一种荧光探针及三重真菌毒素免疫层析试纸条的制备方法

1.本发明涉及免疫层析试纸条及制备的技术领域，尤其涉及真菌毒素荧光检测探针的制备方法、荧光检测探针、基于荧光检测探针的三重检测don、afb1、zen的核壳上转换免疫层析试纸条、以及核壳上转换免疫层析试纸条的检测方法。


背景技术：

2.真菌毒素是丝状真菌产生的次生毒性代谢产物，几乎可以污染所有种类的食物，并通过食物链生物富集影响人体健康。常见的毒素包括黄曲霉毒素b1(afb1)、玉米赤霉烯酮(zen)、脱氧雪腐镰刀菌醇(don)、t-2毒素(t-2)和伏马菌素b1(fb1)等。afb1被列为ⅰ类致癌物，属于剧毒物质范畴，具有致癌、致畸、致突变作用。don是谷物中禾谷镰刀菌产生的常见真菌毒素，具有免疫抑制、神经毒性、胚胎毒性和致畸性，其污染通常存在于玉米、小麦、大米和大麦等谷物中。zen由禾谷镰刀菌产生，会使动物体内雌激素水平过高，从而造成生殖系统、神经系统、心脏、肾脏等的损伤。由于大多数真菌可以产生多种真菌毒素，单一毒素又可以污染多种农产品和食品，导致食品和饲料中出现多种真菌毒素共污染的现象。农产品大规模监测发现，97.6％检测样品被两种或两种以上真菌毒素污染。研究表明，真菌毒素的协同或拮抗作用比单一毒素对人类和动物健康的影响更严重。因此，迫切需要开发真菌毒素的多重检测方法。


技术实现要素：

3.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
4.鉴于上述现有存在的问题，提出了本发明。
5.因此，本发明解决的技术问题是：提出一种真菌毒素的多重检测方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种真菌毒素荧光检测探针的制备方法，包括以下步骤，制备上转换纳米粒子核心nayf4:yb，er，并包裹nayf4:yb壳层得到核壳ucnps；用聚丙烯酸paa修饰所述核壳ucnps，得到水溶性复合物paa-ucnps；用所述水溶性复合物paa-ucnps偶联真菌毒素抗体，得到核壳上转换荧光检测探针ucnps-mab。
7.优选的，所述上转换纳米粒子核心nayf4:yb，er的制备，包括以下步骤，按比例称取1mol/lycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、ercl3·
6h2o(78:20:2)共计1mmol，加入油酸、十八烯，升温至100℃使固体完全溶解；自然冷却后，逐滴加入含2.5mmolnaoh、4.0mmolnh4f的甲醇溶液，升温至120℃去除甲醇；反应物在n2保护下，300℃保持90min，用乙醇-环己烷混合溶液反复洗涤；最后重悬于环己烷溶液，得到nayf4:yb,er环己烷分散液，即核心ucnps。
8.优选的，所述nayf4:10％yb壳层的包裹，包括以下步骤，按比例称取1mol/lycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o(9:1)共计1mmol，加入油酸、十八烯，升温至100℃固体完全溶解；自然冷却后，加入所述nayf4:yb，er环己烷分散液，升温去除环己烷；自然冷却后，逐滴加入含
2.5mmolnaoh、4.0mmolnh4f的甲醇溶液，升温至120℃去除甲醇；反应物在n2保护下，300℃保持90min，用乙醇-环己烷混合溶液反复洗涤；最后重悬于环己烷溶液，得到nayf4:yb，er@nayf4:yb环己烷分散液，即核壳ucnps。
9.优选的，所述水溶性复合物paa-ucnps的制备，包括以下步骤，将所述核壳ucnps加入0.05mol/l盐酸和乙醇，离心洗涤重复3次后，超声分散在超纯水；按体积比为2:1(v
ucnps
：v
paa
)加入3％paa溶液(ph.9.5)，超声反应1h；反应结束后，将混合液高速离心后的沉淀分散在超纯水，即得水溶性良好的水溶性复合物paa-ucnps。
10.优选的，所述核壳上转换荧光探针ucnps-mab的制备，包括以下步骤，分别各取3管1mgpaa-ucnps溶液，加入500μl超纯水，离心洗涤；每管沉淀加入500μlmes6.5溶液、20μledc(25mg/ml)溶液、20μlnhs(37.5mg/ml)溶液，在dna旋转仪上孵育30min；用mes6.5溶液洗去表面残留溶液，高速离心取沉淀，每管沉淀中加入500μlmes6.5溶液，分别加入抗体don-mab、afb1-mab、zen-mab，孵育2.5h；加入1％bsa封闭液，继续孵育1h，离心取沉淀，用500μlmes6.5溶液洗去表面残留溶液，离心取沉淀，分散在100μl保存液，即3种偶联不同抗体的荧光检测探针ucnps-mab。
