一种与奶绵羊抗病力性状相关的SNP位点组合、探针、芯片及其应用

一种与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合、探针、芯片及其应用
技术领域
1.本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合、探针、芯片及其应用。


背景技术：

2.由于绵羊奶蛋白质含量高，组成最接近母乳，而随着人们生活水平的提高，对绵羊奶和奶绵羊的需求也在迅速增加，从而导致对奶绵羊的需求；而我国的奶绵羊产业刚刚起步，尚未形成产业集群，引进的高产奶绵羊个体及后代中，一部分会出现抗逆性较差的情况，比如容易患有乳房炎、呼吸道疾病、消化道疾病等疾病；而反复的生产实践证明，在不同品种或品系、甚至不同个体之间，对于同一病原经常表现出不同的敏感性或抵抗力，多数疾病的发生受遗传因素的控制，因此，从遗传因素方面入手，可以通过鉴定与抗病力性状紧密相关的单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，snp)，将分子育种和表型选育有效结合，筛选先天性抗病力强的奶绵羊个体，对于提高抗逆个体选留的育种进程具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一种与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合、探针、芯片及其应用。
4.为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
5.一种与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合，所述snp位点组合包括822个snp位点；所述822个snp位点的物理位置是基于oar_rambouillet_v1.0参考基因组比对确定的，oar_rambouillet_v1.0参考基因组的获取网址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/gcf_002742125.1/；所述snp位点的位置及变异信息采用染色体_物理位置：参考基因型/变异等位基因型的形式进行表示；所述822个snp位点的位置及位置及变异信息见表1；
6.表1
7.8.9.10.11.12.13.[0014][0015]
作为进一步的技术方案，抗病力包括抗乳房炎、抗呼吸道疾病、抗消化道疾病、抗口腔疾病中的一种或多种。
[0016]
一套检测所述的与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合探针。
[0017]
一种检测所述的与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合液相芯片。
[0018]
一种所述的与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合在基因组选择育种、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定和系谱纠偏、分子辅助育种、抗病力性状评估任一项中的应用。
[0019]
一套所述的探针在基因组选择育种、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定和系谱纠偏、分子辅助育种、抗病力性状评估任一项中的应用。
[0020]
一种所述的液相芯片在基因组选择育种、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定和系谱纠偏、分子辅助育种、抗病力性状评估任一项中的应用。
[0021]
在本发明中，抗病力或先天抗病力指的是奶绵羊患病后的恢复能力，以奶绵羊患病后达到治愈所进行给药次数进行评估，给药次数越多，说明其抗病力或先天抗病力越弱，给药次数越少，说明其抗病力或先天抗病力越强。
[0022]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0023]
1、本发明通过对与抗病力性状紧密相关的822个snp位点的基因分型，可以对奶绵羊的先天抗病力进行评估，从而可应用于奶绵羊的基因组选择育种、分子辅助育种、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定和系谱纠偏评估中，其分型检测准确性高、检测周期短、检测成本低，可进行大规模的位点检测，便于高效的开展抗病力分子标记和基因组选育工作；
[0024]
2、本发明采用液相芯片及gbts靶向测序基因型检测技术进行基因分型，其芯片具有可增删、高精准度、高灵敏度的特点。
附图说明
[0025]
图1为各染色体上snp位点数目分布情况图；
具体实施方式
[0026]
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]
实施例1：奶绵羊snp芯片位点、探针及液相芯片产品的设计与开发
[0028]
snp位点开发时，对299只东佛里生羊和湖羊的级进杂交二代奶绵羊进行10x全基因组重测序，然后对测序数据利用bwa软件将数据比对到oar_rambouillet_v1.0参考基因组，得到bam文件，利用slct构建每个样本的gvcf文件，最后利用slmgvcf_gpu合并gvcf文件，得到657个样本的vcf文件；继续使用plink 1.9软件进行过滤(参数：
‑‑
mind 0.1
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maf0.01
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geno 0.1)，使用bcftools 1.13软件(参数：-m2-m2-vsnps)保留二等位基因，得到质控后的snps数据集；然后基于质控后的snps数据集，使用plink 1.9软件转换gwas分析所需的bed、bim和fam文件并进行pca主成分分析(参数：
‑‑
pca)以加入协变量校正群体分层差异，使用gemma 0.98.3软件(参数：-gk 2计算k矩阵，-k-lmm 1使用wald检验计算显著性)进行gwas，计算模型为:y＝wα+xβ+u+ε，其中，y指所有个体表型值，w指协变量矩阵，包括pca分析的前三个主成分，α是系数向量，x指标记基因型，β为标记位点的效应，u指个体随机效应，ε指随机误差；通过上述方法鉴定到与乳房炎相关snp位点188个、呼吸道疾病相关位点322个、消化道疾病相关位点216个和口腔疾病相关snp位点96个，共计822个与抗病力性状相关的snp位点；822个snp位点的位置及变异信息见表1，822个snp位点在染色体上的数量分布情况见图1。
[0029]
根据获得的822个snp位点的上下游序列设计探针，探针长度100-120nt，gc含量30-80％之间，探针序列在染色体上同源数量小于5个，设计好的探针经合成后，制备成检测所述822个snp位点的液相芯片。
[0030]
实施例2：奶绵羊样本中822个snp位点的基因分型检测
[0031]
奶绵羊样本中822个snp位点的基因分型检测方法，包括如下步骤：
[0032]
步骤1、提取奶绵羊样本的基因组dna，并构建样品文库；
[0033]
步骤1.1、样品dna提取：采用ctab法对样品dna进行提取。
[0034]
