cpe的病毒中和测定，测定鸡igy抗体制剂抑制噬斑形成(感染)的能力。
[0251]
基于cpe的病毒中和测定
[0252]
在这种基于cpe的病毒中和测定中，将标准数目的感染性sars-cov-2单位(wuhan或b.1.1.7)与系列稀释的鸡igy抗体制剂一起孵育。在病毒/igy抗体混合物的一小时中和时段后，将100μl的混合物添加到易感vero细胞的汇合单层中3天。在该孵育期后，通过筛选细胞中cpe的存在来确定鸡igy抗体制剂100％抑制cpe发展的能力。可以完全抑制cpe形成的抗体稀释度越高，就认为抗体越有效。
[0253]
prnt
[0254]
在该prnt中，将标准数目的感染性sars-cov-2单位(wuhan或b.1.1.7)与系列稀释的鸡igy抗体制剂一起孵育。在病毒/igy抗体混合物的一小时中和时段后，将100μl的混合物添加到易感vero细胞的汇合单层中16小时(
±
2小时)。在该孵育期后，固定细胞，并将病毒感染的细胞用sars-cov-2特异性多克隆抗体，继之以第二山羊抗兔igg alexa fluor-555缀合物免疫染色。使用配备有软件的cytation
tm 1 cell imaging multi-mode读取器(biotek)来分析所有孔的图像以定量sars-cov-2-阳性细胞。根据zielinska,e等人,virol j.2005描述的方法来计算50％和80％中和滴度。
[0255]
参考文献
[0256]
这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文中。
[0257]
·
kovacs-nolan,j.和y.mine,2004.avian and poultry biology reviews 15(1),2004,25-46.
[0258]
·
hoffmann等人,2020.cell 181,第181
ꢀ‑
280页
[0259]
·
akita,em和s.nakai,1993.j.immunol.methods 160:207-14.
[0260]
·
tan sh,mohamedali a,kapur a,lukjanenko l,baker ms,2012.j immunol methods.j29；380(1-2):73-6.
[0261]
·
和larsson,2001.upsala j med sci 106:99
–
110
[0262]
·
petr hodek,pavel trefil,jiri simunek,jiri hudecek,marie stiborova,2013.int.j.electrochem.sci.,8,113-124.
[0263]
·
aich r,batabyal s joardar sn,2015.vet world.may；8(5):621-4.
[0264]
·
batlle,daniel&wysocki,jan&satchell,karla.(2020)clinical science.134.543-545.
[0265]
·
yasui,fumihiko&kohara,michinori&kitabatake,masahiro&nishiwaki,tetsu&fujii,hideki&tateno,chise&yoneda,misako&morita,kouichi&matsushima,
kouji&koyasu,shigeo&kai,chieko,2014.virology.454-455.157-168.
[0266]
·
linlin zhang,daizong lin,xinyuanyuan sun,ute curth,christian drosten,lucie sauerhering,stephan becker,katharina rox,rolf hilgenfeld,2020.science 24,409-412
[0267]
·
ting-chao chou pharmacological reviews,2006年9月,58(3)621-681
[0268]
·
yuxian he,hong lu,pamela siddiqui,yusen zhou和shibo jiang:j immunol,2005年4月15日,174(8)4908-4915
[0269]
·
zielinska,e等人,virol j.2005.