11.6.根据权利要求5的所述制备方法，其特征在于：所述don-mab、afb1-mab、zen-mab，用量分别是15μgdon-mab、15μgafb1-mab、20μgzen-mab。
12.一种三重检测don、afb1、zen的核壳上转换免疫层析试纸条，包括采用如权利要求1～6所述真菌毒素荧光检测探针的制备方法所制得的3种荧光检测探针，所述核壳上转换免疫层析试纸条沿样品流动方向依次包括样品垫、标记垫、硝酸纤维膜以及吸水纸；其中所述标记垫包括3种荧光检测探针；所述硝酸纤维膜上沿着样品流动的方向依次设置有t1、t2、t3检测线和c线，t1检测线包含与don-mab特异性结合的don-bsa，t2检测线包含与afb1-mab特异性结合的afb1-bsa，t3检测线包含与zen-mab特异性结合的zen-bsa。
13.优选的，包括以下制备步骤，制备标记垫：将标记好的3种荧光检测探针ucnps-mab均匀混合，并用保存液稀释两倍，按体积比20:1加入溴酚蓝染料所得到的混合溶液，均匀喷涂至处理过的结合垫上，所述样品垫与结合垫还包括以下处理步骤，将样品垫与结合垫浸泡于含0.5％bsa、1％tween-20、0.5％pvp-40、3％蔗糖和1％海藻糖的pbs处理液中30min后，在37℃干燥过夜；制备硝酸纤维膜：将don-bsa、afb1-bsa、zen-bsa、羊抗鼠igg溶液按照0.8μl/cm速度均匀喷涂至硝酸纤维膜上，分别作为t1、t2、t3检测线和c线，所述t1、t2、t3、c线之间间隔为2mm，在50℃烘箱内烘干12h。
③
试纸条组装：以pvc板作为衬垫，依次将吸水纸、结合垫、样品垫组装起来，切成3.7mm宽单条，获得三重检测真菌毒素的核壳上转换免疫层析试纸条，在密封、干燥、阴凉条件下储存。
14.优选的，3种荧光检测探针ucnps-mab按照3:2:3(ucnps-don-mab：ucnps-afb1-mab：ucnps-zen-mab)的比例混合；所述don-bsa、afb1-bsa、zen-bsa、羊抗鼠igg的划线浓度为0.5mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、0.1mg/ml。
15.一种三重检测真菌毒素的核壳上转换免疫层析试纸条的检测方法，包括以下步骤，利用所述核壳ucnps在荧光检测仪器激发下发射荧光和竞争免疫法原理，实现真菌毒素的定性和定量检测；加100μl待测溶液于样品垫，室温静置10min后放入980nm激发光波长的荧光检测仪器下，检测试纸条t线、c线的荧光强度。将检测所得荧光强度带入到标准工作曲线计算出待测溶液中真菌毒素含量；所述标准工作曲线是根据不同浓度梯度真菌毒素标准
品溶液及其对应荧光强度的拟合曲线。
16.本发明的有益效果：本发明提供了一种基于新型核壳ucnps纳米材料作为标记物的免疫层析试纸条，满足了三重检测don、afb1、zen真菌毒素的需求，有望为粮食中多种真菌毒素共存的快速检测提供有力的工具；二是本发明提出一种核壳上转换免疫层析试纸条的检测方法，能实现对多种真菌毒素定性和定量检测的目的，具有操作简单、快速、灵敏度高、结果直观的优点，在维护食品安全和消费者权益方面具有重要意义。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
18.图1为本发明所述真菌毒素荧光检测探针的制备示意图；
19.图2为本发明所述核壳上转换纳米粒子的tem图及粒径分布图；
20.图3为本发明所述核壳上转换纳米粒子的xrd及荧光检测图；
21.图4为本发明所述核壳上转换纳米粒子的紫外可见吸收光谱图；
22.图5为本发明所述三重检测免疫层析试纸条的工作原理示意图；
23.图6为本发明所述三重检测免疫层析试纸条的灵敏性及标准曲线结果；
24.图7为本发明所述三重检测免疫层析试纸条的特异性结果；
25.图8为本发明所述三重检测免疫层析试纸条检测玉米粉、小麦粉实际样品中真菌毒素的灵敏性结果。
具体实施方式
26.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
