一种耐药肺结核QTc间期延长的代谢物筛选及应用的制作方法

一种耐药肺结核qtc间期延长的代谢物筛选及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利福平耐药结核病治疗过程中的关于qtc间期延长的代谢标志物的筛选及应用。


背景技术：

2.结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌引起的慢性消耗性人畜共患病，也是全球致死性疾病之一。据世界卫生组织(worldhealth organization,who)报告，2021年全球新发结核病患者1060万，发病率为134/10万。由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)感染导致的利福平耐药结核病(rifampicin-resistant tuberculosis，rr-tb)、耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，mdr-tb)、前广泛耐药结核病(pre-extensively drug-resistant tuberculosis，pre-xdr-tb)和广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis，xdr-tb)现阶段成为全球严重的公共卫生问题及终止结核病的主要障碍。目前，全球结核病的治疗成功率为85％，rr-tb为57％、mdr-tb约50％、xdr-tb低于30％，无法获得有效抗结核药物是大多数国家和地区耐药结核病治疗失败的重要原因。
3.贝达喹啉(bedaquiline)于2012年12月28日起被美国食品药品监督管理局(food and drugadministration，fda)有条件批准上市，被世界卫生组织(worldhealth organization,who)列为rr-tb和mdr-tb长程治疗方案的首选药物，经临床试验及真实世界数据证实贝达喹啉对耐多药结核病的治疗有效。截至2019年底，全球已有109个国家引入并使用，超过51000例患者接受了含贝达喹啉方案的治疗。但经研究表明贝达喹啉具有心脏毒性，在治疗耐药结核病时该药物可通过肝脏中细胞色素p4503a4酶(cyp3a4)进行氧化代谢产生n-单去甲基代谢物(m2)，该代谢物属于阳离子两亲性药物，容易引起较高的细胞磷脂沉积，进而抑制人类ether
‑à‑
go-go相关基因(the human ether
‑à‑
go-go-related gene，herg)所编译的钾离子通道，导致qt间期延长。qtc间期延长会大大增加心律失常的风险，若qtc间期延长超过500ms，极可能会导致尖端扭转型室性心动过速(torsades de points，tdp)，严重可致患者出现晕厥、胸痛、心悸等症状，甚至发生猝死。由于qtc间期延长往往无症状，患者及医生第一时间很难察觉，为及时发现问题并降低死亡风险，需加强对患者qtc间期的预测/监测，早期发现并及时处理药物不良反应。
4.qtc间期是按心率校正的qt间期，是反映心脏去极化和复极作用的指标。qtc间期延长表示心脏复极延迟，反映了心电异常，通常与心律失常敏感性增高密切相关。qtc间期延长发生率不高，但潜在危害性大，大多数表现为显著的尖端扭转型心动过速(tdp)，严重时可诱发室性心律失常甚至猝死。主要有以下几个方面的影响因素i)患者因素：药物所致qtc间期延长，对于一些疾病自身导致qtc间期延长的患者，引发qtc间期延长的药物应该禁用，比如急性心肌缺血患者；ii)代谢因素：主要为抑制或诱导肝药酶cyp450的药物。iii)过高剂量：过量服用致qtc间期延长的药物后，应立即进行心血管检查，包括连续的心电监测，可产生qtc间期延长相加的药物尽量避免高剂量服用。研究报道，耐多药肺结核患者心电图
alanine)、腺苷(adenosine)、n-乙酰-l-天门冬酰胺(n-acetylasparagine)、木糖醇(pentitol)、2，3-二羟基戊酸(2,3-dihydroxyvaleric acid)、磷酸胆碱(phosphocholine)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.65时，该代谢标志物可以预测qtc间期延长。
10.进一步的，当代谢标志物为维生素e琥珀酸酯(vitamin e succinate)、n 2-呋喃酰甘氨酸(n-(2-furoyl)glycine)、孕烯醇酮(pregnenolone)、腺苷蛋氨酸(ademetionine)、3-氨基异丁酸(3-aminoisobutyric acid)、甘氨酸(glycine)、n-乙酰-l-谷氨酸(n-acetyl-l-glutamic acid)、l-丙氨酸(l-alanine)、甲氧去甲肾上腺素(normetanephrine)、lpc(18:1)、胺基丁酸(gaba)、磷脂酰胆碱(phosphocholine)、2,6二甲基庚酰肉碱(2,6dimethylheptanoyl carnitine)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.60时，该代谢标志物可以监测药物治疗2周后的qtc间期延长。