[0270]
序列
[0271]
以下序列构成本技术公开内容的一部分。本技术也提供了wipo st 25兼容的电子序列表。为避免疑义，如果下表中的序列与电子序列表之间存在差异，则该表中的序列应视为正确的序列。核苷酸序列仅在电子序列表中公开。
[0272]
需注意，seq id no 1-10对应于野生型刺突蛋白、或其片段或表位。需注意，seq id no 11-15相对于seq id no 1、2、5、6或7包含一个或两个置换。
[0273]
在seq id no:11、12、13和15中，如在相应的野生型蛋白质或肽中，在肽基序“ars”中的精氨酸残基(r)被丙氨酸残基(a)取代，以得到肽基序“aas”。
[0274]
这同样适用于seq id no:11、12和14，其中如在相应的野生型蛋白质或肽中，在肽基序“krs”中的精氨酸残基(r)被丙氨酸残基(a)取代，以得到肽基序“kas”。
[0275]
如在相应的野生型蛋白质或肽中，肽基序ar和kr代表蛋白酶，例如tmprss2(跨膜丝氨酸蛋白酶2型)和其它相关蛋白酶的切割位点。为了稳定化针对蛋白水解切割的位置，发明人突变了用于免疫的蛋白质和肽中的相应位点。术语“s1”和“s2”的解释参见正文中的别处。
[0276]
需注意，seq id no:11和12包含两个置换(ars-》aas和krs-》kas)。然而，申请人认为仅具有这两种置换之一的seq id no:11和12的变体同样是有用的并且因此应当被认为是公开的，并且被本发明的范围所涵盖。
[0277]
还应当注意，一些序列包含分泌信号肽，其对于免疫原性并非总是必需的。这些序列应当被认为在具有和不具有sch分泌信号肽的情况下是公开的。
[0278]
还应当注意，一些seq id no在基序dkve中包含k和v各自向p的置换。然而，申请人认为具有dkve的变体也应视为公开为具有dppe作为代替，反之亦然。
[0279]
[0280]
[0281]
[0282]
[0283]
[0284]
[0285]
[0286]
[0287]
[0288]
[0289][0290]
[0291]

技术特征：
1.一种用于分离或产生抗体的方法，所述方法包括：
·
通过施用至少一种蛋白质或肽对雌性脊椎动物进行免疫，所述蛋白质或肽包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的至少一种氨基酸序列，
·
免疫后从所述动物收集一种或多种泌乳或排卵产物，以及
·
从所述产物中分离或纯化至少一种抗体，其中所述蛋白质或肽是sars cov 2刺突蛋白，包含sars cov 2刺突蛋白，或是sars cov 2刺突蛋白的片段。2.根据权利要求1的方法，其中所述动物是雌性的鸟。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述动物是雁形目的鸟。4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述动物是鸡。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中从所述动物收集的所述排卵产物是一个或多个卵。6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中从所述卵纯化的抗体是igy。7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述动物是雌性哺乳动物。8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述动物是反刍动物。9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述动物是母牛、猪、骆驼、马、驴、山羊或绵羊。10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中从所述动物收集的所述泌乳产物是乳清、乳或初乳。11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗体是iga、igg和igm中的至少一种。12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白质或肽具有如表1所示的最大长度，所述蛋白质或肽包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的至少一种氨基酸序列。13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中两种或更多种蛋白质或肽被用于免疫所述动物，所述蛋白质或肽包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的至少一种氨基酸序列。14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中a)至少一种单链蛋白质或肽被用于免疫，其包含两个或更多个子序列，其各自包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的氨基酸序列，并且/或b)至少一种同源或异源二聚体、同源或异源低聚体或同源或异源多聚体被用于免疫，其包含两条或更多条链，所述链各自包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no 29中任一项的氨基酸序列。15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中用于免疫的至少一种蛋白质或肽与已知
在被免疫的所述动物中具有免疫原性的第二分子缀合。16.根据权利要求1-6和12-15中任一项的方法，其中所述抗体的所述分离或纯化包括以下步骤：a)从卵黄移除大部分脂质和脂蛋白(“去脂”)，以及b)浓缩或纯化igy级分。17.根据权利要求1-6和12-16中任一项的方法，其中在免疫之前，收集待免疫的所述鸟的一个或多个卵。18.根据权利要求1-6和12-17中任一项的方法，其中免疫借助于将所述蛋白质或肽注入所述鸟的胸部组织中来进行。19.根据权利要求1-6和12-18中任一项的方法，其中对于免疫，将剂量在≥0.02和≤0.5mg之间的蛋白质或肽注射入所述鸟。20.根据权利要求1和6-19中任一项的方法，其中所述抗体的所述分离或纯化包括以下步骤：a)任选地，通过移除脂肪而使乳或初乳脱脂，b)移除酪蛋白，例如通过添加酸使ph降至4.6来移除，以及c)收集液相并且浓缩或纯化抗体级分。21.根据权利要求1和6-20中任一项的方法，其中在免疫之前，收集待免疫的所述哺乳动物的乳、初乳或乳清的一个或多个样品。22.根据权利要求1和6-21中任一项的方法，其中免疫借助于通过以下中的至少一种来注射所述蛋白质或肽而进行：
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肌内
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皮下
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乳房内或