27.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
28.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
29.本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。
30.同时在本发明的描述中，需要说明的是，术语中的“上、下、内和外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此
不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一、第二或第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
31.本发明中除非另有明确的规定和限定，术语“安装、相连、连接”应做广义理解，例如：可以是固定连接、可拆卸连接或一体式连接；同样可以是机械连接、电连接或直接连接，也可以通过中间媒介间接相连，也可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
32.实施例1
33.近年来，真菌毒素多重检测方法发展迅速，免疫分析技术中应用最广泛的是酶联免疫吸附测定法(elisa)和胶体金免疫测定法，但市面上多数elisa试剂盒仅能检测分析单一真菌毒素。胶体金技术虽然能检测多种毒素，但其结果只能实现对真菌毒素的定性或半定量，且最低检测限达不到实际现场应用要求。免疫层析法(ica)基于纳米材料标记的生物探针和抗原-抗体特异性结合的独特优势，在过去几十年不断发展，在现场快速多重检测方面显示出巨大潜力。荧光标记物会对免疫层析方法灵敏度起决定性作用。
34.本实施例公开了一种核壳上转换纳米粒子的荧光检测探针，及一种三重检测don、afb1、zen的核壳上转换免疫层析试纸条及其检测方法。
35.一种真菌毒素荧光检测探针的制备及表征，参考图1。荧光检测探针制备包括以下步骤：
36.制备上转换纳米粒子核心nayf4:yb，er，并包裹nayf4:10％yb壳层得到核壳ucnps；
37.用聚丙烯酸paa修饰所述核壳ucnps，得到水溶性复合物paa-ucnps；
38.用所述水溶性复合物paa-ucnps偶联真菌毒素抗体，得到核壳上转换荧光检测探针ucnps-mab。
39.具体制备方法如下：
40.(1)制备核心上转换纳米粒子nayf4:yb，er，并包裹壳层以得到核壳ucnps(nayf4:yb，er@nayf4:yb)
41.具体地，
42.按比例称取1mol/lycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、ercl3·
6h2o(78:20:2)共计1mmol，升温至水分完全蒸发。加入6ml油酸和15ml十八烯，升温至100℃固体完全溶解，溶液呈现淡黄色。自然冷却后，逐滴加入含2.5mmolnaoh、4.0mmolnh4f的甲醇溶液，升温至120℃去除甲醇。反应物在n2保护下，300℃保持90min。上述所有实验操作要在磁力搅拌下进行。待自然冷却至常温后，用乙醇-环己烷混合物(v：v＝1:1)反复洗涤3次，最后重悬于环己烷溶液，得到nayf4:yb,er环己烷分散液，即核心ucnps(简称c)。
43.按比例称取1mol/lycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o(9:1)共计1mmol，升温至水分完全蒸发。加入6ml油酸和15ml十八烯，升温至100℃固体完全溶解，溶液呈现淡黄色。自然冷却后，加入上述nayf4:yb，er环己烷分散液，加热至100℃并维持30min，以除去环己烷。自然冷却后，逐滴加入含2.5mmolnaoh、4.0mmolnh4f的甲醇溶液，继续升温至110℃并保持20min。反应物在n2保护下，300℃保持90min。上述所有实验操作要在磁力搅拌下进行。待自然冷却至常温后，加入乙醇-环己烷混合物(v：v＝1:1)反复洗涤3次，最后重悬于环己烷溶液，得到nayf4:yb，er@nayf4:yb环己烷分散液，即核壳ucnps(简称cs-10yb)。
44.(2)用聚丙烯酸(paa)修饰核壳ucnps，得到水溶性paa-ucnps
45.在步骤(1)3ml核壳ucnps加入0.05mol/l盐酸和乙醇，超声洗涤并高速离心取沉淀，如此操作重复3次，超声分散在超纯水。按体积比为2:1(v
