一种双重抗钙化的小口径人工血管及其制备方法

1.本发明属于人工血管技术领域，具体涉及一种双重抗钙化的小口径人工血管及其制备方法。


背景技术：

2.血管损伤是临床上常见的疾病，包括自然灾害、交通意外、战争等造成的急性损伤和冠心病、动脉粥样硬化等造成的慢性心血管疾病。血管移植是临床上治疗心血管疾病的重要手段之一。临床上血管钙化是一种常见的病理过程，会导致血管壁柔滑性降低，血管变脆变硬，血流顺应性变低。导致心肌缺血、心室肥大，引发血栓，动脉粥样硬化、脑卒中等情况发生。同样，钙化是人工血管长期植入失败的主要因素，表现为羟基磷灰石在血管壁的沉积。其形成原因非常复杂，可能与材料降解速率、顺应性及降解产物等相关，还可能与机体代谢、发育和炎症反应密切相关。因此，开发出一种能够可替换的长期抗钙化小口径人工血管支架对心血管疾病的治疗具有重要的研究意义和临床意义。


技术实现要素：

3.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种双重抗钙化的小口径人工血管及其制备方法，本发明制备含有脱细胞基质的人工血管支架，在制备支架的过程中加入组织蛋白酶s(cathepsin s，cat s)抑制剂，并且将支架用黄芩苷进行物理交联，具有达到双重抗钙化的效果。
4.本发明具体是通过如下技术方案来实现的。
5.一种双重抗钙化的小口径人工血管，沿血管内径方向，由内至外依次包括：抗钙化功能层和结构支撑功能层；
6.所述抗钙化功能层是通过将含有基础材料的溶液一通过静电纺丝制得，所述含有基础材料的溶液一中含有脱细胞基质粉末和组织蛋白酶s抑制剂；
7.所述结构支撑功能层是通过将含有基础材料的溶液二通过静电纺丝制得；
8.所述抗钙化功能层和所述结构支撑功能层中均通过物理交联的方式负载有黄芩苷。
9.进一步的，含有基础材料的溶液一中的基础材料、含有基础材料的溶液二中的基础材料均为聚l-丙交酯-己内酯。
10.上述双重抗钙化的小口径人工血管的制备方法，包括以下步骤：
11.s1、溶液配制
12.将基础材料溶于溶剂中，制备体系一；在体系一中加入脱细胞基质粉末，制备体系二；将组织蛋白酶s抑制剂加入体系二中，制备含有基础材料的溶液一；
13.将黄芩苷加入溶剂中，制备体系三；
14.s2、人工血管支架的制备
15.将含有基础材料的溶液一通过静电纺丝制备血管支架内层；将所述血管支架内层
置于体系三中，震荡，进行物理交联，制备抗钙化功能层；
16.在所述抗钙化功能层外侧，将体系一通过静电纺丝制备血管支架外层，获得支架前体，将支架前体置于体系三中，震荡，进行物理交联，制备结构支撑功能层，即完成所述双重抗钙化的小口径人工血管的制备。
17.进一步的，体系一中，溶剂为六氟异丙醇，基础材料的质量/体积浓度为12％；
18.体系二中，脱细胞基质粉末的质量/体积浓度为0.5-5％；
19.含有基础材料的溶液一中，组织蛋白酶s抑制剂的浓度为50-500mg/ml；
20.体系三中，溶剂为六氟异丙醇，黄芩苷的浓度为0.5-5.0mg/ml。
21.进一步的，制备血管支架内层时，静电纺丝条件为：血管支架内层流速0.1-4.0ml/h，电压为6-15kv，接收距离为8-20cm。
22.进一步的，制备血管支架外层时，静电纺丝条件为：血管外层流速1.0-6.0ml/h，电压为8-15kv，接收距离为10-20cm。
23.进一步的，将所述血管支架内层置于体系三中，物理交联时间为1-2d。
24.进一步的，将支架前体置于体系三中，物理交联的时间为1-2d。
25.进一步的，制备结构支撑功能层后，置于真空干燥箱中干燥24-48h。