11.进一步的，当代谢标志物为维生素e琥珀酸酯(vitamin e succinate)、lpc(16:0)、β-d氨基葡萄糖(beta-d-glucosamine)、孕烯醇酮(pregnenolone)、丝氨酸(dl-serine)、l-丙氨酸(l-alanine)、甘氨酸(glycine)、胺基丁酸(gaba)、龙胆酸(gentisic acid)、酰基甘氨酸(nicotinuric acid)、lpc(18:1)、腺苷蛋氨酸(ademetionine)、去氧胆酸(deoxycholic acid)、胆汁酸(cholic acid)、磷脂酰胆碱(phosphocholine)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.60时，该代谢标志物可以监测药物治疗4周后的qtc间期延长。
12.进一步的，当代谢标志物为维生素e琥珀酸酯(vitamin e succinate)、lpc(16:0)、β-d氨基葡萄糖(beta-d-glucosamine)、甘氨酸(glycine)、丝氨酸(dl-serine)、l-丙氨酸(l-alanine)、酪胺(tyramine)、柠檬酸(citric acid)、尿酸(uric acid)、孕烯醇酮(pregnenolone)、d-亮氨酸(d-leucine)、n-乙酰-l-天门冬酰胺(n-acetylasparagine)棕榈酰肉碱(palmitoylcarnitine)、β-脲基异丁酸(beta-ureidoisobutyric acid)、甘油酸(l-glyceric acid)、尿刊酸(urocanic acid)、肌氨酸(sarcosine)、尿刊酸酯(urocanate)、n,n-二甲基甘氨酸(n,n-dimethylglycine)、酰基甘氨酸(nicotinuric acid)、水苏糖(stachyose)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.60时，该代谢标志物可以监测药物治疗8周后的qtc间期延长。
13.进一步的，所述qtc间期延长是指耐药肺结核患者在药物治疗过程中出现的qtc间期延长。
14.进一步的，所述药物治疗的药物选自莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、氯法齐明、环丝氨酸、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、阿米卡星、卷曲霉素、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸、美罗培南、亚胺培南和/或西司他汀。
15.进一步的，所述代谢物来自耐药肺结核患者的尿液。
16.第二方面，本发明提供第一方面所述的用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物在制备预测/监测耐药肺结核患者qtc间期延长的制剂中的应用。
17.第三方面，本发明提供一种用于预测/监测耐药肺结核患者qtc间期延长的试剂盒，所述试剂盒是含有检测代谢标志物的试剂、说明书等，所述代谢标志物为第一方面所述的用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物。
18.第四方面，本发明提供一种用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物的筛选方
法，所述方法包括如下步骤：
19.s1.尿液采集及保存：收取受试者晨尿中段尿尿液样本；
20.s2.尿液中代谢物的提取：取样本经过冷冻浓缩干燥、沉淀、离心，取上清进行真空干燥后进行色谱、质谱分析，得到峰对齐、保留时间校正和提取峰面积；
21.s3.以上述色谱、质谱得到的数据和检索hmdb、massbank、标准品库basedeepbp等公共数据库比较，数据进行归一化处理；
22.s4.多元统计分析：采用主成分分析法(principal component analysis，pca)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，opls-da)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis，pls-da)统计分析，结合fold change、t-test、volcano plot等单变量分析，筛选qtc间期延长的代谢标志物。
23.s5.差异代谢标志物的鉴定：以代谢标志物的roc曲线下面积(area under the curve，auc)值auc＞0.6为标准。
24.进一步的，所述质谱分析方法的稳定性评估以质量控制样品(quality control，qc)来评估。
25.进一步，所述质量控制样品是去除相对标准偏差(relative standard deviation，rsd)≥30％的信号峰的样品。
26.进一步的，所述相对偏差是指正离子模式和负离子模式下的质谱总离子流图分别进行谱图叠加比较后的相对标准偏差(relative standard deviation，rsd)。
27.进一步的，所述数据进行归一化是指以代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(质量偏差mass tolerance＜20ppm)和二级谱图匹配(质量偏差mass tolerance＜0.02da)的方式和数据库比对得到包含化合物保留时间、质荷比和峰强度等信息。
28.进一步的，所述数据进行归一化处理还包括缺失值处理。
