土木香内酯在制备预防和治疗NLRP3介导的疾病的药物中的应用的制作方法

土木香内酯在制备预防和治疗nlrp3介导的疾病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学和药物领域，涉及土木香内酯在制备预防和治疗nlrp3介导的疾病的药物中的应用，具体地，土木香内酯(helenine)通过碳碳双键与nlrp3共价结合来特异性抑制nlrp3炎症小体以改善nlrp3介导的疾病。


背景技术：

2.nlrp3炎症小体是天然免疫的重要组成部分，是以胞内nod样受体家族蛋白3(nlr family,pyrin domain containing 3,nlrp3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,asc)和半胱氨酸天冬氨酸特异性的蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)为核心组成的多蛋白复合物。nlrp3炎症小体的激活需要两级信号的协同参与：细胞通过模式识别受体tlrs识别“信号1”(如脂多糖lps)等，激活nf-κb信号通路，上调nlrp3、pro-il-1β等炎症小体组分蛋白的表达；紧接着在“信号2”(如三磷酸腺苷atp、尼日利亚菌素nigericin)的诱导下，nlrp3招募asc、pro-caspase-1而组装成活性炎症小体，使pro-caspase-1自我剪切活化，活性caspase-1一方面通过剪切gasdermin d介导细胞发生焦亡；另一方面剪切活化pro-il-1β和pro-il-18，介导活性il-1β及il-18的产生和分泌，从而招募中性粒细胞等炎性细胞发挥天然免疫。而持续或过度激活的nlrp3炎症小体可导致多种疾病的发生发展，靶向抑制nlrp3炎症小体则可有效预防和逆转相关疾病炎症、损伤及病理进程。
3.近年来涌现出许多nlrp3炎症小体抑制剂，主要有甘草查尔酮b、刺甘草查尔酮、隐丹参酮、小豆蔻素、鼠尾草酚、脱氢木香内酯、冬凌草甲素、曲尼斯特、mcc950、olt1177、cy-09、萝卜硫素、异甘草素、小白菊内酯。上述化合物在动物模型上对nlrp3相关的疾病显示出潜在的治疗效果。mcc950在较低浓度(10nm)特异性抑制nlrp3炎症小体活化，通过抑制asc聚合抑制nlrp3炎症小体的活化，在nlrp3炎症小体相关的疾病动物模型如实验性自身免疫性脑脊髓炎、muckle
–
wells综合征有良好的疗效，但由于其肝毒性导致mcc950的ⅱ期临床试验被迫暂停。小白菊内酯被报道能够直接作用于caspase-1抑制nlrp3炎症小体的活化，但对于其他炎症小体的活化具有同样的抑制效果；甘草具有悠久的“纳诸药，解百毒”的治病历史，甘草查耳酮b、刺甘草查尔酮和异甘草素都是甘草的主要抗炎成分，能够抑制nlrp3炎症小体活化过程中asc聚合，不影响naip/nlrc4和aim2炎症小体活化，而特异性抑制nlrp3炎症小体来治疗炎症相关疾病。总的来说，特异性抑制nlrp3炎症小体的抑制剂在治疗nlrp3介导的疾病方面显示出巨大的潜力。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供土木香内酯(helenine)的医药新用途。
5.本发明所提供的土木香内酯(helenine，hel)的医药新用途，为：土木香内酯在制备如下产品中的应用：
6.1)nlrp3炎症小体抑制剂；
7.2)nlrp3炎症小体特异性抑制剂；
8.3)预防和/或治疗nlrp3介导的相关疾病的药物。
9.土木香内酯，cas号：546-43-0，分子式为c
15h20
o2，英文名：helenine，化学结构式如下所示：
[0010][0011]
3)中，nlrp3介导的相关疾病，所述疾病为炎症性疾病；
[0012]
所述炎症性疾病包括但不限于：痛风、神经退行性疾病、肠炎、感染性炎症性疾病(如脓毒症、感染休克(例如革兰氏阴性菌感染休克)、溃疡性结肠炎、神经性疾病及脑损伤(如多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏症等)、2型糖尿病、冷热蛋白相关周期性综合征(caps)、动脉粥样硬化或非酒精性肝炎(nash)。优选地，所述炎症性疾病为感染性休克(败血症休克，例如lps诱导的感染性休克)或腹膜炎(例如msu诱导的腹膜炎)。
[0013]
发明人发现hel对nlrp3炎症小体具有特异性抑制作用，能有效抑制nlrp3炎症小体的激活，可用于预防和治疗nlrp3介导的相关疾病的药物。
[0014]
在本发明的实施方案中，本发明提供了hel作为nlrp3炎症小体特异性抑制剂的用途，或hel可作为nlrp3炎症小体相关疾病的潜在治疗药物。