步骤1.2、样品dna质检：将测试样品dna，用qubit fluorometric quantitation(thermo fisher)对dna浓度进行测定，用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。检测合格
的样品放入4℃冰箱，保存、备用。
[0035]
步骤1.3、样品dna片段化：取12μl质检合格的dna放置于0.2μlpcr管中，将管置于超声波破碎仪中对dna进行随机物理破碎，片段破碎至200～400bp。
[0036]
步骤1.4、样品末端修复：向管中加入4μl genobaits end repair buffer(genobaits，即石家庄博瑞迪生物科技有限公司)和2.7μl genobaits end repair enzyme，补水至20μl，放入abi 9700 pcr仪中37℃温育20分钟，完成破碎片段的末端修复和加a过程。
[0037]
步骤1.5、样品测序接头连接：从pcr仪中取出小管加入2μl genobaits ultra dna ligase、8μl genobaits ultradna ligase buffer和2μl genobaits adapter，补水至40μl，然后放置于abi9700 pcr仪上22℃反应30分钟，完成测序接头的连接。
[0038]
步骤1.6、样品dna纯化：向连接产物中加入48μl的beackman ampure xp beads(beackman公司)对连接产物进行纯化，纯化后采用磁珠进行片段筛选，保留插入片段在200～300bp的连接产物。
[0039]
步骤1.7、样品文库扩增：向上一步的pcr管中加入5μl带有barcode序列的测序接头、1μlp5接头、10μlgenobaitspcrmastermix，并用纯水补至20μl；用abi 9700 pcr仪进行扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；重复2-4步，共8个循环；72℃延伸5min。不同的barcode用于区分不同的样品。
[0040]
步骤1.8、样品文库纯化：向第二轮pcr产物中加入24μl beckmen ampure xp beads(beackman公司)，用移液器上下吸打均匀后，将0.2μl的pcr管置于磁力架上至溶液澄清，弃去上清并用75％乙醇洗涤磁珠一次，用ph值为8.0的tris-hcl将文库dna洗脱下来。
[0041]
步骤2、利用实施例1制备的液相芯片检测目标个体中822个snp位点的基因型；
[0042]
步骤2.1、dna杂交：
[0043]
取500ng已完成构建的基因组dna测序文库，加入5μl genobaits block i和2μl genobaits block ii，置于eppendorf concentrator plus(eppendorf公司)真空浓缩仪上，在≤70℃的温度下蒸干至干粉。向干粉管中加入8.5μl genobaits 2x hyb buffer、2.7μl genobaits hyb buffer enhancer、2.8μl nuclease-free water，用移液器吸打混匀后放置于abi 9700 pcr仪上95℃温育10分钟，然后取出pcr管加入3μl已经合成的探针(探针的浓度为60ng/μl)，旋涡震荡混匀后放置于abi 9700 pcr仪上65℃温育2小时，完成探针杂交反应。
[0044]
步骤2.2、dna捕获：
[0045]
向上一步杂交完成的反应体系中加入100μl genobaits dna probe beads，上下吸打10次，放入abi 9700 pcr仪上65℃温育45分钟，使磁珠与探针结合。用100μl genobaits wash buffer i、150μl genobaits wash bufferii分别对结合探针后的磁珠进行65℃热洗，然后再用100μl genobaits wash buffer i、150μl genobaits wash buffer ii(和150μl genobaits wash buffer iii分别对磁珠进行常温洗涤。洗涤完成的磁珠用20μl nuclease-free water进行重悬。
[0046]
取13μl重悬后的dna(带磁珠)加入到新的0.2ml pcr管中，然后加入15μl genobaits pcr master mix、2μl genobaits primer mix配置post-pcr体系，用abi 9700 pcr仪进行文库扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸
30s；重复2-4步，共15个循环；72℃延伸5min。
[0047]
向post-pcr产物中加入45μl beckmen ampure xp beads(beackman公司)并用移液器上下吸打均匀，然后将0.2ml pcr管置于磁力架上至溶液澄清，弃去上清并用75％乙醇洗涤磁珠两次，用ph为8.0的tris-hcl将文库dna洗脱下来。完成探针的杂交捕获工作。
[0048]
步骤2.3、dna杂交捕获文库质检：
[0049]
用qubit fluorometric quantitation(thermo fisher)对文库的dna浓度进行测定，然后用琼脂糖凝胶电泳检测文库dna的片段大小是否在300～400bp之间。
[0050]
步骤2.4、dna杂交捕获文库测序：
[0051]
将构建好的dna文库用华大mgiseq2000测序仪进行测序。
[0052]
步骤3、基因型数据分析
[0053]
测序数据经过fastqc(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project)质控后，用bwa(bio-bwa.sourceforge.net)的默认参数将测序数据比对到参考基因组上，用gatk(software.broadinstitute.org/gatk)软件对测序数据进行snp鉴定，用perl脚本对探针捕获测序的基因型分型信息进行提取，形成最终的基因型分型文件。
[0054]
实施例3：822个snp位点在奶绵羊抗病力评估中的应用
[0055]
在进行奶绵羊的分子辅助育种或基因组选择育种过程中，经常需要对奶绵羊抗病力进行评估，以获得先天抗病力好的奶绵羊品种。
[0056]
本实施例采用实施例1制备的液相芯片和实施例2所述的基因分型方法对30只奶绵羊进行822个snp位点的基因分型检测，获得基因型数据；统计30个奶绵羊个体的常见疾病用药次数(所述常见疾病包括乳房炎、呼吸道疾病、消化道疾病、口腔疾病等；所述用药次数指的是奶绵羊患病后给药处理使其痊愈的给药次数)，并根据基因型数据计算出每个奶绵羊个体在822个snp位点发生等位基因突变的突变数目，结果见表2，对30只奶绵羊的突变数目进行排序，筛选出排名靠前的10只奶绵羊，然后筛选出的突变数目靠前的10只奶绵羊个体。并计算筛选出的10只奶绵羊个体的平均用药次数，突变数目靠前的10只奶绵羊个体的平均用药此时为9.7次，明显高于30只奶绵羊群体均值4.96次；因此，通过统计本发明表1中的822个snp位点发生等位基因突变的突变数目排名，可对高患病个体(也即抗病力差的个体)予以淘汰，从而缩短了抗病奶绵羊新品种的培育周期。
[0057]
表2
[0058]
[0059][0060]
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