29.进一步的，所述缺失值处理是指删除组内样本内缺失值大于50％的离子峰。
30.进一步的，所述数据进行归一化处理还包括正负离子峰整合后用r软件进行模式识别和unit variance scaling(uv)处理。
31.进一步的，所述筛选qtc间期延长的代谢标志物是基于不同组别的代谢组成的差异，筛选出预测/监测qt间期延长的尿液代谢组学标志物，其筛选条件为|log2foldchange|≥0.58，p＜0.05，vip＞1.0。
32.第五方面，本发明提供一种qtc间期延长的预测/监测系统，所述系统包括数据输入、数据处理和结果输出模块。
33.进一步的，所述数据输入是将受试者的尿液代谢提取物经色谱、质谱检测得到的作为输入数据；
34.进一步的，所述数据输入包含有本发明第一方面所述的代谢标志物。
35.进一步的，所述数据处理是将输入的数据进行auc值的检测。
36.进一步的，所述数据输出是输入数据的auc值。
37.进一步的，输出数据为lpc(16:0)、棕榈酰肉碱(palmitoylcarnitine)、吡哆酸(pyridoxic acid)、异冬谷酸(isospaglumic acid)、n-乙酰-l-天门冬氨酸(n-acetyl-l-aspartic acid)、甘氨酸(glycine)、腺苷蛋氨酸(ademetionine)、l-丙氨酸(l-alanine)、
腺苷(adenosine)、n-乙酰-l-天门冬酰胺(n-acetylasparagine)、木糖醇(pentitol)、2，3-二羟基戊酸(2,3-dihydroxyvaleric acid)、磷酸胆碱(phosphocholine)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.65时，该代谢标志物可以预测qtc间期延长。
38.进一步的，当输出数据为维生素e琥珀酸酯(vitamin e succinate)、n 2-呋喃酰甘氨酸(n-(2-furoyl)glycine)、孕烯醇酮(pregnenolone)、腺苷蛋氨酸(ademetionine)、3-氨基异丁酸(3-aminoisobutyric acid)、甘氨酸(glycine)、n-乙酰-l-谷氨酸(n-acetyl-l-glutamic acid)、l-丙氨酸(l-alanine)、甲氧去甲肾上腺素(normetanephrine)、lpc(18:1)、胺基丁酸(gaba)、磷脂酰胆碱(phosphocholine)、2,6二甲基庚酰肉碱(2,6dimethylheptanoyl carnitine)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.60时，该代谢标志物可以监测药物治疗2周后的qtc间期延长。
39.进一步的，当输出数据为维生素e琥珀酸酯(vitamin e succinate)、lpc(16:0)、β-d氨基葡萄糖(beta-d-glucosamine)、孕烯醇酮(pregnenolone)、丝氨酸(dl-serine)、l-丙氨酸(l-alanine)、甘氨酸(glycine)、胺基丁酸(gaba)、龙胆酸(gentisic acid)、酰基甘氨酸(nicotinuric acid)、lpc(18:1)、腺苷蛋氨酸(ademetionine)、去氧胆酸(deoxycholic acid)、胆汁酸(cholic acid)、磷脂酰胆碱(phosphocholine)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.60时，该代谢标志物可以监测药物治疗4周后的qtc间期延长。
40.进一步的，当输出数据为维生素e琥珀酸酯(vitamin e succinate)、lpc(16:0)、β-d氨基葡萄糖(beta-d-glucosamine)、甘氨酸(glycine)、丝氨酸(dl-serine)、l-丙氨酸(l-alanine)、酪胺(tyramine)、柠檬酸(citric acid)、尿酸(uric acid)、孕烯醇酮(pregnenolone)、d-亮氨酸(d-leucine)、n-乙酰-l-天门冬酰胺(n-acetylasparagine)棕榈酰肉碱(palmitoylcarnitine)、β-脲基异丁酸(beta-ureidoisobutyric acid)、甘油酸(l-glyceric acid)、尿刊酸(urocanic acid)、肌氨酸(sarcosine)、尿刊酸酯(urocanate)、n,n-二甲基甘氨酸(n,n-dimethylglycine)、酰基甘氨酸(nicotinuric acid)、水苏糖(stachyose)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.60时，该代谢标志物可以监测药物治疗8周后的qtc间期延长。
附图说明
41.图1为利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组0周时pca模型得分图
42.图2为利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组0周时pls-da模型得分图
43.图3为利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组0周时opls-da模型得分图
44.图4为利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组2周时pca模型得分图
