鸡传染性法氏囊抗体检测试剂盒及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及鸡传染性法氏囊抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.鸡传染性法氏囊病(ibd)又称鸡传染性腔上囊病(ibdv)，是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性、接触传染性疾病。传染性法氏囊病毒属于双rna病毒科，包括两个血清型。以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征。从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。发病率高，几乎达100％，死亡率低，一般为5％～15％，是养禽业最重要的疾病之一。
3.自然条件下，本病只感染鸡，所有品种的鸡均可感染，但不同品种的鸡中，白来航鸡比重型品种的鸡敏感，肉鸡较蛋鸡敏感。本病仅发生于2周
‑‑
15周的小鸡，3～6周龄为发病高峰期。病毒主要随病鸡粪便排出，污染饲料、饮水和环境，使同群鸡经消化道、呼吸道和眼结膜等感染；各种用具、人员及昆虫也可以携带病毒，扩散传播；本病还可经蛋传递。
4.传染性法氏囊病毒属于双股rna病毒科禽双股rna病毒属。病毒颗粒无囊膜，直径60nm，有一层外壳，20面对称，基因组含a.b两个线状双股rna分子，大小6kbp，病毒对热(60℃30min)稳定，在ph3-9、经乙醚或氯仿处理均不丧失其活性。病毒的复制对细胞的rna及蛋白质的合成无明显影响，病毒在胞浆组装并蓄积。
5.检测鸡ibdv抗体的主要方法有：中和试验、琼扩、间接免疫荧光(ifa)及elisa。中和试验虽然是评价鸡群抗体的金标准，但因其操作繁琐，耗时较长，且需要培养细胞，不适合普通养殖场的使用。琼扩实验虽然操作不复杂，但不够灵敏且耗时较长，达不到快速和灵敏的目的。ifa操作也比较繁琐，需要培养细胞，且观察需要用的荧光显微镜价格昂贵。elisa具备特异、简便、快速的特点。因此，目前普遍使用间接eilsa来评价鸡群内的ibdv抗体水平。但针对养殖户来说，elisa操作依然需要专业人员和专业设备，因此，也不适合在养殖场的现场使用。


技术实现要素：

6.为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种鸡传染性法氏囊vp2蛋白的单克隆抗体；本发明的目的之二，提供一种使用本发明制备的vp2蛋白和单克隆抗体制备鸡传染性法氏囊抗体检测试剂盒。
7.因此，本发明一方面公开了一种鸡传染性法氏囊单克隆抗体，所述的单克隆抗体能特异性结合鸡传染性法氏囊vp2蛋白，所述的单克隆抗体为单克隆抗体1c4，所述的单克隆抗体1c4的重链可变区序列和轻链可变区如seq id no.1和seq id no.2所示。
8.再一方面，本发明还公开了一种鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条，所述鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条由试纸条和处理液组成，所述试纸条包括pvc底板，在pvc底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；试纸条的乳胶微
球垫为乳胶微球标记鸡传染性法氏囊vp2蛋白；试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线为单克隆抗体1c4，检测线为鸡传染性法氏囊vp2蛋白。
9.优选地，本发明所述的样品处理液为1
×
pbs溶液。
10.优选地，本发明所述的试纸条适用于检测血清、血液和组织液中的鸡传染性法氏囊抗体。
11.优选地，本发明所述的组织液为唾液。
12.再一方面，本发明还公开了一种所述的单克隆抗体1c4在制备鸡传染性法氏囊抗体检测试剂中的应用。