26.本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
27.本发明提供的双重抗钙化的小口径人工血管支架，支架上负载抗钙化药物成分和脱细胞基质粉末(decellularized extracellular matrix,decm)。支架在功能上起到促组织再生、抑制血管钙化的发生。天然血管中含有促进细胞生长的活性因子。将天然血管猪胸主动脉脱细胞去除免疫原性，冷冻干燥，研磨成粉末。制备的小口径人工血管支架由基础材料聚l-丙交酯-己内酯(plcl)组成，其结构分为两层，内层为抗钙化功能层(由脱细胞基质粉末复合plcl，负载抗钙化药物cat s抑制剂用来预防钙化的发生)，外层为结构支撑功能层(由单纯的plcl组成，增强人工血管的力学性能，使其具有良好的抗拉伸性能)。此外，整个支架通过物理交联的方式负载黄芩苷，以期从支架微观结构维度来减少钙离子沉积位点，抑制人工血管钙化的发生。
28.其中，黄芩苷(baicalin,ba)的交联机制可能与主要由蛋白酰胺羰基与黄芩苷酚羟基形成的氢键相互作用有关。黄芩苷可以与富含脯氨酸的弹性蛋白和胶原蛋白的疏水区特异性结合，形成多个氢键，有效保护弹性蛋白免受酶降解，抑制弹性蛋白相关的钙化(弹性蛋白衍生肽可诱导细胞的成骨转化，与血管钙化有关)。黄芩苷交联脱细胞基质材料可以阻断磷酸钙成核，抑制矿物质沉积，有效抑制钙化。
29.组织蛋白酶s(cathepsin s,cat s)是一种半胱氨酸蛋白酶，可切割弹性蛋白并产生具有生物活性的弹性蛋白肽，从而促进心血管炎症和钙化。巨噬细胞分泌的cat s可降解弹性蛋白。当弹性蛋白层被破坏时，促进血管平滑肌细胞(vsmc)增殖，进而导致病变形成和生长。弹性蛋白降解产物激活了vsmc向成骨分化。cat s切割的弹性蛋白片段比随机切割的弹性蛋白片段更有效地促进vsmc成骨活性。本发明通过添加半胱氨酸蛋白酶抑制剂c(一种组织蛋白酶的内源性抑制剂)来抑制cat s活性，减弱由cat s引起的vsmc成骨分化。
30.本发明人工血管支架产品通过交联黄芩苷、负载cat s抑制剂的双重作用，很好的抑制钙化的发生。
附图说明
31.图1为本发明使用的黄芩苷红外检测；
32.图2为sem观察实施例1-3和对比例1制备的人工血管支架表面磷灰石的沉积情况；
33.图3为sd大鼠皮下埋植取材现场图片；
34.图4为对实施例1和对比例2人工血管支架进行vonkossa染色观察钙化情况。
具体实施方式
35.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
36.下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
37.一种双重抗钙化的小口径人工血管，沿血管内径方向，由内至外依次包括：抗钙化功能层和结构支撑功能层；
38.所述抗钙化功能层是通过将含有基础材料的溶液一通过静电纺丝制得，所述含有基础材料的溶液一中含有脱细胞基质粉末和组织蛋白酶s抑制剂；
39.所述结构支撑功能层是通过将含有基础材料的溶液二通过静电纺丝制得；
40.所述抗钙化功能层和所述结构支撑功能层中均通过物理交联的方式负载有黄芩苷。