45.图5为利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组2周时pls-da模型得分图
46.图6为利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组2周时opls-da
resistant tuberculosis，xdr-tb)的类型。
60.实施例1代谢标志物的筛选
61.1.1研究对象纳入及分组
62.纳入年龄18-65岁，首都医科大学附属北京胸科医院收治确诊的利福平耐药肺结核，服用含贝达喹啉为主方案治疗的患者作为研究对象。
63.利福平耐药结核病诊断按照who 2021年新的定义分类执行，包括：
①
利福平单/多耐药结核病(rifampicin-resistant tuberculosis,rr-tb)：是指结核病患者感染的结核分枝杆菌体外药物敏感试验证实对单个利福平耐药或利福平及除异烟肼以外的药物耐药的结核病；
②
耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，mdr-tb)：是指结核病患者感染的结核分枝杆菌体外药物敏感试验证实至少同时对异烟肼和利福平耐药的结核病；
③
前广泛耐药结核病(pre-extensively drug-resistant tuberculosis，pre-xdr-tb)：符合mdr/rr-tb定义，同时对任意氟喹诺酮类药品(包括左氧氟沙星、莫西沙星)耐药的mtb菌株引起的结核病；
④
广泛耐药结核病(extensive drug-resistant tuberculosis，xdr-tb)：是指结核病患者感染的结核分枝杆菌体外药物敏感试验证实除至少同时对异烟肼和利福平耐药外，还对任何喹诺酮类药物产生耐药，以及a组药物中贝达喹啉或利奈唑胺耐药的结核病。所有入组肺结核患者均符合诊断标准。
64.1.1.1纳入标准
65.(1)表型或分子药物敏感性试验(drug susceptibility testing，dst)确诊的利福平耐药肺结核患者；
66.(2)按照who及我国耐药结核病治疗相关指南和共识治疗原则，应用含贝达喹啉为主的治疗方案；
67.(3)无严重的心、肝、肾、肺功能不全者；
68.(4)无有临床意义的心律失常表现，心电图显示qtcf(按心率校正、采用fridericia公式计算的qt值)＜450ms者；
69.(5)在治疗和随访期间能够按照要求服药，完成治疗监测，并能及时向医师报告不良反应的患者；
70.(6)签署知情同意书者。
71.1.1.2排除标准
72.(1)有贝达喹啉过敏史者；
73.(2)伴有严重疾病，筛查时包括丙氨酸转氨酶/天冬氨酸转氨酶(alt/ast)＞3
×
uln或总胆红素＞2
×
uln，肌酐清除率＜30ml/min，血红蛋白≤70g/l和/或血小板＜50
×
109/l；(3)有高风险的心脏合并症病史，出现过导致qt间期延长的一种或多种风险因素；
74.(4)妊娠期、哺乳期妇女；
75.(5)拒绝签署知情同意书者。
76.1.1.3具体分组
77.qtc间期延长组：确诊利福平耐药肺结核患者，服用含贝达喹啉为主方案治疗期间出现qtc间期延长15例，收集尚未服用抗结核治疗方案时(0周)，用药后2周、4周、8周时的晨尿中段尿尿液样本。
78.qtc间期非延长组：确诊利福平耐药肺结核患者，服用含贝达喹啉为主方案治疗期
间未出现qtc间期延长30例，收集尚未服用抗结核治疗方案时(0周)，用药后2周、4周、8周时的晨尿中段尿尿液样本。
79.1.2治疗方案
80.1.2.1治疗方案制定原则
81.按照who及我国耐药结核病治疗相关指南和共识提出的治疗原则制定由贝达喹啉和最佳背景治疗的方案。最佳背景治疗方案由临床专家根据患者药敏试验结果、既往抗结核药物用药史以及患者对药物的耐受性、可获得性等情况个体化制定，可选择的药物包括：莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、氯法齐明、环丝氨酸、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、阿米卡星、卷曲霉素、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸、美罗培南、亚胺培南/西司他汀等。
82.1.2.2贝达喹啉剂量与用法
83.成人治疗第1-2周，每次400mg，1次/d，与食物同服；之后改为每次200mg，每周3次(两次服药至少间隔48小时)，持续22周。贝达喹啉总疗程为24周。在临床上，服用贝达喹啉药物可能出现qt延长，同时服用可延长qt间期的药物可能引起叠加的qt延长作用。监测心电图，在患者用药期间出现明显的室性心律失常或者qtc间期》500ms时，依照病人情况停用贝达喹啉。
84.1.2.3检查及观察项目
85.(1)痰结核分枝杆菌检查：治疗前痰结核分枝杆菌涂片3次、痰结核分枝杆菌培养1次、痰分子生物学耐药检测2次。治疗后每2个月痰结核分枝杆菌涂片及痰结核分枝杆菌培养检查；
86.(2)胸部影像学检查：治疗前及治疗后每2个月进行胸部影像学检查一次；
87.(3)临床症状的记录：定期记录患者临床症状的变化；
88.(4)治疗前及治疗后每半月复查肝肾功能、电解质、血尿常规、视力、心电图(electrocardiogram，ekg)、甲状腺功能等；