[0015]
具体地，所述用途为制备具有如下至少一种功能的药物中的应用：
[0016]1’
)抑制经典和非经典nlrp3激活；
[0017]2’
)阻断nlrp3依赖的asc寡聚化；
[0018]3’
)抑制nek7-nlrp3相互作用；
[0019]4’
)特异性地抑制nlrp3炎症小体；
[0020]
其中，1’)中，所述经典nlrp3激活指经典nlrp3炎症小体激动剂诱导的caspase-1激活和il-1β分泌；所述经典nlrp3炎症小体激动剂包括尼日利亚菌素、atp、poly(i:c)和sio2；
[0021]1’
)中，所述非经典nlrp3激活指非经典nlrp3炎症小体激活，即抑制pam3csk4引发的bmdm中lps转染诱导的caspase-1裂解和il-1β分泌；
[0022]3’
)中，hel通过碳碳双键与nlrp3共价结合从而抑制nek7-nlrp3相互作用。
[0023]4’
)中，特异性抑制nlrp3炎症小体指hel特异性抑制nlrp3炎症小体介导的caspase-1的裂解和il-1β的分泌；hel不抑制aim2或nlrc4介导的caspase-1激活和il-1β分泌。
[0024]
在本发明的一种实施方案中，本发明提供hel抑制经典和非经典nlrp3激活的用途。
[0025]
具体地，hel抑制经典nlrp3炎症小体激动剂(如尼日利亚菌素、atp、poly(i:c)或
sio2)诱导的caspase-1激活和il-1β分泌；
[0026]
hel抑制非经典nlrp3炎症小体激活，即抑制pam3csk4引发的bmdm中lps转染诱导的caspase-1裂解和il-1β分泌。
[0027]
在本发明的一种实施方案中，本发明提供了hel作为nlrp3炎症小体的特异性抑制剂的用途。
[0028]
具体地，hel特异性抑制nlrp3炎症小体介导的caspase-1的裂解和il-1β的分泌；hel不抑制aim2或nlrc4介导的caspase-1激活和il-1β分泌。
[0029]
在本发明的一种实施方案中，本发明提供了hel阻断nlrp3依赖的asc寡聚化的用途。
[0030]
在本发明的一种实施方案中，本发明证实了hel对nlrp3炎症小体激活期间k
+
流出、ca
2+
信号传导和线粒体活性氧(mtros)产生没有影响。
[0031]
在本发明的一种实施方案中，本发明证实了hel通过碳碳双键与nlrp3共价结合从而抑制nek7-nlrp3相互作用。
[0032]
在本发明的一种实施方案中，本发明提供了hel可作为nlrp3炎症小体相关疾病的潜在治疗药物。
[0033]
在本发明的一种实施方案中，本发明提供了hel在体内抑制nlrp3炎症小体的激活并防止感染性休克或hel通过靶向nlrp3炎症小体有效地减弱lps诱导的致死率的用途。
[0034]
所述感染性休克具体可为lps诱导的感染性休克。
[0035]
在本发明的一种实施方案中，本发明提供了hel预防腹膜炎的用途。所述腹膜炎具体可为msu诱导的腹膜炎。
[0036]
具体地，hel降低了msu诱导的il-1β产生，以及小鼠腹膜渗出物和中性粒细胞的数量。
[0037]
所述治疗nlrp3相关疾病的、或抑制nlrp3炎症小体激活的药物，它们包含治疗有效量的hel、药剂学上可接受的辅料，还可以包含其他起配伍协同作用的有效成分；所述的药物可以为各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等。所述药物的给药对象为哺乳动物，包括人。
[0038]
发明人发现hel是一种潜在且有效的特异性靶向nlrp3炎症小体抑制剂。我们的结果表明，hel直接与nlrp3通过碳碳双键共价结合，干扰了nlrp3和nek7之间的相互作用，从而抑制了nlrp3炎症小体的激活。此外，hel在nlrp3介导的疾病的几种小鼠模型中显示出显著的治疗效果，并且可能被开发为治疗nlrp3炎症小体相关炎症疾病的潜在候选药物。
附图说明
[0039]
图1表明helenine(hel)抑制nlrp3炎症小体激活。(a)helenine(hel)结构。(b)细胞计数试剂盒(cck-8)和celltiter-glo细胞活力检测试剂盒(celltiter-glo)用于评估用不同剂量的hel处理24小时的bmdm的生存能力。(c-l)bmdm用lps引发4小时，或thp-1用pma处理12小时贴壁，然后用hel处理1小时，最后用尼日利亚菌素刺激45分钟，全细胞裂解液(wcl)中pro-caspase-1(p45)、pro-il-1β、nlrp3和asc的蛋白质印迹分析；在bmdm/thp-1的培养上清液(sn)中激活caspase-1(p20)和il-1β(p17)的分泌(c、h)。测量了sn中的caspase-1活性(d、i)、il-1β分泌(e、j)、tnf-α分泌(g、l)和ldh释放(f、k)。考马斯亮蓝染色
