一种人表皮生长因子在毕赤酵母中分泌表达的方法与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种人表皮生长因子在毕赤酵母中分泌表达的方法。


背景技术：

2.egf是一种6kda的小分子蛋白并且通过作用于细胞核以促进表皮细胞的分裂与增殖而参与皮肤再生。此外，该蛋白质调节胶原合酶的分泌并且对角膜溃疡或损伤显示极大的作用。egf被广泛地用于在化妆品上促进皮肤细胞的分裂和生长，改善皮肤状况；在临床上可用于加速伤口和溃疡面的愈合、糖尿病足部溃疡的治疗剂、术后创口、褥疮、以及放射治疗引起的皮炎。然而，该蛋白质具有的问题在于向创伤区域的递送，持久性等相对低。因此，有需要开发具有增加的体内渗透性和持久性的新物质egf蛋白，并构建高效表达人表皮生长因子的毕赤酵母基因工程菌，为人表皮生长因子大量生产打下基础。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种蛋白胞外区的酵母菌中可溶性表达方法，有助于改善重组蛋白的折叠，促进重组蛋白的可溶表达可有效防止宿主菌体内蛋白酶对外源蛋白的降解，提高重组蛋白的稳定性。
4.本发明的目的通过以下技术方案实现：
5.一种人表皮生长因子在毕赤酵母中分泌表达的方法，具体步骤如下：
6.步骤1，用限制性内切酶bspt104ⅰ和xbaⅰ对目的nα-rhegf片段和表达载体ppicz进行酶切，胶回收双酶切后的片段与ppicz载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含有浓度为25μg/ml博来霉素的lb平板，于37℃培养箱培养过夜；之后，挑选阳性重组子接入5ml含有浓度为25μg/ml博来霉素的lb液体培养基，37℃，180rpm培养12h，提取质粒；
7.步骤2，将提取ppicz-nα-rhegf的质粒在1.7kv，6ms的条件下分别电转化进入毕赤酵母km71感受态细胞，在含浓度为100μg/ml博来霉素的ypds固体平板上28℃培养箱倒置培养3-4天，挑选数个单菌落接入5ml的ypd培养基中于28℃，180rpm摇床培养过夜后取适量菌液接入25mlbmgy培养基中，在28℃，180rpm条件下培养至od600nm＝2～6；在室温，7000rpm离心5min，去除上清液后使用25mlbmmy培养基重悬菌体，加入无水甲醇至体积比为1％，在28℃，180rpm条件下进行诱导，每隔24h添加无水甲醇至体积比为1％。诱导结束后于4℃，8000rpm离心5min，保留上清液，分离出菌体；
8.步骤3，结合缓冲液重悬分离出的菌体并于4℃下进行超声破碎，17000g/min离心15min收集上清液；ddh2o清洗ni-nta树脂；结合缓冲液平衡树脂；将含有可溶性表达的重组蛋白上清液与树脂于4℃下结合5h；用洗涤缓冲液洗涤杂蛋白；不同咪唑浓度的洗脱液洗脱并收集目的蛋白。
9.与现有技术相比，本发明的优势在于：
10.1、本工艺以egf蛋白胞外区编码基因的优化亲水性，表面抗原性序列为目的片段。
11.2、本工艺对egf蛋白胞外区α-信号肽序列优化并表达ppicz-na-rhegf载体的构建。所述表达载体包含编码所述修饰的egf蛋白的多核苷酸。
12.3、本工艺通过对信号肽序列优化可以提高egf蛋白细胞渗透性、体内持久性和稳定性的修饰功能。
13.4、本工艺用到的毕赤酵母作为宿主细胞，仅需将线性化后的外源dna通过同源重组的方式高效插入基因组中，便可生成稳定的宿主细胞。此外，巴斯德毕赤酵母还具有极易进行高密度细胞培养，生产成本低，产物纯度高，有强醇氧化酶启动子，不易形成包涵体，重组蛋白可高效分泌到胞外等优点。
14.5、本工艺在亲和柱层析过程中，重组蛋白egf发酵液混合物通过亲和柱时，非目标分子会被洗脱，而目标分子则会与亲和柱上的配体结合，最终通过洗脱目标分子的方式得到纯化的人表皮生长因子蛋白。纯化柱的优点是选择性高，分离效果好，操作简单，生物活性好。