89.(5)随时记录药物的不良事件、处理方法及效果；严重的不良反应须由申请者决定是否需要退组。并按照gcp要求进行处理和上报。
90.1.3实验方法
91.1.3.1样本收集及保存
92.收取利福平耐药肺结核患者初诊尚未服用含贝达喹啉的耐药结核治疗方案时的晨尿，及在用药后2周、4周、8周时的晨尿中段尿尿液样本50ml，置于50ml离心管中，4℃1500g离心10min，转移上清分装至新的离心管中，弃去沉淀，在-20℃储存至使用。所有受试者签署知情同意书并详细记录其临床病案信息。所有样本以组别和序号的形式重新命名，保护受试者隐私。
93.1.3.2非靶向代谢组学技术差异筛选
94.(1)代谢物提取
95.取样本于4℃解冻，每例样本取1ml进行冷冻浓缩干燥，分别加入1ml预冷甲醇/乙腈/水(2:2:1，v/v/v)，冰浴中超声60min，-20℃孵育1h沉淀蛋白，再14000g于4℃离心20min，取上清进行真空干燥。质谱检测时加入100μl乙腈-水溶液(1:1，v/v)复溶，14000g于4℃条件下离心15min，取上清进行进样分析。已处理好的所有样本各取5μl进行混合，制备成质量控制样品(quality control，qc)，用于评估实验方法的稳定性。
96.(2)色谱分离
97.样品采用shimadzu nexera x2 lc-30ad超高压液相色谱仪(shimadzu岛津，日本)进行分离，色谱柱使用acquityuplc hss t3(2.1
×
150mm,1.8μm)(waters，milford，ma，usa)。流动相：a液为水含25mm乙酸铵和25mm氨水。b液为100％乙腈。样品置于4℃自动进样器中，柱温25℃，流速为0.3ml/min，进样量5μl。液相色谱梯度如下：0-0.5min，b液维持在95％；0.5-7min，b液从95％线性变化到65％；7-9min，b液从65％线性变化到40％；9-10min，b液维持在40％；10-11.1min，b液从40％线性变化到95％；11.1-16min，b液维持在95％。样本队列中每隔8个实验样本设置1个qc样本，用于检测和评价系统的稳定性及重复性。
98.(3)质谱条集
99.使用超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱仪(uplc-q-exactive-orbitrap-ms/ms)(thermo scientific，美国)在正离子和负离子模式下分别进行质谱检测。esi源参数如下：source temperature 600℃，ion source gas1(gas1)：60，ion source gas2(gas2)：60,curtain gas(cur)：30,ion spray voltage floating(isvf)
±
5500v。tof ms scan m/z range:60-1200da,product ion scan m/z range:25-1200da,tof ms scan accumulation time 0.15s/spectra,product ion scan accumulation time 0.03s/spectra；二级质谱采用information dependent acquisition(ida)获得，并且采用high sensitivity模式，declustering potential(dp):
±
60v,collision energy:30ev,ida设置如下exclude isotopes within 4da,candidate ions to monitorper cycle:6。
100.(4)质控分析
101.qc样本正离子模式和负离子模式下的质谱总离子流图分别进行谱图叠加比较，同时对qc样本的每个信号峰计算相对标准偏差(relative standard deviation，rsd)，去除rsd超过30％的信号峰。
102.1.4数据预处理
103.原始数据采用msdial软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(质量偏差mass tolerance＜20ppm)和二级谱图匹配(质量偏差mass tolerance＜0.02da)的方式，检索hmdb、massbank等公共数据库及自建标准品库basedeepbp，得到包含化合物保留时间、质荷比和峰强度等信息。缺失值处理采用删除组内样本内缺失值大于50％的离子峰；对正负离子数据分别进行总峰面积归一化，整合正负离子峰并应用r软件进行模式识别，数据经unit variance scaling(uv)预处理后进行后续数据分析。
104.1.5统计分析
105.对利福平耐药肺结核病患者采用含贝达喹啉为主的方案治疗过程中尿液代谢组学数据的变化进行统计分析，比较qtc间期延长组和qtc间期非延长组尿液代谢组学的差异。基于主成分分析法(principal component analysis，pca)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，opls-da)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis，pls-da)等多元统计分析结果，结合fold change、t-test、volcano plot等单变量分析，以|log2foldchange|≥0.58，p＜0.05，vip＞1.0为筛选条件，揭示不同组别的代谢组成的差异，遴选出预测/监测qt间期延长的尿液代谢组学标志物。分析结果以得分图(scores plot)的形式表示，如图1到图12。