用作上清液上样对照，而核纤层蛋白b(lamin b)用作裂解物上样对照。数据表示生物重复(n＝3)的平均值
±
sem。*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001和ns：不显著(单因素方差分析与dunnett’s事后检验)。
[0040]
图2表明helenine是nlrp3炎症小体的特异性抑制剂。(a、b-d)bmdm用lps引发4小时，然后用hel(5μm)处理1小时，然后用尼日利亚菌素nigericin、腺苷三磷酸atp、聚肌苷酸胞苷酸poly(i:c)或二氧化硅(sio2)刺激。全细胞裂解液(wcl)中pro-caspase-1(p45)、pro-il-1β、nlrp3和asc的蛋白质印迹分析；bmdm的培养基上清液(sn)中激活的caspase-1(p20)和il-1β(p17)的分泌，测量了sn中的caspase-1活性(b)和il-1β分泌(c)和tnf-α分泌(d)。(e、f-h)lps引发的bmdm用hel(5μm)处理1小时，然后用尼日利亚菌素刺激45分钟，聚脱氧腺苷酸poly(da:dt)或沙门氏菌刺激6小时。用hel(5μm)处理pam3csk4引发的bmdm，然后用lps转染。全细胞裂解液(wcl)中pro-caspase-1(p45)、pro-il-1β、nlrp3和asc的蛋白质印迹分析；bmdm的培养基上清液(sn)中激活的caspase-1(p20)和il-1β(p17)的分泌。测量了sn中的caspase-1活性(f)和il-1β分泌(g)和tnf-α分泌(h)。数据表示为生物重复(n＝3)的平均值
±
sem。*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001和ns：不显著(非配对t检验)。
[0041]
图3表明helenine在nlrp3炎症小体激活期间抑制asc寡聚化。(a)来自用lps刺激4小时然后用hel处理1小时或首先用hel处理1小时然后用lps刺激4小时的bmdm的细胞裂解物中蛋白质的蛋白质印迹分析。(b)使用elisa在(a)中指定的样品中测量sn中tnf-α产生。(c)lps引发的bmdm用指定剂量的hel处理1小时，然后用尼日利亚菌素刺激45分钟。triton x不溶性颗粒中交联asc的蛋白质印迹分析。(d)用hel(5μm)处理1小时，然后用尼日利亚菌素、腺苷三磷酸、聚肌苷酸胞苷酸或二氧化硅刺激lps引发的bmdm中triton x不溶性颗粒中交联的asc的蛋白质印迹分析。(e)用hel(5μm)处理1小时，然后加入尼日利亚菌素、聚脱氧腺苷酸或沙门氏菌刺激因子到lps引发的bmdm中，triton x不溶性颗粒中交联asc，最后蛋白质印迹分析。用hel(5μm)处理pam3csk4引发的bmdm，然后用clps刺激。(f)用hel(5μm)处理1小时，再用尼日利亚菌素刺激45分钟，然后用mitotracker red处理，用dapi进行封片，并用激光共聚焦显微镜观察线粒体损伤情况。数据表示为生物重复(n＝3)的平均值
±
sem。*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001和ns：不显著(单因素方差分析与dunnett’s事后检验)。
[0042]
图4表明helenine不影响mtros产生、k+流出或ca2+信号传导，但直接与nlrp3结合并抑制nek7和nlrp3之间的相互作用。(a,b)lps引发的bmdm细胞用hel处理1小时，然后用尼日利亚菌素刺激45分钟后用mitosox
tm
染色观察细胞中产生mtros的百分比。测量(a)中描述的样品的上清液中的caspase-1活性(c)。(d)用感应耦合等离子体原子发射光谱仪用于测定hel对lps引发的bmdm中尼日利亚菌素诱导的细胞中钾离子含量。(e)flipr系统用于确定hel对lps引发的bmdm中atp诱导的ca
2+
通量的影响。(f)hek-293t细胞用flag-nlrp3或flag-空载体转染，然后用不同浓度hel(5μm和10μm)处理，用抗dykddddk(flag)亲和凝胶琼脂糖珠进行免疫沉淀；(g)hek-293t细胞用flag-nlrp3或asc转染，然后用不同浓度hel(5μm和10μm)处理，用抗dykddddk(flag)亲和凝胶琼脂糖珠进行免疫沉淀。(h)hek-293t细胞用flag-nlrp3或myc-nlrp3转染，然后用不同浓度hel(5μm和10μm)处理，用抗myc标签的亲和凝胶琼脂糖珠进行免疫沉淀。使用蛋白质印迹分析下拉样品和内参。