ucnps
：v
paa
)加入3％paa溶液(ph.9.5)，超声反应1h。反应结束后，将混合液高速离心后的沉淀分散在4ml超纯水，即得水溶性良好的paa-ucnps。
46.(3)用paa-ucnps偶联抗体，得到核壳上转换荧光探针ucnps-mab
47.分别各取3管1mgpaa-ucnps溶液，加入500μl超纯水，离心洗涤。每管沉淀加入500μlmes6.5溶液、20μledc(25mg/ml)溶液、20μlnhs(37.5mg/ml)溶液，在dna旋转仪上孵育30min。用mes6.5溶液洗去表面残留溶液，高速离心取沉淀。每管沉淀中加入500μlmes6.5溶液，分别加入don-mab、afb1-mab、zen-mab，孵育2.5h。加入1％bsa封闭液，继续孵育1h，离心取沉淀。用500μlmes6.5溶液洗去表面残留溶液，离心取沉淀，分散在100μl保存液(0.5％tween-20、3％蔗糖、1％海藻糖和1％bsa的pbs保存液)，即3种偶联不同抗体(don-mab、afb1-mab、zen-mab)的荧光检测探针ucnps-mab。
48.don-mab、afb1-mab、zen-mab，用量分别是15μgdon-mab、15μgafb1-mab、20μgzen-mab。
49.(4)性能表征
50.利用tem及xrd对核壳上转换纳米粒子的形貌、结构及尺寸进行表征，参考图2和图3。tem图片显示c和cs-10yb粒子在环己烷溶液中均具有良好的分散性，形状较规则，呈现六边形结构。c的粒径约为29nm，cs-10yb的粒径增大至约41nm，证明nayf4:10％yb壳层包裹成功且厚度约为6nm。xrd谱图表明c和cs-10yb纳米粒子的衍射峰位置与β-nayf4标准卡片(jcpdsno.28-1192)一致，说明它们均为纯六方相晶型。
51.相较于c，cs-10yb的荧光信号显著增强，绿光以及红光荧光强度分别增强了44倍和68倍，可见壳层包裹钝化了晶体的表面缺陷，壳层上的yb
3+
，促进了近红外激发光的吸收，将更多的能量传递给er
3+
，从而提高ucnps的发光强度和发光效率。
52.参考图4，cs-10yb连接抗体后的荧光检测探针，在260nm附近有明显的紫外吸收峰(dna的特征吸收峰在260nm)，而未连接抗体的cs-10yb则无明显吸收峰，说明抗体成功连接到cs-10yb表面上。
53.实施例2:
54.本实施例中提出一种三重检测don、afb1、zen的核壳上转换免疫层析试纸条的制备，参考图1，沿样品流动方向依次包括样品垫、标记垫、硝酸纤维膜以及吸水纸；
55.标记垫包括3种分别偶联不同抗体的荧光检测探针；硝酸纤维膜上沿着样品流动的方向依次设置有t1、t2、t3检测线和c线，t1检测线包含与don-mab特异性结合的don-bsa，t2检测线包含与afb1-mab特异性结合的afb1-bsa，t3检测线包含与zen-mab特异性结合的zen-bsa。
56.上述三重检测真菌毒素的核壳上转换免疫层析试纸条，包括以下步骤：
57.①
制备标记垫：将标记好的3种荧光检测探针ucnps-mab均匀混合，并用保存液(0.5％tween-20、3％蔗糖、1％海藻糖和1％bsa的pbs保存液)稀释两倍，按体积比20:1加入溴酚蓝染料所得到的混合溶液，均匀喷涂至处理过的结合垫上。
②
制备硝酸纤维膜：将don-bsa、afb1-bsa、zen-bsa、羊抗鼠igg溶液按照0.8μl/cm速度均匀喷涂至硝酸纤维膜上，分别
作为t1、t2、t3检测线和c线，t1、t2、t3、c线之间间隔为2mm，在50℃烘箱内烘干12h。
③
试纸条组装：以pvc板作为衬垫，依次将吸水纸、结合垫、样品垫组装起来，切成3.7mm宽单条，获得三重检测真菌毒素的核壳上转换免疫层析试纸条，密封、干燥、阴凉下储存。
58.步骤
①
中3种荧光检测探针ucnps-mab按照3:2:3(ucnps-don-mab：ucnps-afb1-mab：ucnps-zen-mab)的比例混合。
59.don-bsa、afb1-bsa、zen-bsa、羊抗鼠igg的划线浓度为0.5mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、0.1mg/ml。
60.样品垫与结合垫处理需经处理，包括以下步骤，将样品垫与结合垫浸泡于含0.5％bsa、1％tween-20、0.5％pvp-40、3％蔗糖和1％海藻糖的pbs处理液中30min后，在37℃干燥过夜。