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静脉内输注或注射。23.根据权利要求1和6-22中任一项的方法，其中对于免疫，将剂量≥0.05且≤2mg的蛋白质或肽注射入所述哺乳动物。24.根据前述权利要求中任一项的方法，其中对于免疫，将佐剂与所述至少一种蛋白质或肽共同施用。25.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使免疫重复1至10次。26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在重复的免疫中，所述蛋白质或肽的量降低至初始剂量的≥70％和≤10％之间。27.根据前述权利要求中任一项的方法，其中免疫通过至少两个步骤执行，其中，c)在第一步骤中，通过施用至少一种单链蛋白质或肽对所述鸟或哺乳动物进行免疫，所述单链蛋白质或肽包含两个或更多个子序列，其各自包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的氨基酸序列，以及d)在所述第一步骤后执行的第二步骤中，通过施用至少一种单体对所述鸟或哺乳动物进行免疫，所述单体包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、
seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no 29中任一项的氨基酸序列。28.根据前述权利要求中任一项的方法，其中用于免疫的所述蛋白质或肽中的至少一种通过肽合成或重组表达中的至少一种而产生。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述重组表达在以下中的至少一项中进行：
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原核表达系统，如大肠杆菌(e.coli)或枯草芽孢杆菌(b.subtilis)
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基于真菌或酵母的表达系统，如酿酒酵母(s.cerevisiae)
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原生动物表达系统，如嗜热四膜虫(tetrahymena thermophila)
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杆状病毒/昆虫表达系统
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哺乳动物表达系统，如cho细胞。30.一种特异性结合蛋白质或肽的抗体，所述蛋白质或肽包含选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的序列，其中所述蛋白质或肽是sars cov-2刺突蛋白、包含sars cov-2刺突蛋白，或是sars cov-2刺突蛋白的片段。31.两种或更多种抗体的组合，所述抗体特异性结合选自seq id no:1-seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25中任一项或seq id no:26-seq id no:41中任一项的一种或多种蛋白质或肽，其中所述蛋白质或肽是sars cov-2刺突蛋白、包含sars cov-2刺突蛋白，或是sars cov-2刺突蛋白的片段。32.根据权利要求30或31中任一项所述的一种或多种抗体，其
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抑制sars-cov2与人ace2受体的结合，并且/或
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通过阻断刺突蛋白在s1/s2或s2处的蛋白水解切割来干扰刺突蛋白的激发。33.根据权利要求30-32中任一项的一种或多种抗体，其具有≤1
×
105的中和滴度(nt
50
)。34.根据权利要求30-33中任一项的一种或多种抗体，其与ace2竞争性结合sars-cov2刺突蛋白。35.根据权利要求30-34中任一项的一种或多种抗体，其是多克隆抗体。36.根据权利要求30-35中任一项的一种或多种抗体，其通过根据权利要求1-29中任一项的方法产生。37.一种产品，其包含根据权利要求30-36中任一项的至少一种抗体，所述产品被以选自以下的至少一种提供：
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锭剂
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口香糖
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片剂
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霜剂或凝胶剂
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漱口溶液或漱口水
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用于局部施用的液体溶液
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用于口内、气管内或鼻内施用的气雾剂，和/或
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用于静脉内、皮下或肌内施用的水性溶液。38.一种产品，其包含根据权利要求30-36中任一项的至少一种抗体，所述产品在选自
以下的至少一项中包埋或提供：
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呼吸面罩
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用于流体介质，包括气体和液体的过滤器，和/或
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消毒剂凝胶剂、液体、气雾剂或喷雾剂。39.根据权利要求30-36中任一项的一种或多种抗体，其用于治疗患有或诊断有sars cov-2感染的患者，或用于预防此类病症。40.根据权利要求37-38中任一项的产品，其用于治疗患有或诊断有sars cov-2感染的患者，或用于预防此类病症。41.根据前述权利要求中任一项的一种或多种抗体或产品，所述一种或多种抗体与以下中的至少一种共同施用，或所述产品还包含以下中的至少一种：
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蛋白酶抑制剂，优选地tmprss2的抑制剂或cov-2c30内肽酶(也称为mpro或3clpro)的抑制剂
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核苷或核苷酸类似物，优选地其被病毒rna依赖性rna聚合酶接受
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il-6拮抗剂，
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可溶性血管紧张素转化酶2，和/或
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包含与sarscov2刺突蛋白的s1/s2序列同源的序列的肽，其中共同施用可以同时或连续进行。

技术总结
本发明涉及特异性结合SARS CoV-2刺突蛋白的抗体及其制造方法。白的抗体及其制造方法。白的抗体及其制造方法。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：EW集团有限公司
技术研发日：2021.05.18
技术公布日：2023/9/7