[0043]
图5表明helenine通过其活性碳-碳双键与nlrp3结合。(a)首先合成碳碳双键破坏
的hel(r-hel)：在0℃，向含有helenine(283mg,1.22mmol,1.0equiv)的meoh(12.0ml)溶液中加入nabh4(55.2mg,1.46mmol,1.2equiv)。所得混合物在室温下搅拌2小时。混合物用h2o(30ml)淬灭，然后etoac(3
×
40ml)提取。有机层在na2so4上干燥，过滤并减压浓缩。结果通过硅胶柱色谱法提纯，提供dihydrocostunolide(r-hel,234mg,82％,白色固体)。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ5.16(d,j＝3.3hz,1h),4.80
–
4.52(m,1h),3.03(ddd,j＝9.0,5.8,3.4hz,1h),2.93
–
2.78(m,1h),2.48(td,j＝7.8,4.9hz,1h),2.10(dd,j＝14.7,3.2hz,1h),1.92
–
1.74(m,1h),1.68
–
1.36(m,5h),1.22(m,7h),1.13(d,j＝7.5hz,3h).
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ179.33,150.79,115.71,43.11,42.43,40.51,38.94,38.68,33.22,33.08,28.86,23.18,17.04,10.83。采用lps预处理bmdm细胞4小时，然后加不同浓度hel或者r-hel(2.5μm、5.0μm、10μm)，然后加入尼日利亚菌素刺激45分钟，收集细胞培养上清，用elisa的方法检测il-1β的水平(c)，用乳酸脱氢酶(ldh)测定试剂盒检测ldh的释放(d)，最后用ripa裂解细胞，取部分进行wb实验(b)。lps预处理bmdm细胞4小时，然后加不同浓度hel(2.5μm、5.0μm、10μm)，15min后进行洗脱(洗脱3次，每5min更换一次培养基)或者不洗脱，最后尼日利亚菌素(nigericin)刺激45分钟，收集细胞培养上清，用elisa的方法检测il-1β的水平(e)，用乳酸脱氢酶(ldh)测定试剂盒检测ldh的释放(f)。*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001和ns：与对照组相比不显著。
[0044]
图6表明hel在体内抑制nlrp3炎症小体激活并改善lps诱导的感染性休克。(a)用基质、hel(30mg/kg)、mcc950(40mg/kg)或hel(30mg/kg)+mcc950(40mg/kg)预处理小鼠，然后用lps(20mg/kg)腹腔注射，观察预处理小鼠的存活率；监测小鼠存活72小时(n＝10)。(b-g)用基质、hel(15mg/kg，30mg/kg)、mcc950(40mg/kg)或hel(30mg/kg)+mcc950(40mg/kg)预处理小鼠，然后腹腔注射lps(20mg/kg)并处理3小时。使用elisa测量血清和腹膜灌洗液中il-1β(b，d)和tnf-α(c，e)的水平。使用流式细胞仪定量腹膜渗出细胞(pec)(f)和巨噬细胞(f4/80+)(g)(n＝8)。数据表示为平均值
±
sem。差异的显着性使用对数秩检验(a)、单因素方差分析与sidak事后检验(b-g)进行分析。*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001和ns：与对照组相比不显著。
[0045]
图7表明hel抑制nlrp3依赖性腹膜炎。(a)小鼠用hel或mcc950预处理1小时，然后腹腔注射msu(50mg/kg)治疗6小时(n＝6)。使用elisa测量血清(a)和腹膜灌洗液(b)中的il-1β水平；血清(c)和腹膜灌洗液(d)中的il-6水平；血清(e)和腹膜灌洗液(f)中的il-18水平；血清(g)和腹膜灌洗液(h)中的tnf-α水平。数据表示为平均值
±
sem。*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001和ns：与对照组相比不显著(单因素方差分析与sidak事后检验)。
具体实施方式
[0046]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0047]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048]