41.更具体的，支架上负载抗钙化药物成分和脱细胞基质粉末(decellularized extracellularmatrix，decm)。支架在功能上起到促组织再生、抑制血管钙化的发生。天然血管中含有促进细胞生长的活性因子。将天然血管猪胸主动脉脱细胞去除免疫原性，冷冻干燥，研磨成粉末。制备的小口径人工血管支架由基础材料聚l-丙交酯-己内酯(plcl)组成，其结构分为两层，内层为抗钙化功能层(由脱细胞基质粉末复合plcl，负载抗钙化药物cat s抑制剂用来预防钙化的发生)，外层为结构支撑功能层(由单纯的plcl组成，增强人工血管的力学性能，使其具有良好的抗拉伸性能)。此外，整个支架通过物理交联的方式负载黄芩苷，以期从支架微观结构维度来减少钙离子沉积位点，抑制人工血管钙化的发生。本发明人工血管支架产品通过交联黄芩苷、负载cat s抑制剂的双重作用，很好的抑制钙化的发生。
42.本发明选取了plcl、脱细胞基质粉末、黄芩苷、cat s抑制剂作为血管支架组成成分。plcl为fda批准可用于医疗药品的材料，安全可靠。脱细胞基质粉末是将猪的胸主动脉进行了脱细胞，完全去除了免疫原性，经冷冻干燥研磨而制备成的粉末。其来源为天然血管，具有良好的生物相容性，含有促进内皮、平滑肌、成纤维细胞生长的多种生物因子，能够有效的促进人工血管组织再生。并且，脱细胞基质粉末为天然组分，有良好的生物降解性，使得血管的降解过程和组织再生能够相匹配，成功的避免了动脉瘤的发生。黄芩苷是从药用植物黄芩中提取的天然化合物，黄酮类物质，其中的酚羟基可与蛋白酰胺羰基形成氢键相互作用；并且黄酮类物质与富含脯氨酸的弹性蛋白和胶原蛋白的疏水区特异性结合，形成多个氢键。有效保护弹性蛋白免受酶降解(弹性蛋白降解的衍生肽可诱导细胞的成骨转化，与血管钙化有关)，进一步抑制弹性蛋白引发的钙化。脱细胞基质中含有弹性蛋白和胶原蛋白，含有脱细胞基质的人工血管与黄芩苷交联之后，可以保护弹性蛋白的降解，从而减
少钙化的发生。组织蛋白酶s(cathepsin s，cat s)，可切割弹性蛋白并产生具有生物活性的弹性蛋白肽，从而促进心血管炎症和钙化。所以血管支架制备过程中负载cat s抑制剂，来减少弹性蛋白被切割，从而减少血管支架钙化情况的发生。
43.下面具体通过以下实施例对本发明进行具体说明。
44.实施例1
45.一种双重抗钙化的小口径人工血管的制备方法，包括以下步骤：
46.(1)脱细胞基质粉末的制备
47.将从屠宰场取回的猪胸主动脉进行脱细胞，采用高低渗溶液，tritonx-100和生物酶相结合的方法进行脱细胞，冷冻干燥，研磨制备成粉末，-20℃保存备用。
48.(2)静电纺丝溶液的制备
49.1)配制plcl溶液：将1.2gplcl材料溶于10ml六氟异丙醇(hfip)中，溶液在磁力搅拌机上搅拌过夜，得到质量/体积浓度为12％的plcl溶液。
50.2)配制含有脱细胞基质粉末的溶液：将脱细胞基质粉末溶于1)中配好的溶液，得到质量/体积浓度为0.5％的溶液。溶液在磁力搅拌机上搅拌数小时，备用。
51.3)称取一定质量的cats抑制剂，溶解于2)中，使其药物终浓度为50mg/ml。
52.4)配制黄芩苷交联溶液：称取一定质量的黄芩苷粉末，溶于六氟异丙醇(hfip)中，浓度为0.5mg/ml，超声1min。此溶液供支架进行物理交联抗钙化用。
53.(3)人工血管支架的制备
54.通过静电纺丝的方法，制备黄芩苷交联的负载cat s抑制剂的脱细胞基质粉末可降解抗钙化人工血管支架。将步骤3)配制的溶液进行静电纺丝，静电纺丝条件为：血管支架内层流速0.1ml/h，电压为6kv，接收距离为8cm；血管在纺完内层之后连同不锈钢棒置于含有不同浓度黄芩苷溶液的器皿中进行震荡物理交联1d。交联结束后，继续静电纺丝纺血管支架外层，将步骤1)配制plcl溶液进行静电纺丝，血管外层流速1.0ml/h，电压为8kv，接收距离为10cm。管状支架的接收器是直径为2mm的不锈钢棒。纺丝结束后进行脱管，将脱离不锈钢棒的血管支架再次进行交联1d。交联结束后，将人工血管置于真空干燥箱中干燥24h，得到黄芩苷交联的负载cat s抑制剂的双重抗钙化脱细胞基质人工血管。