13.本发明所提供的鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条适用于血清、全血和组织液(如唾液)中鸡传染性法氏囊抗体的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于鸡传染性法氏囊抗体的早期筛查，特别适合现场鸡传染性法氏囊感染诊断、流行病学调查和国际贸易检疫检验等。
14.本发明用于制备试纸条的鸡传染性法氏囊vp2蛋白的单克隆抗体1c4，具有良好的特异性和敏感性，也适用于制备不同的鸡传染性法氏囊诊断试剂，如胶体金、试纸条、elisa、化学发光检测等。
附图说明
15.图1、两株单克隆抗体的特异性检验结果(western blot)；其中图1a为单克隆抗体1c4检测结果，图1b为单克隆抗体3b7检测结果；两图中m均为marker、1均为鸡传染性法氏囊、2均为鸡新城疫、3均为鸡传染性支气管炎病毒、4均为鸡传染性喉气管炎病毒。
16.图2、检测试纸条的组装，其中1是样品垫，2是胶体金垫，3是硝酸纤维素膜，4是吸水垫，5是检测线，6是质控线，7是pvc板。
17.图3、试纸条内包装成品图，其中c为质控线、t为检测线、s为加样槽。
18.图4、试纸条检测判定模式图。
具体实施方式
19.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
20.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
21.实施例1：鸡传染性法氏囊vp2蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
22.1、鸡传染性法氏囊vp2蛋白的制备
23.参见中国发明专利202010597896.1【0016】～【0034】段的方法制备鸡传染性法氏囊vp2蛋白，共制备了一批蛋白，蛋白约20mg，其浓度为1.12mg/ml，定量(0.2ml/管)分装后置于-80℃保存。
24.2、杂交瘤细胞的筛选
25.用1中制备的鸡传染性法氏囊vp2蛋白免疫6～8周龄的balb/c雌性小鼠，首次免疫时，鸡传染性法氏囊vp2蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化，腹腔接种小鼠，100μg蛋白/只；14天后鸡传染性法氏囊vp2蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化，第二次腹腔接种途径免疫小鼠，100μg蛋白/只；14天后第三次小鼠腹腔途径直接免疫鸡传染性法氏囊vp2蛋白，100μg/
只；免疫后的第3天，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合。
26.使用peg法将小鼠脾细胞与骨髓瘤sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用hat培养基重悬，均匀铺于96孔板内，每孔100μl，37℃，5％co2培养。细胞培养箱中培养5天后，用hat培养基换液一次，第10天用ht培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10～30％时。取培养上清，用间接elisa方法(鸡传染性法氏囊vp2蛋白包被，1μg/ml)进行阳性克隆的检测。选择2个呈强阳性反应的细胞孔，进行3次有限稀释法细胞克隆，各获得一株杂交瘤细胞。经传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，液氮保存备用。
27.通过以上步骤，共筛选冻存2株杂交瘤细胞，分别命名为杂交瘤细胞1c4、杂交瘤细胞3b7。
28.3、单克隆抗体的制备(两株杂交瘤细胞制备单克隆抗体方法相同)
29.取6～8周龄左右balb/c雌性小鼠经腹腔注射降植烷，0.5ml/只，7日后每只小鼠注射杂交瘤细胞1
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106个。注射后7～10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采取腹水，4℃8000rpm离心3min，收集上清液，即为单抗腹水。取1倍体积腹水，加入2倍体积醋酸盐缓冲液(0.06mol/l，ph值4.8)，混合均匀后在室温下边搅拌边加入辛酸(30μl/ml腹水)，4℃澄清2h小时，以4℃12000rpm离心20min，收集上清。再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃静置2小时，4℃3000rpm离心30min，收集沉淀。用2倍体积pbs溶解沉淀后用pbs透析过夜，即获得纯化的腹水抗体，置于-70℃保存备用。使用bca试剂盒对单克隆抗体进行浓度检测。