15.6、本工艺利用酵母菌表达的蛋白可用于改善皮肤状况、预防或治疗皮肤疾病的药物组合物，有含修饰的egf蛋白作为活性成分。
16.7、本发明以表皮生长因子蛋白胞外区编码基因的优化序列为目的片段，成功构建了hegf蛋白胞外区表达载体ppicz-nα-rhegf，在毕赤酵母菌中诱导均以可溶性形式存在，将上清液经过亲和层析纯化得到具有纯度较高，生物活性较好，可提高重组蛋白的表达量；制备周期短，产量高，对蛋白表达能翻译后修饰，有效将外源蛋白分泌到胞外，表达外源蛋白往往能正确折叠不会形成不溶性无功能的包涵体沉淀。
附图说明
17.图1是本实施例重组质粒ppicz-na-rhegf的电泳图。
18.图2是本实施例km71-ppicz-nα-rhegf诱导表达电泳图。
19.图3是本实施例中重组蛋白纯化电泳图。
具体实施方式
20.下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
21.本发明涉及分子生物学技术及生物医药制品技术领域，具体涉及一种蛋白胞外区的酵母菌中可溶性表达方法，有助于改善重组蛋白的折叠，促进重组蛋白的可溶表达可有效防止宿主菌体内蛋白酶对外源蛋白的降解，提高重组蛋白的稳定性。该方法包括以下步骤：
22.(1)构建ppicz-nα-rhegf表达载体；(2)表达重组人表皮生长因子；(3)纯化hegf重组人表皮生长因子；其有益效果在于：本发明以表皮生长因子蛋白胞外区编码基因的优化序列为目的片段，成功构建了hegf蛋白胞外区表达载体ppicz-nα-rhegf，在毕赤酵母菌中诱导均以可溶性形式存在，将上清液经过亲和层析纯化得到具有纯度较高，生物活性较好，可提高重组蛋白的表达量；制备周期短，产量高，对蛋白表达能翻译后修饰，有效将外源蛋白分泌到胞外，表达外源蛋白往往能正确折叠不会形成不溶性无功能的包涵体沉淀。
23.本发明具体实施方法步骤：
24.(1)构建ppicz-nα-rhegf表达载体：用限制性内切酶bspt104ⅰ和xbaⅰ对目的nα-rhegf片段和表达载体ppicz进行酶切，胶回收双酶切后的片段与ppicz载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含有博来霉素(25μg/ml)的lb平板，于37℃培养箱培养过夜。挑选阳性重组子接入5ml含有博来霉素(25μg/ml)的lb液体培养基，37℃，180rpm培养12h，提取质粒。对质粒进行双酶切及测序验证；见图1重组质粒ppicz-na-rhegf。其中，n：dnamarker；3：重组质粒ppicz-na-rhegf。
25.(2)表达重组人表皮生长因子：将回收ppicz-nα-rhegf的质粒在1.7kv，6ms的条件下分别电转化进入毕赤酵母km71感受态细胞，在含博来霉素(100μg/ml)的ypds固体平板上28℃培养箱倒置培养3-4天，挑选数个单菌落接入5ml的ypd培养基中于28℃，180rpm摇床培养过夜后取适量菌液接入25mlbmgy培养基中，在
26.28℃，180rpm条件下培养至od600nm＝2～6。在室温，7000rpm离心5min去除上清后使用25mlbmmy培养基重悬菌体，加入无水甲醇至体积比为1％，在28℃，180rpm条件下进行诱导，每隔24h添加无水甲醇至体积比为1％。诱导结束后于4℃，8000rpm离心5min，保留上清液弃去菌体用于后续分析。见图2km71-ppicz-nα-rhegf诱导表达。其中，m：proteinmarker；1：km71-ppicz-α-rhegf全菌；2：km71-ppicz-nα-rhegf全菌。
27.(3)纯化hegf重组蛋白：用结合缓冲液重悬菌体并于4℃下进行超声破碎，17000g/min离心15min收集上清液；ddh2o清洗ni-nta树脂；结合缓冲液平衡树脂；将含有可溶性表达的重组蛋白上清液与树脂于4℃下结合5h；用洗涤缓冲液洗涤杂蛋白；用含200mm咪唑洗脱液收集目的蛋白。见图3重组蛋白纯化。其中，m：proteinmarker；4:200mm咪唑洗脱目的蛋白。
28.下面为一更具体的实施例：