55.实施例2
56.一种双重抗钙化的小口径人工血管的制备方法，包括以下步骤：
57.(1)脱细胞基质粉末的制备
58.将从屠宰场取回的猪胸主动脉进行脱细胞，采用高低渗溶液，tritonx-100和生物酶相结合的方法进行脱细胞，冷冻干燥，研磨制备成粉末，-20℃保存备用。
59.(2)静电纺丝溶液的制备
60.1)配制plcl溶液：将1.2gplcl材料溶于10ml六氟异丙醇(hfip)中，溶液在磁力搅拌机上搅拌过夜，得到质量/体积浓度为12％的plcl溶液。
61.2)配制含有脱细胞基质粉末的溶液：将脱细胞基质粉末溶于1)中配好的溶液，得到质量/体积浓度为5％的溶液。溶液在磁力搅拌机上搅拌数小时，备用。
62.3)称取一定质量的cats抑制剂，溶解于2)中，使其药物终浓度为500mg/ml。
63.4)配制黄芩苷交联溶液：称取一定质量的黄芩苷粉末，溶于六氟异丙醇(hfip)中，浓度为5.0mg/ml，超声5min。此溶液供支架进行物理交联抗钙化用。
64.(3)人工血管支架的制备
65.通过静电纺丝的方法，制备黄芩苷交联的负载cat s抑制剂的脱细胞基质粉末可降解抗钙化人工血管支架。将步骤3)配制的溶液进行静电纺丝，静电纺丝条件为：血管支架内层流速4.0ml/h，电压为15kv，接收距离为20cm；血管在纺完内层之后连同不锈钢棒置于含有不同浓度黄芩苷溶液的器皿中进行震荡物理交联2d。交联结束后，继续静电纺丝纺血管支架外层，将步骤1)配制plcl溶液进行静电纺丝，血管外层流速6.0ml/h，电压为15kv，接收距离为20cm。管状支架的接收器是直径为6mm的不锈钢棒。纺丝结束后进行脱管，将脱离不锈钢棒的血管支架再次进行交联2d。交联结束后，将人工血管置于真空干燥箱中干燥48h，得到黄芩苷交联的负载cat s抑制剂的双重抗钙化脱细胞基质人工血管。
66.实施例3
67.一种双重抗钙化的小口径人工血管的制备方法，包括以下步骤：
68.(1)脱细胞基质粉末的制备
69.将从屠宰场取回的猪胸主动脉进行脱细胞，采用高低渗溶液，tritonx-100和生物酶相结合的方法进行脱细胞，冷冻干燥，研磨制备成粉末，-20℃保存备用。
70.(2)静电纺丝溶液的制备
71.1)配制plcl溶液：将1.2gplcl材料溶于10ml六氟异丙醇(hfip)中，溶液在磁力搅拌机上搅拌过夜，得到质量/体积浓度为12％的plcl溶液。
72.2)配制含有脱细胞基质粉末的溶液：将脱细胞基质粉末溶于1)中配好的溶液，得到质量/体积浓度为1％的溶液。溶液在磁力搅拌机上搅拌数小时，备用。
73.3)称取一定质量的cats抑制剂，溶解于2)中，使其药物终浓度为100mg/ml。
74.4)配制黄芩苷交联溶液：称取一定质量的黄芩苷粉末，溶于六氟异丙醇(hfip)中，浓度为1.0mg/ml，超声3min。此溶液供支架进行物理交联抗钙化用。
75.(3)人工血管支架的制备
76.通过静电纺丝的方法，制备黄芩苷交联的负载cat s抑制剂的脱细胞基质粉末可降解抗钙化人工血管支架。将步骤3)配制的溶液进行静电纺丝，静电纺丝条件为：血管支架内层流速2.0ml/h，电压为10kv，接收距离为10cm；血管在纺完内层之后连同不锈钢棒置于含有不同浓度黄芩苷溶液的器皿中进行震荡物理交联1d。交联结束后，继续静电纺丝纺血管支架外层，将步骤1)配制plcl溶液进行静电纺丝，血管外层流速5.0ml/h，电压为10kv，接收距离为15cm。管状支架的接收器是直径为5mm的不锈钢棒。纺丝结束后进行脱管，将脱离不锈钢棒的血管支架再次进行交联2d。交联结束后，将人工血管置于真空干燥箱中干燥24-48h，得到黄芩苷交联的负载cats抑制剂的双重抗钙化脱细胞基质人工血管。