106.1.6差异代谢物分类及鉴定
107.对尿液代谢组学在利福平耐药肺结核病治疗过程中预测/监测qtc间期延长的差异代谢物进行分类统计，采用spss软件进行基于logistic模型的受试者工作特征曲线(receiver operating curve，roc)计算，获得尿液差异代谢标志物的roc曲线下面积(area under the curve，auc)；如图13到图16所示。
108.基于测定180例样本，其中包括利福平耐药肺结核患者qtc间期延长组中60例(4组：尚未服用含贝达喹啉为主治疗方案时(0周)、服用含贝达喹啉为主方案治疗后2周、4周、8周；每组15例)及利福平耐药肺结核患者qtc间期非延长组中120例(4组：尚未服用含贝达喹啉为主治疗方案时(0周)、服用含贝达喹啉为主方案治疗后2周、4周、8周；每组30例)患者的尿液代谢物结果分析，鉴别出其中的差异代谢标志物。
109.1.6.1利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长的预测标志物筛及验证
110.筛选利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组在尚未服用含贝达喹啉为主治疗方案时(0周)得到的差异代谢物共13种，在95％可信区间，13种尿液代谢标志物的auc值在0.65333-0.81111之间，具体如表1所示。
111.表1利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组0周差异代谢物数据
[0112] 名称auc1lpc(16:0)0.811112棕榈酰肉碱(palmitoylcarnitine)0.732223吡哆酸(pyridoxic acid)0.731114异冬谷酸(isospaglumic acid)0.726675n-乙酰-l-天门冬氨酸(n-acetyl-l-aspartic acid)0.726676甘氨酸(glycine)0.724447腺苷蛋氨酸(ademetionine)0.728l-丙氨酸(l-alanine)0.686679腺苷(adenosine)0.6822210n-乙酰-l-天门冬酰胺(n-acetylasparagine)0.6777811木糖醇(pentitol)0.67778122，3-二羟基戊酸(2,3-dihydroxyvaleric acid)0.6755613磷酸胆碱(phosphocholine)0.65333
[0113]
对筛选得到的13种尿液差异代谢标志物进行统计并绘制roc曲线，按表1排序的尿液差异代谢标志物顺序，前2种、3种、5种、7种、10种、13种尿液差异代谢标志物组合检测的auc值分别为：0.703、0.788、0.815、0.837、0.839、0.837。可知采用筛选得到的13种尿液代谢标志物对利福平耐药肺结核病患者进行预测不良反应qtc间期延长具有较高的准确性，具体如图13所示。
[0114]
1.6.2利福平耐药肺结核病患者治疗2周后qtc间期延长监测标志物的筛选及验证
[0115]
筛选利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组在服用含贝达喹啉为主方案治疗后2周得到的差异代谢物共13种，在95％可信区间，13种尿液代谢标志物的auc在0.61556-0.84667之间，具体如表2所示。
[0116]
表2利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组2周差异代谢物数据
[0117][0118][0119]
对筛选得到的13种尿液差异代谢标志物进行统计并绘制roc曲线，按表2排序的尿液差异代谢标志物顺序，前2种、3种、5种、7种、10种、13种尿液差异代谢标志物组合检测的auc值分别为：0.786、0.801、0.854、0.88、0.887、0.883。可知采用筛选得到的13种尿液代谢标志物对利福平耐药肺结核病患者服用含贝达喹啉为主方案治疗后2周监测qtc间期延长具有较高的准确性，具体如图14所示。
[0120]
1.6.3利福平耐药肺结核病患者治疗4周后qtc间期延长监测标志物的筛选及验证
[0121]
筛选利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组在服用含贝达喹啉为主方案治疗后4周得到的差异代谢物共15种，在95％可信区间，15种尿液代谢标志物的auc在0.62667-0.83111之间，具体如表3所示。
[0122]
表3利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组4周差异代谢物数据
[0123][0124][0125]
对筛选得到的15种尿液差异代谢标志物进行统计并绘制roc曲线，按表3排序的尿液差异代谢标志物顺序，前2种、3种、5种、7种、10种、15种尿液差异代谢标志物组合检测的auc值分别为：0.752、0.808、0.857、0.874、0.881、0.886。可知采用筛选得到的15种尿液代谢标志物对利福平耐药肺结核病患者服用含贝达喹啉为主方案治疗后4周监测qtc间期延长具有较高的准确性，具体如图15所示。
[0126]
1.6.4利福平耐药肺结核病患者治疗8周后qtc间期延长监测标志物的筛选及验证
[0127]