29.1.试剂材料
30.基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、pcr产物回收试剂盒、dna胶回收试剂盒、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，sds)、山梨醇、博来霉素、g418、tris、tricine、temed、过硫酸铵(ammoniumpersulphate)上海捷瑞生物公司；牛血清蛋白标品、考马斯亮蓝g250、考马斯亮蓝r250、酵母基础氮源(yeastnitrogensourcefoundation，ynb)biosharp公司；丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉双丙烯酰(bis-acrylamide)、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，temed)美国sigma公司；蛋白胨(tryptone)、酵母粉(yeastextract)英国oxoid公司；dna限制性内切酶、dna连接酶、primestarmaxdna聚合酶、dnamarker(dl2000及dl10000)其他试剂均为国产分析；
31.pichiapastoriskm71购自美国invitrogen公司；
32.escherichiacolidh5α、表达载体ppicza、ppicz-α-rhegf(表达人表皮生长因子)
33.2.α-信号序列优化
34.(1)为了提高信号肽的分泌效率，优化α-信号序列。在α-信号肽起始密码子atg序列后插入aip，在α-信号肽引导序列和内切蛋白酶间插入eeaeaeaepk氨基酸，根据毕赤酵母密码子偏爱，优化添加13个氨基酸分泌信号的核酸序列，在5’端和3’端分别添加bspt104ⅰ和xbaⅰ酶切位点，合成得到优化后的信号序列nα。序列的优化、合成由上海捷锐生物技术公司完成。将合成的nα序列用bspt104ⅰ和xbaⅰ酶切位点，克隆到ppiczα-(a)载体，得到重组质粒ppicz-nα。
35.3.重组载体ppicz-nα-rhegf的构建
36.(1)将冻存的大肠杆菌工程菌株dh5α-ppicz-α-rhegf，dh5α-ppicz-nα取出后划线于含有博来霉素(25μg/ml)的lb平板倒置于37℃培养箱培养过夜。
37.(2)挑选单菌落为模板，从培养物提取质粒ppicz-α-rhegf、ppicz-nα。
38.(3)以ppicz-α-rhegf为模板，用引物prhegf-上/prhegf-下扩增rhegf；以ppicznα为模板，用引物pnα-上/pnα-下扩增nα，pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性2min；56℃退火1min；72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
39.(4)电泳，切胶回收rhegf和nα片段。
40.(5)soe-pcr，用引物pnα-上/prhegf-下将片段rhegf和nα进行连接，得到连接片段nα-rhegf。
41.(6)使用内切酶bspt104ⅰ单酶切，于37℃水浴锅内反应1.5h，完成后使用pcr产物纯化试剂盒纯化酶切产物。
42.(7)将纯化后的片段使用内切酶xbaⅰ酶切，于37℃水浴锅内反应1h，完成后使用pcr产物纯化试剂盒纯化酶切产物。
43.(8)用连接酶将回收的双酶切片段nα-rhegf，与同样使用bspt104ⅰ和xbaⅰ双酶切ppicza载体于16℃水浴、反应12h，得到重组质粒ppicz-nα-rhegf。
44.(9)连接产物转化大肠杆菌dh5α中，涂布于含有博来霉素(25μg/ml)的lb平板，于37℃培养箱培养过夜。
45.(10)挑选阳性重组子接入5ml含有博来霉素(25μg/ml)的lb液体培养基，37℃，180rpm培养12h，提取质粒。