材料和方法
[0049]
实验设计
[0050]
本研究主要评价hel对nlrp3炎症小体介导的疾病的治疗效果，并探讨其抑制nlrp3炎症小体的机制。hel对小鼠bmdm和thp-1中nlrp3炎症小体活化的影响及其潜在作用机制。通过采用免疫印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)和免疫共沉淀方法，评估hel治疗nlrp3炎症小体介导的疾病小鼠模型效果。
[0051]
老鼠
[0052]
八周龄c57bl/6小鼠购自spf生物技术有限公司(中国北京)。研究人员对动物实验不知情，随机选择小鼠并分组，将它们安置在特定无菌设施中(12小时/12小时光/暗循环；20
±
2℃)。所有动物实验均经中国人民解放军总医院第五医学中心实验动物福利与伦理委员会批准。
[0053]
试剂
[0054]
mouse il-1βprecoated elisa kit试剂盒(达科为生物技术有限公司，1210122)，mouse tnf-αprecoated elisa kit试剂盒(达科为生物技术有限公司，1217202)，human il-1β(达科为生物技术有限公司，1110122)，human tnf-α(达科为生物技术有限公司，1117202)，ldh检测试剂盒(promega，g1780)，cell counting kit-8(cck-8)试剂盒(medchemexpress，hy-k0301)，牛血清白蛋白(scientific chemical，9048-46-8)，尼日利亚菌素(nigericin sodium salt，medchemexpress，83805)，三磷酸腺苷(atp，sigma，a2383)，msu(invivogen，tlrl-msu)，聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly(i:c)，invivogen，tlrl-picw)，三酰脂肽(pam3csk4，invivogen，tlrl-pms)，沙门氏菌(salmonella，由军事科学院军事医学研究院李涛博士赠送)，聚脱氧腺苷酸-聚胸苷酸(poly(da:dt)，invivogen，tlrl-patn)，转染试剂lipofectamine 2000(invitrogen，11668-019)，phorbol 12-myristate 13-acetate(pma，invivogen，tlrl-pma)，脂多糖(lps，lipopolysaccharide，invivogen，tlrl-3pelps)，dmem培养基(macgene，k2005200)，rpmi 1640培养基(roswell park memorial institute，macgene，k1706200)，胎牛血清(fetal bovine serum，viva cell，2117119)，小鼠集落刺激因子(murine macrophage colony-stimulating factor，medchemexpress，hy-p7085)，双琥珀酰亚胺辛二酸酯(disuccinimidyl suberate，abcam，apn12638-1-1)，红色线粒体超氧化物荧光探针(mitosox red mitochondrial superoxide indicator，ex/em：510/580nm，invitrogen，2311845)。
[0055]
anti-mouse caspase-1(adipogen，ag-20b-0042，1:1000)，anti-mouse cleaved il-1β(r&d systems，af-401-na，1:2000)，anti-nlrp3(adipogen，ag-20b-0014，1:1000)，anti-asc(cell signaling technology，d2w8u，1:1000)，anti-lamin b(proteintech，66095-1-ig，1:1500)，anti-human caspase-1(cell signaling technology，4199s，1:2000)，anti-human cleaved il-1β(cell signaling technology，12703，1:1000)，anti-rat igg(cell signaling technology，7077s，1:3000)，anti-mouse igg(jackson immunoresearch，115-035-003，1:5000)，anti-rabbit igg(jackson immunoresearch，111-035-003，1:5000)，gout anti rabbit igg alexa488(金普来，01101，1:500)，hoechst(cell signaling technology，33342，1:10000)。