30.通过以上方法，共制备2株单克隆抗体，分别为单克隆抗体1c4、单克隆抗体3b7。
31.4、单克隆抗体的性能鉴定
32.4.1、类及亚类测定：用商品化的elisa试剂盒鉴定单抗的类型及亚类，鉴定结果显示(表1)，两株单克隆抗体重链恒定区均为lgg1型，轻链恒定区均为kappa型。
33.表1单克隆抗体类型及亚类鉴定结果
34.抗体亚类单克隆抗体1c4(od450nm)单克隆抗体3b7(od450nm)igg10.8150.889igg2a0.0550.055igg2b0.0530.053igg30.0520.056iga0.0550.055igm0.0540.056kappa0.8560.936lambda0.0520.052
35.4.2、单克隆抗体可变区序列的测定：参见中国发明专利(cn 103173417 b)实施例3的方法对制备的单克隆抗体进行重链可变区和轻链可变区的测定，经过测定，单克隆抗体1c4重链可变区和轻链可变区的序列如seq id no.1、seq id no.2所示，单克隆抗体3b7重链可变区和轻链可变区的序列如seq id no.3、seq id no.4所示。
36.4.3、抗体特异性检测：分别取2株单克隆抗体对鸡新城疫(市购活疫苗提取蛋白质)、鸡传染性支气管炎病毒(市购活疫苗提取蛋白质)、鸡传染性喉气管炎病毒(市购活疫苗提取蛋白质)和鸡传染性法氏囊(市购活疫苗提取蛋白质)进行werstern blot检测(图1)，以判断其特异性，结果显示，两株单克隆抗体检测3种抗原均为阴性，检测鸡传染性法氏
囊为阳性，说明两株单克隆抗体的特异性良好。
37.实施例2：鸡传染性法氏囊抗体检测试纸条的制备
38.1、制造用材料：乳胶微球(300nm)购自上海辉质生物技术有限公司；兔抗鸡igg二抗购自北京索莱宝公司；pvc底板购自杭州瑞建；样品垫、标记垫购自通成纸业；吸水纸购自上海捷宁生物科技有限公司。
39.2、硝酸纤维素膜的制备
40.2.1、包被缓冲液的配制：将1g蔗糖加入到100ml的pbs缓冲液中配制成包被缓冲液，0.22μm滤膜过滤除菌，置2～8℃保存备用。
41.2.2、硝酸纤维素膜的制备：将硝酸纤维素膜贴于pvc底板的相应位置，用包被缓冲液将鸡传染性法氏囊vp2蛋白稀释至1mg/ml，调整划膜机的划线位置及高度，划线为t线，即为检测线，t线靠近乳胶微球垫端，用包被缓冲液将单克隆抗体1c4稀释到1mg/ml，调整划膜机的划线位置及高度，划线为c线，即为质控线，c线靠近吸收垫，两线距离5～8mm。置37℃烘箱烘干14～16小时，装入放有干燥剂的铝箔袋中密封，常温或2～8℃保存备用。
42.3、乳胶垫的制备
43.3.1、标记：将鸡传染性法氏囊vp2蛋白按1mg/ml乳胶微球的量加入到乳胶微球中，旋转混匀2小时。加入bsa至终浓度为1％，旋转混匀30分钟。在2～8℃下，以10000r/min离心30分钟，弃上清，收集沉淀，沉淀用1ml保存液(含2％蔗糖的tbs缓冲液，ph为8.0)重悬超声1分钟，置2～8℃保存。
44.3.2、乳胶微球垫的制备：将重悬好的乳胶微球标记抗体均匀的铺在已处理的乳胶微球垫上，置37℃烘箱烘干14～16小时，铝箔袋封装，常温或2～8℃保存备用。
45.4、样品垫的处理：将样品垫(300mm
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20mm)浸泡于封闭液(称取bsa 1g加入到10ml的纯化水中，充分溶解)中30分钟后，37℃烘箱烘干14～16小时，铝箔袋封装，置2～30℃保存备用。
46.5、试纸条的组装：如图2所示，将样品垫，乳胶微球垫，吸收垫依次粘贴到已粘有硝酸纤维素膜的pvc底板的相应位置，使乳胶微球垫、吸水垫分别与硝酸纤维素膜部分接触，样品垫与乳胶微球垫部分接触，制成大板。.