46.(11)使用内切酶bspt104ⅰ和xbaⅰ进行双酶切验证，并以质粒为模板，使用引物pnα-上/prhegf-下进行pcr验证。最后测序确认ppicz-nα-rhegf构建成功。挑选在含博来霉素的lb平板上长出的转化子，对构建的重组质粒ppicz-na-rhegf进行pcr鉴定及酶切鉴定。
47.4.电转化及菌株km71-ppicz-α-rhegf与km71-ppicz-nα-rhegf的构建
48.(1)将冻存的菌株dh5α-ppicz-α-rhegf与dh5α-ppicz-nα-rhegf分别划线于含有博来霉素(25μg/ml)的lb平板，于37℃培养过夜，分别挑选单菌落接入25mllb培养基中于37℃，180rpm摇床培养过夜。
49.(2)培养完成后使用质粒小量制备试剂盒提取工程菌dh5α-ppicz-α-rhegf与dh5α-ppicz-nα-rhegf的重组质粒。
50.(3)将提取得质粒ppicz-α-rhegf与ppicz-nα-rhegf分别用内切酶sacⅰ于37℃水浴酶切，酶切反应1h，线性化重组质粒。
51.(4)回收线性化的质粒，浓缩至体积为10μl。
52.(5)将回收的质粒在1.5kv，5ms的条件下分别电转化进入毕赤酵母km71感受态细胞
53.，在含博来霉素(100μg/ml)的ypds固体平板上，30℃培养。
54.(6)挑去平板上长出的菌落，用60μlysisbufferformicroorganism裂解细胞，取裂解液做模板，用引物pnα-上/prhegf-下进行pcr鉴定。测序确证阳性克隆，得到毕赤酵母工程菌株km71-ppicz-α-rhegf与km71-ppicz-nα-rhegf。
55.5.工程菌株km71-ppicz-α-rhegf、km71-ppicz-nα-rhegf诱导表达
56.(1)将冻存阳性重组子划线ypd平板于29℃培养箱倒置培养3-4天，挑选数个单菌落接入10ml的ypd培养基中于28℃，200rpm摇床培养过夜后取适量菌液接入25mlbmgy培养基中，在28℃，180rpm条件下培养od600nm＝2～6。在室温，6000rpm离心5min去除上清后使用25mlbmmy培养基重悬菌体，加入无水甲醇至体积比为1％，在29℃，180rpm条件下进行诱导，每隔24h添加无水甲醇至体积比为1％。诱导结束后于4℃，9000rpm离心10min，保留上清液弃去菌体用于后续分析。
57.(2)当开始诱导后工程菌km71-ppicz-α-rhegf、km71-ppicz-nα-rhegf的胞外分泌总蛋白含量均随着诱导时间的增长而增加。最终诱导95h时，工程菌km71-ppicz-α-rhegf与km71-ppicz-nα-rhegf的胞外分泌总蛋白含量分别为94.256mg/l、130.236mg/l。在发酵后，取适量菌液，10000rpm，离心5min取上清进行tricine-sdspage凝胶电泳分析。
58.6.km71-ppicz-nα-rhegf重组蛋白纯化：
59.tris-hcl缓冲液(tris-hcl，50mm；nacl，400mm；甘油，8％)重悬菌体，低温超声破碎(1son，2soff，40％)，4℃下18000g离心30min收集上清；ni-nta亲和柱对hegf重组蛋白进行纯化：
60.(1)8倍柱体积去离子水清洗ni-nta亲和柱；
61.(2)平衡住：10倍柱体积的结合缓冲液(tris-hcl，50mm；nacl，400mm；甘油，8％；40mm咪唑)平衡；
62.(3)上样：加入蛋白上清液4℃结合6h；
63.(4)洗杂蛋白：10倍柱体积的洗涤缓冲液(tris-hcl，50mm；nacl，400mm；甘油，8％；咪唑：50mm，100mm)洗涤杂蛋白；
64.(5)洗脱蛋白：5倍柱体积洗脱缓冲液(tris-hcl，50mm；nacl，400mm；甘油，8％；200mm咪唑)洗脱目标蛋白；sds-page分析各阶段样品。将纯化的hegf重组蛋白溶液加入水化后的透析盒中，放入50倍体积的tris-hcl缓冲液(tris-hcl，50mm；甘油，8％)中4℃透析6h，更换tris-hcl缓冲液4℃透析6h，更换tris-hcl缓冲液4℃过夜透析。