[0056]
细胞培养和激活
[0057]
取10-12周龄的雄性c57bl/6小鼠分离出骨髓巨噬细胞(bmdm)，在dmem培养基(含
10％胎牛血清、1％双抗)中培养，并加入25ng/ml小鼠集落刺激因子(mouse colony stimulating factor,mcsf)。经过12小时贴壁后的bmdm通过换液的方式加入含有50ng/ml lps或400ng/ml pam3csk4(用于非经典炎症小体激活)预处理4小时。接着用hel处理细胞1小时，空白孔及对照孔给予含相同含量dmso的opti-mem培养基，1小时后除空白孔外，其余孔中补加炎症小体不同刺激因子，10μm尼日利亚菌素45分钟；5mm atp 1小时；200μg/ml msu或200ng/ml沙门氏菌6小时；使用2000(11668-019,invitrogen(california,usa))转染2μg/ml聚(i:c)、1μg/ml超纯lps或2μg/ml聚(da:dt)刺激bmdm 6小时。
[0058]
thp-1细胞传代时轻轻吸取含thp-1细胞的上层培养基，750rpm室温离心5分钟后弃去上层清液，细胞沉淀加入rpmi 1640培养基混匀后放置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。待细胞密度达到95％时进行种板，种板时加入终浓度为100nmol/l的pma使其贴壁并分化成巨噬细胞，以1.5
×
106cells/ml的密度接种24孔板，每孔0.5ml体积，以1.5
×
106cells/ml的密度接种12孔板，每孔1ml体积，经6小时以上贴壁后用hel处理细胞1小时，然后用10μm尼日利亚菌素刺激45分钟。
[0059]
免疫沉淀
[0060]
hek-293t细胞经检测无支原体，液氮冷冻，复苏后在dmem培养基中培养。hek-293t细胞生长至90％以上密度时，按3
×
105cells/ml的密度种6孔板。过夜贴壁后，进行标签蛋白的质粒flag标签的质粒(flag-vector，flag-nlrp3)转染24小时，然后用hel处理6小时。弃去上清，向每孔中加入预冷的np40裂解液((ph7.4、150mm nacl、50mm tris、2mm edta、0.5％nonidet p-40)和完全蛋白酶抑制剂(1
×
edta-free roche蛋白酶抑制剂混合物，targetmol，c0001)，利用细胞刮板刮取细胞，全程在冰上操作，将液体收集，4℃离心机12000rpm离心10分钟。吸取上清，取适当细胞裂解液加入sds 30μl，作为input。105℃金属浴煮样15分钟后western blot检测。剩下裂解液用于免疫共沉淀实验。取抗dykddddk标签抗体与蛋白a/g plus-琼脂糖在4℃下孵育的琼脂糖珠子，加入适当裂解液，清洗一次，离心后取5μl珠子加入每份样品中，4℃旋转6小时。用np40裂解液(含蛋白酶抑制剂100
×
)清洗4次，4℃离心机750g离心2分钟后弃去上清，加入的1
×
loading np40 buffer，105℃金属浴煮样15分钟后western blot检测蛋白表达。
[0061]
caspase-1活性测定
[0062]
将caspase-1(caspase-1inflammasome assay)活性检测试剂盒平衡至室温后，按照说明书要求配制工作液。在384孔白色细胞培养板中加入20μl细胞上清液和10μl工作液后混匀室温放置1h。微孔板多功能检测仪检测caspase-1荧光值。
[0063]
ldh测定
[0064]
根据制造商的说明，我们使用cytotox1non-radioactive cytotoxicity assay来评估细胞分泌到上清液中的ldh量。
[0065]
细胞活力检测
[0066]
我们使用cell counting kit 8(cck-8)来确定细胞活力。bmdm按1
×
106cells/ml的细胞密度接种于96孔板，以每孔100μl体积液体种板。待细胞贴壁过夜后，用dmem培养基配制不同浓度的hel处理细胞，并设置不含细胞的空白孔。药物处理后，吸掉各孔中的培养基，按cck8试剂：dmem完全培养基＝1：9的比例配制cck8溶液，每孔加入cck8溶液，放入co2
培养箱中孵育30-60分钟，酶标仪450nm波长处检测各孔吸光度值。细胞活力计算方法参照说明书相关内容。
[0067]