77.对比例1
78.未经黄芩苷交联的血管，制备过程为：
79.(1)脱细胞基质粉末的制备
80.将从屠宰场取回的猪胸主动脉进行脱细胞，采用高低渗溶液，tritonx-100和生物酶相结合的方法进行脱细胞，冷冻干燥，研磨制备成粉末，-20℃保存备用。
81.(2)静电纺丝溶液的制备
82.1)配制plcl溶液：将1.2gplcl材料溶于10ml六氟异丙醇(hfip)中，溶液在磁力搅拌机上搅拌过夜，得到质量/体积浓度为12％的plcl溶液。
83.2)配制含有脱细胞基质粉末的溶液：将脱细胞基质粉末溶于1)中配好的溶液，得到质量/体积浓度为0.5％的溶液。溶液在磁力搅拌机上搅拌数小时，备用。
84.3)称取一定质量的cats抑制剂，溶解于2)中，使其药物终浓度为50mg/ml。
85.(3)人工血管支架的制备
86.将步骤3)配制的溶液进行静电纺丝，静电纺丝条件为：血管支架内层流速0.1ml/h，电压为6kv，接收距离为8cm；继续静电纺丝纺血管支架外层，将步骤1)配制plcl溶液进行静电纺丝，血管外层流速1.0ml/h，电压为8kv，接收距离为10cm。管状支架的接收器是直径为2mm的不锈钢棒。纺丝结束后进行脱管，将人工血管置于真空干燥箱中干燥24h，得到人工血管。
87.对比例2
88.不经过黄芩苷交联处理，未添加cat s抑制剂。
89.制备过程如下：将溶液2)含有脱细胞基质粉末的溶液，进行静电纺丝。静电纺丝条件为：血管支架内层流速0.1ml/h，电压为6kv，接收距离为8cm；血管外层流速1.0ml/h，电压为8kv，接收距离为10cm。管状支架的接收器是直径为2mm的不锈钢棒。纺丝结束后进行脱管，置于真空干燥箱中干燥24h，得到只含有脱细胞基质的对照组人工血管。
90.对上述实施例和对比例制备的材料进行性能表征，具体如下。
91.(1)黄芩苷表征红外图(图1)。黄芩苷通过化学交联的方法与脱细胞基质相结合，傅里叶红外光谱检测到黄芩苷成功交联至血管支架上。
92.(2)将黄芩苷负载在血管支架上，通过模拟体液法来评价支架表面磷灰石沉积的情况(图2)。blank是未经黄芩苷交联的，发现有较多的磷灰石的沉积(即对比例1，白色箭头所示)；将含有脱细胞基质的人工血管支架，于不同浓度的黄芩苷溶液中交联后，基本无磷灰石沉积。说明支架上黄芩苷的存在使得磷灰石不易沉积。推测黄芩苷与脱细胞基质中的蛋白相结合，减少了钙离子的沉积位点，从而有较少的磷灰石沉积在支架上。
93.(3)将实施例1含有cat s抑制剂的人工血管支架，交联黄芩苷。进行sd大鼠皮下埋植，2个月后，取材做组织学染色观察(图3)。
94.(4)动物皮下埋植取材进行冰冻切片，染vonkossa观察其钙化情况(图4，其中虚线和箭头指示钙化位置)。结果表明，与对比例2不经过黄芩苷交联处理、未添加cat s抑制剂相比(即图4中的对照组)，支架经过cat s抑制剂和黄芩苷双重作用下(即图4中的实验组)，能够有效的减少或者抑制钙化的发生。实施例2和实施例3制备的支架材料也具有与实施例1相似的性能，不再一一赘述。