65.1、本工艺以egf蛋白胞外区编码基因的优化亲水性，表面抗原性序列为目的片段。
66.2、本工艺对egf蛋白胞外区α-信号肽序列优化并表达ppicz-na-rhegf载体的构建。所述表达载体包含编码所述修饰的egf蛋白的多核苷酸。
67.3、本工艺通过对信号肽序列优化可以提高egf蛋白细胞渗透性、体内持久性和稳定性的修饰功能。
68.4、本工艺用到的毕赤酵母作为宿主细胞，仅需将线性化后的外源dna通过同源重组的方式高效插入基因组中，便可生成稳定的宿主细胞。此外，巴斯德毕赤酵母还具有极易进行高密度细胞培养，生产成本低，产物纯度高，有强醇氧化酶启动子，不易形成包涵体，重组蛋白可高效分泌到胞外等优点。
69.5、本工艺在亲和柱层析过程中，重组蛋白egf发酵液混合物通过亲和柱时，非目标分子会被洗脱，而目标分子则会与亲和柱上的配体结合，最终通过洗脱目标分子的方式得到纯化的人表皮生长因子蛋白。纯化柱的优点是选择性高，分离效果好，操作简单，生物活性好。
70.6、本工艺利用酵母菌表达的蛋白可用于改善皮肤状况、预防或治疗皮肤疾病的药物组合物，有含修饰的egf蛋白作为活性成分。

技术特征：
1.一种人表皮生长因子在毕赤酵母中分泌表达的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，用限制性内切酶bspt104ⅰ和xbaⅰ对目的nα-rhegf片段和表达载体ppicz进行酶切，胶回收双酶切后的片段与ppicz载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含有浓度为25μg/ml博来霉素的lb平板，于37℃培养箱培养过夜；之后，挑选阳性重组子接入5ml含有浓度为25μg/ml博来霉素的lb液体培养基，37℃，180rpm培养12h，提取质粒；步骤2，将提取ppicz-nα-rhegf的质粒在1.7kv，6ms的条件下分别电转化进入毕赤酵母km71感受态细胞，在含浓度为100μg/ml博来霉素的ypds固体平板上28℃培养箱倒置培养3-4天，挑选数个单菌落接入5ml的ypd培养基中于28℃，180rpm摇床培养过夜后取适量菌液接入25mlbmgy培养基中，在28℃，180rpm条件下培养至od600nm＝2～6；在室温，7000rpm离心5min去除上清后使用25mlbmmy培养基重悬菌体，加入无水甲醇至体积比为1％，在28℃，180rpm条件下进行诱导，每隔24h添加无水甲醇至体积比为1％。诱导结束后于4℃，8000rpm离心5min，保留上清液，分离出菌体；步骤3，结合缓冲液重悬分离出的菌体并于4℃下进行超声破碎，17000g/min离心15min收集上清液；ddh2o清洗ni-nta树脂；结合缓冲液平衡树脂；将含有可溶性表达的重组蛋白上清液与树脂于4℃下结合5h；用洗涤缓冲液洗涤杂蛋白；不同咪唑浓度的洗脱液洗脱并收集目的蛋白。

技术总结
本发明公开了一种人表皮生长因子在毕赤酵母中分泌表达的方法，属于生物工程技术领域；其包括以下步骤：(1)构建pPICZ-Nα-rhEGF表达载体；(2)表达重组人表皮生长因子；(3)纯化hEGF重组人表皮生长因子；本发明以表皮生长因子蛋白胞外区编码基因的优化序列为目的片段，成功构建了hEGF蛋白胞外区表达载体pPICZ-Nα-rhEGF，在毕赤酵母菌中诱导均以可溶性形式存在，将上清液经过亲和层析纯化得到具有纯度较高，生物活性较好，可提高重组蛋白的表达量；制备周期短，产量高，对蛋白表达能翻译后修饰，有效将外源蛋白分泌到胞外，表达外源蛋白往往能正确折叠不会形成不溶性无功能的包涵体沉淀。体沉淀。体沉淀。


技术研发人员：吴倩 岳术俊 宋宁宁 许奎雪 赵素丽
受保护的技术使用者：北京市春立正达医疗器械股份有限公司
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/9/9