61.实施例3：
62.一种三重检测真菌毒素的核壳上转换免疫层析试纸条的检测技术，是利用竞争法原理实现样品中毒素的定性检测和定量检测。参照图5为三重检测免疫层析试纸条的工作原理示意图。
63.本发明具体原理如下：
64.当样品中不存在目标毒素或低于检测下限时，荧光检测探针上的目标毒素抗体会与t线上目标毒素抗原产生特异性结合，t线发出荧光，检测结果显示为阴性；当样品中目标毒素含量大于或等于检测下线时，目标毒素与t线上相应抗原都会竞争性结合荧光检测探针上的抗体，荧光检测探针上抗体会优先与目标毒素结合，抗体上结合位点封闭而无法与t线上目标毒素抗原结合，t线不发出荧光，检测结果显示为阳性；目标毒素含量与t线荧光强度成反比关系，含量越高，对应t线荧光强度越低。
65.本发明中试纸条具体检测步骤如下：
66.加100μl待测溶液于样品垫，室温静置10min后放入980nm激发光波长的荧光检测仪器下，检测试纸条t线、c线的荧光强度。根据荧光强度带入到标准工作曲线计算出待测溶液中真菌毒素含量。标准工作曲线是根据不同浓度梯度真菌毒素标准品溶液及其对应荧光强度的拟合曲线。
67.优选的，标准品和实际样品检测时的稀释液为pbst溶液。制备pbst溶液：称取0.5gtween-20加入100mlpbs溶液(0.01m，7.4)。
68.实施例4：
69.三重检测真菌毒素的核壳上转换免疫层析试纸条的灵敏性和特异性
70.灵敏性检测：
71.在本发明中，以don为例，标准工作曲线绘制方法，包括以下步骤：
72.按各浓度梯度配置呕吐毒素标准品溶液；将浓度梯度的呕吐毒素标准品溶液滴加到免疫层析试纸条，10min后获得对应浓度下的荧光信号结果；以呕吐毒素标准品溶液浓度的对数值为横坐标，以荧光信号的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
73.在本发明中，截止阈值(cut-off)定义为10次空白样品结果的均值(mean)减去3倍的标准标准差(sd)，即mean-3sd。在检测某一浓度样品时，其t/c值小于截止阈值，即为阳性，反之则相反。选择与空白样品做对照时，阳性样品t/c值小于截止阈值时的最低浓度作为试纸条的灵敏性。
74.在本发明中，afb1和zen的标准曲线及灵敏性与呕吐毒素的绘制方法相同，不再赘述。
75.作为本发明的具体实施例，浓度梯度的don、afb1、zen标准品溶液及其荧光强度，具体标准曲线，见表1和图6。
76.表1:don、afb1、zen标准品溶液稀释浓度
[0077][0078]
如图6所示，随着真菌毒素标品浓度的不断增加，对应荧光强度不断降低。经计算，don的截止阈值定义在1.08，afb1的截止阈值定义在0.78，zen的截止阈值定义在0.97。
[0079]
don标准品浓度在0.25ng/ml～1000ng/ml的范围内时，荧光强度与don浓度的对数之间拥有良好的线性关系，标准曲线方程为y＝-0.4939x-0.3222(r2＝0.9923)，检测限为0.25ng/ml；
[0080]
afb1标准品浓度在0.05ng/ml～50ng/ml的范围内时，荧光强度与afb1浓度的对数之间拥有良好的线性关系，标准曲线方程为y＝-0.3718x
–
0.6085(r2＝0.9902)，检测限为0.05ng/ml；
[0081]
zen标准品浓度在0.1ng/ml～100ng/ml的范围内时，荧光强度与zen浓度的对数之间拥有良好的线性关系，标准曲线方程为y＝-0.2092x-0.2246(r2＝0.9903)，检测限为0.1ng/ml。
[0082]
与之前报道一些单独检测don、afb1、zen或三重检测的方法相比，本发明方法具有相当的灵敏性和更广的线性范围。
[0083]
特异性检测：
[0084]
以t-2、fb、ota、afm1毒素为竞争物，配置上述标品浓度为50ng/ml；配制don、afb1、zen、don+afb1、don+zen、afb1+zen、don+afb1+zen不同毒素混合溶液，各毒素浓度为50ng/ml。如图7所示，t-2、fb、ota不会干扰三重检测试纸条检测的荧光信号，无交叉反应，表明该发明的三重检测试纸条具有高特异性；afm1毒素检测中会对t2线对应的afb1含量造成干扰，因为两者是同系物，结构有相似性，但afm1主要存在于乳制品中，对谷物类真菌毒素检测不会产生影响。