95.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.一种双重抗钙化的小口径人工血管，其特征在于，沿血管内径方向，由内至外依次包括：抗钙化功能层和结构支撑功能层；所述抗钙化功能层是通过将含有基础材料的溶液一通过静电纺丝制得，所述含有基础材料的溶液一中含有脱细胞基质粉末和组织蛋白酶s抑制剂；所述结构支撑功能层是通过将含有基础材料的溶液二通过静电纺丝制得；所述抗钙化功能层和所述结构支撑功能层中均通过物理交联的方式负载有黄芩苷。2.根据权利要求1所述的双重抗钙化的小口径人工血管，其特征在于，含有基础材料的溶液一中的基础材料、含有基础材料的溶液二中的基础材料均为聚l-丙交酯-己内酯。3.根据权利要求1所述的双重抗钙化的小口径人工血管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、溶液配制将基础材料溶于溶剂中，制备体系一；在体系一中加入脱细胞基质粉末，制备体系二；将组织蛋白酶s抑制剂加入体系二中，制备含有基础材料的溶液一；将黄芩苷加入溶剂中，制备体系三；s2、人工血管支架的制备将含有基础材料的溶液一通过静电纺丝制备血管支架内层；将所述血管支架内层置于体系三中，震荡，进行物理交联，制备抗钙化功能层；在所述抗钙化功能层外侧，将体系一通过静电纺丝制备血管支架外层，获得支架前体，将支架前体置于体系三中，震荡，进行物理交联，制备结构支撑功能层，即完成所述双重抗钙化的小口径人工血管的制备。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，体系一中，溶剂为六氟异丙醇，基础材料的质量/体积浓度为12％；体系二中，脱细胞基质粉末的质量/体积浓度为0.5-5％；含有基础材料的溶液一中，组织蛋白酶s抑制剂的浓度为50-500mg/ml；体系三中，溶剂为六氟异丙醇，黄芩苷的浓度为0.5-5.0mg/ml。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，制备血管支架内层时，静电纺丝条件为：血管支架内层流速0.1-4.0ml/h，电压为6-15kv，接收距离为8-20cm。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，制备血管支架外层时，静电纺丝条件为：血管外层流速1.0-6.0ml/h，电压为8-15kv，接收距离为10-20cm。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将所述血管支架内层置于体系三中，物理交联时间为1-2d。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将支架前体置于体系三中，物理交联的时间为1-2d。9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，制备结构支撑功能层后，置于真空干燥箱中干燥24-48h。

技术总结
本发明属于人工血管技术领域，具体涉及一种双重抗钙化的小口径人工血管及其制备方法，沿血管内径方向，由内至外依次包括：抗钙化功能层和结构支撑功能层；所述抗钙化功能层是通过将含有基础材料的溶液一通过静电纺丝制得，所述含有基础材料的溶液一中含有脱细胞基质粉末和组织蛋白酶S抑制剂；所述结构支撑功能层是通过将含有基础材料的溶液二通过静电纺丝制得；所述抗钙化功能层和所述结构支撑功能层中均通过物理交联的方式负载有黄芩苷。本发明制备含有脱细胞基质的人工血管支架，在制备支架的过程中加入组织蛋白酶S抑制剂，并且将支架用黄芩苷进行物理交联，具有达到双重抗钙化的效果。化的效果。化的效果。


技术研发人员：滕彦娇 史杰 吕琪 侯世科
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/9/12