47.6、包装：用切条机将试纸条大板切成3mm宽的试纸条，装上外壳，每个外壳里面包含一条试纸条(具体包装见图3)，用铝箔袋密封包装，内含试纸条一个，吸管一个，干燥剂一包。
48.7、样品缓冲液的制备：1
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pbs缓冲液，无菌分装，10ml/管，常温或2～8℃保存备用。
49.8、试纸条的组装：将检验合格的各试纸条组份按下表组装
50.组分数量规格鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条50袋1组/袋样品缓冲液1管10ml/管说明书1份/
51.9、试纸条用法与判定
52.9.1、样本处理：血液、血清和组织液(如唾液等)直接用于检测。
53.9.2、操作步骤：取适量的检测样品(30～40μl，滴管1滴)，缓慢滴加到样品孔中，然
后滴加2滴样品缓冲液。加样完成后将试纸条平放在桌面上，5～10分钟内观察结果。
54.9.3、判定(如图4所示)
55.9.3.1、试纸条出现两条条带(t：检测线，c：质控线)，判为阳性。
56.9.3.2、试纸条均只出现一条带(c：质控线)，判为阴性。
57.9.3.3、试纸条质控线处不出现条带，判为无效。
58.10、试纸条贮藏与有效期：常温或2～8℃阴凉干燥处保存，有效期18个月。
59.实施例3：鸡传染性法氏囊抗体检测试纸条性能评价
60.1、试剂条制备
61.参见实施例2制备，共制备了3批试纸条，批号分别为230301、230302、230303。
62.2、特异性评价
63.2.1、将5份特异性样品(鸡毒支原体阳性血清(购自中监所)、鸡传染性喉气管炎阳性血清(购自中监所)、鸡新城疫阳性血清(购自中监所)、抗鸡病毒性关节炎病毒特异性血清(购自中监所)、鸡阴性血清(购自中监所))分别用三批试纸条进行检测，3批试纸条的检测结果全部为阴性，即阴性检出率为100％，具体见表2。
64.2.2、将5份鸡传染性法氏囊抗体阴性血清样品、5份鸡传染性法氏囊抗体阴性血液样品、5份鸡传染性法氏囊抗体阴性组织液分别用三批试纸条进行检测，3批试纸条的检测结果全部为阴性，即阴性检出率为100％，具体见表2。
65.表2特异性检测结果
[0066][0067]
注：“+”表示检测结果为阳性，
“‑”
表示检测结果为阴性。
[0068]
3、敏感性检验
[0069]
3批试纸条对3份阳性样品的检测结果显示(表3)，3份阳性血清的最低检出限分别为1:640(elisa为1:640)、1:160(elisa为1:320)、1:160(elisa为1:320)。说明试纸条的敏感性较好。
[0070]
表3敏感性检测结果
[0071][0072][0073]
注：“+”表示检测结果为阳性，
“‑”
表示检测结果为阴性。
[0074]
4、重复性评价
[0075]
三批试纸条均按照说明书检测强阳性血清、阳性血清和阴性血清样品，结果见表4。从表可见，本实验室试制的3批试纸条检测鸡传染性法氏囊抗体强阳性血清、阳性血清和阴性血清样品的批内和批间都一致，表明以实验室方法制备的鸡传染性法氏囊抗体检测试纸条具有较好的重复性。
[0076]
表4重复性检测结果
[0077]
[0078][0079]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种鸡传染性法氏囊单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体能特异性结合鸡传染性法氏囊vp2蛋白，所述的单克隆抗体为单克隆抗体1c4，所述的单克隆抗体1c4的重链可变区序列和轻链可变区如seq id no.1和seq id no.2所示。2.一种鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条，其特征在于，所述鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条由试纸条和处理液组成，所述试纸条包括pvc底板，在pvc底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；试纸条的乳胶微球垫为乳胶微球标记鸡传染性法氏囊vp2蛋白；试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线为权利要求1所述的单克隆抗体1c4，检测线为鸡传染性法氏囊vp2蛋白。3.根据权利要求2所述的鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条，其特征在于，所述的样品处理液为1
×
pbs溶液。4.根据权利要求2所述的鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条，其特征在于，所述的试纸条适用于检测血清、血液和组织液中的鸡传染性法氏囊抗体。5.根据权利要求4所述的鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条，其特征在于，所述的组织液为唾液。6.一种如权利要求1所述的单克隆抗体1c4在制备鸡传染性法氏囊抗体检测试剂中的应用。

技术总结
本发明一方面公开了一种特异性结合鸡传染性法氏囊VP2蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体为单克隆抗体1C4，该单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条，所述快速检测试纸条由试纸条和处理液组成，所述试纸条包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；试纸条的乳胶微球垫为乳胶微球标记鸡传染性法氏囊VP2蛋白；试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线为单克隆抗体1C4，检测线为鸡传染性法氏囊VP2蛋白。本发明制备的单克隆抗体1C4具有良好的特异性和敏感性，适用于制备不同的鸡传染性法氏囊诊断试剂。备不同的鸡传染性法氏囊诊断试剂。备不同的鸡传染性法氏囊诊断试剂。


技术研发人员：胡昌红 周侃均 白青月 胡振 强文俊 殷复建 谢宏权
受保护的技术使用者：宁波纯派农业科技有限公司
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/9