筛选利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组在服用含贝达喹啉为主方案治疗后8周得到的差异代谢物共21种，在95％可信区间，21种尿液代谢标志物的auc在0.64778-0.9之间，具体如表4所示。
[0128]
表4利福平耐药肺结核病患者qtc间期延长组与qtc间期非延长组8周差异代谢物数据
[0129][0130][0131]
对筛选得到的21种尿液差异代谢标志物进行统计并绘制roc曲线，按表4排序的尿液差异代谢标志物顺序，前2种、3种、5种、10种、20种、21种尿液差异代谢标志物组合检测的auc值分别为：0.798、0.797、0.807、0.836、0.829、0.828。可知采用筛选得到的21种尿液代谢标志物对利福平耐药肺结核病患者服用含贝达喹啉为主方案治疗后8周监测qtc间期延长具有较高的准确性，具体如图16所示。

技术特征：
1.一种用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物，所述代谢标志物选自lpc(16:0)、棕榈酰肉碱(palmitoylcarnitine)、吡哆酸(pyridoxicacid)、异冬谷酸(isospaglumicacid)、n-乙酰-l-天门冬氨酸(n-acetyl-l-asparticacid)、甘氨酸(glycine)、腺苷蛋氨酸(ademetionine)、l-丙氨酸(l-alanine)、腺苷(adenosine)、n-乙酰-l-天门冬酰胺(n-acetylasparagine)、木糖醇(pentitol)、2，3-二羟基戊酸(2,3-dihydroxyvaleric acid)、磷酸胆碱(phosphocholine)、维生素e琥珀酸酯(vitaminesuccinate)、n2-呋喃酰甘氨酸(n-(2-furoyl)glycine)、孕烯醇酮(pregnenolone)、3-氨基异丁酸(3-aminoisobutyricacid)、n-乙酰-l-谷氨酸(n-acetyl-l-glutamicacid)、甲氧去甲肾上腺素(normetanephrine)、lpc(18:1)、胺基丁酸(gaba)、磷脂酰胆碱(phosphocholine)、2,6二甲基庚酰肉碱(2,6dimethylheptanoylcarnitine)、β-d氨基葡萄糖(beta-d-glucosamine)、丝氨酸(dl-serine)、龙胆酸(gentisicacid)、酰基甘氨酸(nicotinuricacid)、去氧胆酸(deoxycholicacid)、胆汁酸(cholicacid)、酪胺(tyramine)、柠檬酸(citricacid)、尿酸(uricacid)、d-亮氨酸(d-leucine)、β-脲基异丁酸(beta-ureidoisobutyricacid)、甘油酸(l-glycericacid)、尿刊酸(urocanicacid)、肌氨酸(sarcosine)、尿刊酸酯(urocanate)、n,n-二甲基甘氨酸(n,n-dimethylglycine)、水苏糖(stachyose)中的一种或多种。2.如权利要求1所述的用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物为lpc(16:0)、棕榈酰肉碱(palmitoylcarnitine)、吡哆酸(pyridoxicacid)、异冬谷酸(isospaglumicacid)、n-乙酰-l-天门冬氨酸(n-acetyl-l-asparticacid)、甘氨酸(glycine)、腺苷蛋氨酸(ademetionine)、l-丙氨酸(l-alanine)、腺苷(adenosine)、n-乙酰-l-天门冬酰胺(n-acetylasparagine)、木糖醇(pentitol)、2，3-二羟基戊酸(2,3-dihydroxyvalericacid)、磷酸胆碱(phosphocholine)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.65时，该代谢标志物可以预测qtc间期延长。3.如权利要求1所述的用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物为维生素e琥珀酸酯(vitaminesuccinate)、n2-呋喃酰甘氨酸(n-(2-furoyl)glycine)、孕烯醇酮(pregnenolone)、腺苷蛋氨酸(ademetionine)、3-氨基异丁酸(3-aminoisobutyricacid)、甘氨酸(glycine)、n-乙酰-l-谷氨酸(n-acetyl-l-glutamicacid)、l-丙氨酸(l-alanine)、甲氧去甲肾上腺素(normetanephrine)、lpc(18:1)、胺基丁酸(gaba)、磷脂酰胆碱(phosphocholine)、2,6二甲基庚酰肉碱(2,6dimethylheptanoylcarnitine)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.60时，该代谢标志物可以监测药物治疗2周后的qtc间期延长。4.如权利要求1所述的用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物，其特征在于，当所述代谢标志物为维生素e琥珀酸酯(vitaminesuccinate)、lpc(16:0)、β-d氨基葡萄糖(beta-d-glucosamine)、孕烯醇酮(pregnenolone)、丝氨酸(dl-serine)、l-丙氨酸(l-alanine)、甘氨酸(glycine)、胺基丁酸(gaba)、龙胆酸(gentisicacid)、酰基甘氨酸(nicotinuricacid)、lpc(18:1)、腺苷蛋氨酸(ademetionine)、去氧胆酸(deoxycholicacid)、胆汁酸(cholicacid)、磷脂酰胆碱(phosphocholine)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.60时，该代谢标志物可以监测药物治疗4周后的qtc间期延长。