[0085]
为了排除三个真菌毒素(don、afb1、zen)的相互干扰对检测结果准确性产生影响，对本发明方法三重检测don、afb1、zen的交叉反应性进行了评估，这对于靶标多重检测体系的构建至关重要。仅检测don时，只有t1信号显著下降；仅检测afb1时，只有t2信号显著下降；仅检测zen时，只有t3信号显著下降；当两种目标毒素混合时，仅对应检测线信号降低，说明本方法三重检测don、afb1和zen不会产生交叉反应。
[0086]
实施例5：
[0087]
三重检测真菌毒素的核壳上转换免疫层析试纸条的实际样品检测
[0088]
取待测样品用小型粉碎机粉碎后过20目筛，收集过筛后的粉末。称取5g样品于
50ml聚丙烯离心管，加入一定量的毒素标准品溶液，加入25ml甲醇/乙腈/水(40:12:40，v：v：v)，室温下超声5min再震荡5min，5000r/min离心5min，收集上清液。用上述pbst缓冲液将上清液稀释5倍。取100ul稀释后提取物于试纸条样品孔内，静置10min后读取结果。所有实验都重复三次。
[0089]
如图8所示，分别对玉米和小麦实际样品进行don、afb1、zen的三重检测。经计算，在玉米样品中，don的截止阈值定义在1.37，afb1的截止阈值定义在0.86，zen的截止阈值定义在1.05。该三重检测免疫层析试纸条在玉米样品中don的检测限为0.25μg/kg，afb1的检测限为0.1μg/kg，zen的检测限为0.25μg/kg。荧光强度与真菌毒素浓度对数之间均拥有良好的线性关系。
[0090]
在小麦样品中，don的截止阈值定义在1.21，afb1的截止阈值定义在1.07，zen的截止阈值定义在1.15。该三重检测免疫层析试纸条在玉米样品中don的检测限为0.25μg/kg，afb1的检测限为0.1μg/kg，zen的检测限为0.5μg/kg。荧光强度与真菌毒素浓度对数之间均拥有良好的线性关系。
[0091]
相较于标准品溶液中的检测限，三重检测免疫层析试纸条在实际样品中的检测限有所下降，但仍远小于国家限量标准和市售胶体金试纸条的检测限，且在实际样品检测中具有优越的实用性和广阔的应用前景。
[0092]
应当认识到，本发明的实施例可以由计算机硬件、硬件和软件的组合、或者通过存储在非暂时性计算机可读存储器中的计算机指令来实现或实施。所述方法可以使用标准编程技术-包括配置有计算机程序的非暂时性计算机可读存储介质在计算机程序中实现，其中如此配置的存储介质使得计算机以特定和预定义的方式操作——根据在具体实施例中描述的方法和附图。每个程序可以以高级过程或面向对象的编程语言来实现以与计算机系统通信。然而，若需要，该程序可以以汇编或机器语言实现。在任何情况下，该语言可以是编译或解释的语言。此外，为此目的该程序能够在编程的专用集成电路上运行。
[0093]
此外，可按任何合适的顺序来执行本文描述的过程的操作，除非本文另外指示或以其他方式明显地与上下文矛盾。本文描述的过程(或变型和/或其组合)可在配置有可执行指令的一个或多个计算机系统的控制下执行，并且可作为共同地在一个或多个处理器上执行的代码(例如，可执行指令、一个或多个计算机程序或一个或多个应用)、由硬件或其组合来实现。所述计算机程序包括可由一个或多个处理器执行的多个指令。
[0094]
进一步，所述方法可以在可操作地连接至合适的任何类型的计算平台中实现，包括但不限于个人电脑、迷你计算机、主框架、工作站、网络或分布式计算环境、单独的或集成的计算机平台、或者与带电粒子工具或其它成像装置通信等等。本发明的各方面可以以存储在非暂时性存储介质或设备上的机器可读代码来实现，无论是可移动的还是集成至计算平台，如硬盘、光学读取和/或写入存储介质、ram、rom等，使得其可由可编程计算机读取，当存储介质或设备由计算机读取时可用于配置和操作计算机以执行在此所描述的过程。此外，机器可读代码，或其部分可以通过有线或无线网络传输。当此类媒体包括结合微处理器或其他数据处理器实现上文所述步骤的指令或程序时，本文所述的发明包括这些和其他不同类型的非暂时性计算机可读存储介质。当根据本发明所述的方法和技术编程时，本发明还包括计算机本身。计算机程序能够应用于输入数据以执行本文所述的功能，从而转换输入数据以生成存储至非易失性存储器的输出数据。输出信息还可以应用于一个或多个输出
设备如显示器。在本发明优选的实施例中，转换的数据表示物理和有形的对象，包括显示器上产生的物理和有形对象的特定视觉描绘。