技术特征：
1.一种与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合，其特征在于，所述snp位点组合包括822个snp位点；所述822个snp位点的物理位置是基于oar_ramboui l let_v1.0参考基因组比对确定的；所述snp位点的位置及变异信息采用染色体_物理位置：参考基因型/变异等位基因型的形式进行表示；所述822个snp位点的位置及变异信息见表1；表1
2.根据权利要求1所述的一种与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合，其特征在于，所述抗病力包括抗乳房炎、抗呼吸道疾病、抗消化道疾病、抗口腔疾病中的一种或多种。3.一套检测如权利要求1所述的与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合探针。4.一种检测如权利要求1所述的与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合液相芯片。
5.一种如权利要求1所述的与奶绵羊抗病力性状相关的snp位点组合在基因组选择育种、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定和系谱纠偏、分子辅助育种任一项中的应用。6.一套如权利要求3所述的探针在基因组选择育种、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定和系谱纠偏、分子辅助育种任一项中的应用。7.一种如权利要求4所述的液相芯片在基因组选择育种、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定和系谱纠偏、分子辅助育种任一项中的应用。

技术总结
本发明涉及一种与奶绵羊抗病力性状相关的SNP位点组合、探针、芯片及其应用，所述SNP位点组合包括822个SNP位点；所述822个SNP位点的物理位置是基于Oar_rambouillet_v1.0参考基因组比对确定的；所述SNP位点的位置及变异信息采用染色体_物理位置：参考基因型/变异等位基因型的形式进行表示；所述822个SNP位点的位置及变异信息见表1；本发明通过对与抗病力性状紧密相关的822个SNP位点进行基因分型，从而实现对奶绵羊的先天抗病力性状的评估。实现对奶绵羊的先天抗病力性状的评估。


技术研发人员：宋宇轩 张磊 李丹妮 安小鹏 赵雪洋
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/7