5.如权利要求1所述的用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物，其特征在于，当所述代谢标志物为维生素e琥珀酸酯(vitaminesuccinate)、lpc(16:0)、β-d氨基葡萄糖(beta-d-glucosamine)、甘氨酸(glycine)、丝氨酸(dl-serine)、l-丙氨酸(l-alanine)、酪胺(tyramine)、柠檬酸(citricacid)、尿酸(uricacid)、孕烯醇酮(pregnenolone)、d-亮氨酸(d-leucine)、n-乙酰-l-天门冬酰胺(n-acetylasparagine)棕榈酰肉碱(palmitoylcarnitine)、β-脲基异丁酸(beta-ureidoisobutyricacid)、甘油酸(l-glyceric acid)、尿刊酸(urocanicacid)、肌氨酸(sarcosine)、尿刊酸酯(urocanate)、n,n-二甲基甘氨酸(n,n-dimethylglycine)、酰基甘氨酸(nicotinuricacid)、水苏糖(stachyose)中的一种或多种时，且其一种或多种的auc值＞0.60时，该代谢标志物可以监测药物治疗8周后的qtc间期延长。6.如权利要求1-5所述的用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物在制备预测/监测耐药肺结核患者qtc间期延长的制剂中的应用。7.一种用于预测/监测耐药肺结核患者qtc间期延长的试剂盒，所述试剂盒是含有检测代谢标志物的试剂、说明书等，所述代谢标志物包括权利要求1-5所述的用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物。8.一种用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物的筛选方法，所述方法包括如下步骤：s1.尿液采集及保存：收取受试者晨尿中段尿尿液样本；s2.尿液中代谢物的提取：取样本经过冷冻浓缩干燥、沉淀、离心，取上清进行真空干燥后进行色谱、质谱分析，得到峰对齐、保留时间校正和提取峰面积；s3.以上述色谱、质谱得到的数据和检索hmdb、massbank、标准品库basedeepbp等公共数据库比较，数据进行归一化处理；s4.多元统计分析：采用主成分分析法(principalcomponentanalysis，pca)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis，opls-da)、偏最小二乘判别分析(partialleastsquaresdiscriminantanalysis，pls-da)统计分析，结合foldchange、t-test、volcanoplot等单变量分析，筛选qtc间期延长的代谢标志物。s5.差异代谢标志物的鉴定：以代谢标志物的roc曲线下面积(areaunderthecurve，auc)值auc＞0.6为标准。9.如权利要求8所述用于预测/监测qtc间期延长的代谢标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选qtc间期延长的代谢标志物是基于不同组别的代谢组成的差异，筛选出预测/监测qt间期延长的尿液代谢组学标志物，其筛选条件为|log2foldchange|≥0.58，p＜0.05，vip＞1.0。10.一种qtc间期延长的预测/监测系统，所述系统包括数据输入、数据处理和结果输出模块，所述数据输入是将受试者的尿液代谢提取物经色谱、质谱检测得到的作为输入数据；所述数据输入包含有权利要求1-5所述的代谢标志物；所述数据处理是将权利要求1-5所述的代谢标志物进行auc值的检测，所述数据输出是权利要求1-5所述的代谢标志物的auc值，通过auc值预测/监测qtc间期延长。

技术总结
本发明属于本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利福平耐药结核病治疗过程中的关于QTc间期延长的代谢标志物的筛选及应用，所述代谢标志物可预测/监测耐药肺结核患者在药物治疗过程中出现的不同时期的QTc间期延长；该标志物可用来作为预测/监测耐药肺结核患者QTc间期延长的试剂盒和预测模型；该标物的筛选为耐药结核病患者在药物治疗过程中的QTc间期延长提供了易操作、高效、快捷的预测/监测方法。法。


技术研发人员：逄宇 于佳佳 唐神结 袁金锋 李姗姗 马丽萍 刘荣梅 丁卫民
受保护的技术使用者：北京市结核病胸部肿瘤研究所
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/9/9