[0095]
如在本技术所使用的，术语“组件”、“模块”、“系统”等等旨在指代计算机相关实体，该计算机相关实体可以是硬件、固件、硬件和软件的结合、软件或者运行中的软件。例如，组件可以是，但不限于是：在处理器上运行的处理、处理器、对象、可执行文件、执行中的线程、程序和/或计算机。作为示例，在计算设备上运行的应用和该计算设备都可以是组件。一个或多个组件可以存在于执行中的过程和/或线程中，并且组件可以位于一个计算机中以及/或者分布在两个或更多个计算机之间。此外，这些组件能够从在其上具有各种数据结构的各种计算机可读介质中执行。这些组件可以通过诸如根据具有一个或多个数据分组(例如，来自一个组件的数据，该组件与本地系统、分布式系统中的另一个组件进行交互和/或以信号的方式通过诸如互联网之类的网络与其它系统进行交互)的信号，以本地和/或远程过程的方式进行通信。
[0096]
还应当理解的是，本发明通过实施方式加以描述，实施例仅为针对本发明权利要求所提出技术方案能够实现所给出清楚完整的说明，即对权利要求的解释说明，因此当评判本发明说明书记载的技术方案是否公开充分时，应当予以充分考虑权利要求所限定方案的旨在核心要义，而在说明书中必然存在与本实施例所提出解决核心技术问题相无关的其他技术问题，其对应的技术特征、技术方案均不属于本实施例要义所指，属于非必要技术特征，故可参照隐含公开，本领域技术人员完全可以结合现有技术和公知常识进行实现，因此无任何必要做详述。
[0097]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种真菌毒素荧光检测探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，制备上转换纳米粒子核心nayf4:yb，er，并包裹nayf4:yb壳层得到核壳ucnps；用聚丙烯酸paa修饰所述核壳ucnps，得到水溶性复合物paa-ucnps；用所述水溶性复合物paa-ucnps偶联真菌毒素抗体，得到核壳上转换荧光检测探针ucnps-mab。2.根据权利要求1的所述制备方法，其特征在于：所述上转换纳米粒子核心nayf4:yb，er的制备，包括以下步骤，按比例称取1mol/lycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、ercl3·
6h2o(78:20:2)共计1mmol，加入油酸、十八烯，升温至100℃使固体完全溶解；自然冷却后，逐滴加入含2.5mmolnaoh、4.0mmolnh4f的甲醇溶液，升温至120℃去除甲醇；反应物在n2保护下，300℃保持90min，用乙醇-环己烷混合溶液反复洗涤；最后重悬于环己烷溶液，得到nayf4:yb,er环己烷分散液，即核心ucnps。3.根据权利要求1的所述制备方法，其特征在于：所述nayf4:10％yb壳层的包裹，包括以下步骤，按比例称取1mol/lycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o(9:1)共计1mmol，加入油酸、十八烯，升温至100℃固体完全溶解；自然冷却后，加入所述nayf4:yb，er环己烷分散液，升温去除环己烷；自然冷却后，逐滴加入含2.5mmolnaoh、4.0mmolnh4f的甲醇溶液，升温至120℃去除甲醇；反应物在n2保护下，300℃保持90min，用乙醇-环己烷混合溶液反复洗涤；最后重悬于环己烷溶液，得到nayf4:yb，er@nayf4:yb环己烷分散液，即核壳ucnps。4.根据权利要求1的所述制备方法，其特征在于：所述水溶性复合物paa-ucnps的制备，包括以下步骤，将所述核壳ucnps加入0.05mol/l盐酸和乙醇，离心洗涤重复3次后，超声分散在超纯水；按体积比为2:1(v
ucnps
：v
paa
)加入3％paa溶液(ph.9.5)，超声反应1h；反应结束后，将混合液高速离心后的沉淀分散在超纯水，即得水溶性良好的水溶性复合物paa-ucnps。5.根据权利要求1的所述制备方法，其特征在于：所述核壳上转换荧光探针ucnps-mab的制备，包括以下步骤，分别各取3管1mgpaa-ucnps溶液，加入500μl超纯水，离心洗涤；每管沉淀加入500μlmes6.5溶液、20μledc(25mg/ml)溶液、20μlnhs(37.5mg/ml)溶液，在dna旋转仪上孵育30min；用mes6.5溶液洗去表面残留溶液，高速离心取沉淀，每管沉淀中加入500μlmes6.5溶液，分别加入抗体don-mab、afb1-mab、zen-mab，孵育2.5h；加入1％bsa封闭液，继续孵育1h，离心取沉淀，用500μlmes6.5溶液洗去表面残留溶液，离心取沉淀，分散在100μl保存液，即3种偶联不同抗体的荧光检测探针ucnps-mab。6.根据权利要求5的所述制备方法，其特征在于：所述don-mab、afb1-mab、zen-mab，用
量分别是15μgdon-mab、15μgafb1-mab、20μgzen-mab。7.一种三重检测don、afb1、zen的核壳上转换免疫层析试纸条，其特征在于：包括采用如权利要求1～6所述真菌毒素荧光检测探针的制备方法所制得的3种荧光检测探针，所述核壳上转换免疫层析试纸条沿样品流动方向依次包括样品垫、标记垫、硝酸纤维膜以及吸水纸；其中所述标记垫包括3种荧光检测探针；所述硝酸纤维膜上沿着样品流动的方向依次设置有t1、t2、t3检测线和c线，t1检测线包含与don-mab特异性结合的don-bsa，t2检测线包含与afb1-mab特异性结合的afb1-bsa，t3检测线包含与zen-mab特异性结合的zen-bsa。8.根据权利要求7所述的核壳上转换免疫层析试纸条，其特征在于：包括以下制备步骤，制备标记垫：将标记好的3种荧光检测探针ucnps-mab均匀混合，并用保存液(0.5％tween-20、3％蔗糖、1％海藻糖和1％bsa的pbs保存液)稀释两倍，按体积比20:1加入溴酚蓝染料所得到的混合溶液，均匀喷涂至处理过的结合垫上，所述样品垫与结合垫还包括以下处理步骤，将样品垫与结合垫浸泡于含0.5％bsa、1％tween-20、0.5％pvp-40、3％蔗糖和1％海藻糖的pbs处理液中30min后，在37℃干燥过夜；制备硝酸纤维膜：将don-bsa、afb1-bsa、zen-bsa、羊抗鼠igg溶液按照0.8μl/cm速度均匀喷涂至硝酸纤维膜上，分别作为t1、t2、t3检测线和c线，所述t1、t2、t3、c线之间间隔为2mm，在50℃烘箱内烘干12h。
③
试纸条组装：以pvc板作为衬垫，依次将吸水纸、结合垫、样品垫组装起来，切成3.7mm宽单条，获得三重检测真菌毒素的核壳上转换免疫层析试纸条，在密封、干燥、阴凉条件下储存。9.根据权利要求8所述的核壳上转换免疫层析试纸条，其特征在于：3种荧光检测探针ucnps-mab按照3:2:3(ucnps-don-mab：ucnps-afb1-mab：ucnps-zen-mab)的比例混合；所述don-bsa、afb1-bsa、zen-bsa、羊抗鼠igg的划线浓度为0.5mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、0.1mg/ml。10.一种三重检测真菌毒素的核壳上转换免疫层析试纸条的检测方法，其特征在于：包括以下步骤，利用所述核壳ucnps在荧光检测仪器激发下发射荧光和竞争免疫法原理，实现真菌毒素的定性和定量检测；加100μl待测溶液于样品垫，室温静置10min后放入980nm激发光波长的荧光检测仪器下，检测试纸条t线、c线的荧光强度。将检测所得荧光强度带入到标准工作曲线计算出待测溶液中真菌毒素含量；所述标准工作曲线是根据不同浓度梯度真菌毒素标准品溶液及其对应荧光强度的拟合曲线。

技术总结
本发明公开了一种荧光探针及三重真菌毒素免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤，制备上转换纳米粒子核心NaYF4:Yb，Er，并包裹NaYF4:Yb壳层得到核壳UCNPs；用聚丙烯酸PAA修饰所述核壳UCNPs，得到水溶性复合物PAA-UCNPs；用所述水溶性复合物PAA-UCNPs偶联真菌毒素抗体，得到核壳上转换荧光检测探针UCNPs-mAb。本发明的有益效果：本发明提供了一种基于新型核壳UCNPs纳米材料作为标记物的免疫层析试纸条，满足了三重检测DON、AFB1、ZEN真菌毒素的需求，有望为粮食和饲料中多种真菌毒素共污染的快速检测提供有力的工具；二是本发明提出一种核壳上转换免疫层析试纸条的检测方法，能实现对多种真菌毒素定性和定量检测的目的。实现对多种真菌毒素定性和定量检测的目的。实现对多种真菌毒素定性和定量检测的目的。


技术研发人员：朱军莉 陆海霞 沈央红 张雯
受保护的技术使用者：浙江工商大学
技术研发日：2023.06.03
技术公布日：2023/9/12