asc寡聚化分析
[0068]
bmdm细胞，经12小时过夜贴壁后先用50ng/ml lps处理4小时，然后给药hel处理1小时，然后加入不同的炎症小体刺激因子。刺激时间结束后，弃去上清，向每孔中加入triton buffer溶液(0.5％triton x-100、50mm tris-hcl、150mm nacl)(含蛋白酶抑制剂)，放在冰上裂解细胞，15分钟后，刮下细胞放入1.5mlep管中。将细胞裂解液置于4℃离心机，6000g离心15分钟。离心后留取下层细胞裂解液，加入500μl pbs清洗沉淀，将其置于4℃离心机，6000g离心15分钟。用200μl的pbs重悬沉淀，加入为200mm的硫酸二琥珀酰亚胺(dss)，使其终浓度为4mm。涡旋后，37℃金属浴孵育30分钟。每10分钟轻轻涡旋一次。4℃离心机12000rpm离心10分钟，弃去上清后加入60μl的1
×
loading triton buffer。金属浴105℃煮样15分钟，western blot检测asc寡聚化的表达情况。
[0069]
酶联免疫吸附试验
[0070]
根据制造商的说明，使用elisa试剂盒(r&d systems；南京建成生物工程研究所，中国)测定细胞培养基上清液或血清中的细胞因子il-1β、tnf-α、il-6、il-18。
[0071]
蛋白质印迹(western blot)检测
[0072]
检测上清中il-1β(p17)、caspase-1(p20)蛋白表达水平，检测细胞裂解液中nlrp3、nek7、asc、pro-caspase-1、pro-il-1β、gapdh、laminb蛋白水平。
[0073]
先制备聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)放入电泳槽中，接通电源后加入样品，采用用80v恒压电泳，待蛋白marker出现之后(或者样品到达浓缩胶和分离胶分界面之后)将电泳仪电压调成135v继续电泳。待样品电泳至分离胶底部时，待电泳结束后，细胞上清样品从蛋白marker分子量45kda处裁开分离胶，分子量45kda以上分离胶放入考马斯亮蓝中进行考染，脱色液(水：甲醇：乙酸＝5：4：1)，至背景蓝色脱透明；分子量45kda以下分离胶进行转膜。把切割好的胶和预处理好的pvdf膜放入标有正、负极的转膜夹板中，把转膜缓冲液倒入转移电泳槽中，并置入转膜夹板。置于冰上进行转膜(注意电极正负)。上清样品转膜电流450ma，转膜时间2.5小时；细胞裂解液样品转膜电流450ma，转膜时间3.5小时。转膜结束后小心取出将pvdf膜放入封闭液中，放在摇床上室温封闭1小时后用1
×
tbst将封闭液清洗干净。将pvdf膜放在配制好的一抗溶液中摇床4℃孵育过夜。次日取出放入室温摇床上，一抗回收4℃冰箱保存反复使用，pvdf膜用1
×
tbst洗三次，每次5分钟。根据一抗的抗原加入合适的二抗溶液，室温摇床孵育1小时。二抗孵育结束后，二抗回收4℃冰箱，pvdf膜用1
×
tbst洗三次，每次5分钟。洗膜结束后在pvdf膜上加入适量的含辣根过氧化物的化学发光底物，置于暗夹中暗室显影。
[0074]
细胞内k
+
测量
[0075]
为了确定细胞内k
+
浓度，首先将bmdm按种12孔细胞培养板，经过12小时过夜贴壁，然后用50ng/ml lps处理4小时。然后将细胞用hel处理1小时，并用尼日利亚菌素刺激45分钟。刺激结束之后，弃去培养上清，用生理盐水清洗两次，然后加入200μl的浓hno3裂解细胞，放振荡仪振荡20分钟后吸取液体至1.5ml ep管中。放入金属浴中，100℃加热煮干液体，加入5ml双蒸水溶解，用感应耦合等离子体原子发射光谱仪(icp-ms)测定细胞中钾离子的含量。
[0076]
细胞内ca
2+
测量
[0077]
将bmdm按2.5
×
104cells/ml密度种384孔黑壁底透的细胞板中，每孔25μl，然后置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养过夜。然后用lps处理4小时，加入或没加入hel处理1小时，然后用atp刺激1小时，刺激结束后每孔加入25μl flipr钙6检测试剂染料，在37℃、5％co2的细胞培养箱中孵育2小时。然后用fliprt tetra高通量实时荧光检测分析系统(molecular devices，美国)测量细胞内钙离子的含量。
[0078]
线粒体活性氧(mtros)释放测定
[0079]
将bmdm细胞按1.2
×
106cells/ml种在10cm中皿中，每皿10ml，过夜贴壁。给予lps处理后放入co2培养箱中预处理细胞4小时。然后加入配制好的消化液1ml(2.5％胰酶：edta联合＝2:1)进行消化，37℃孵箱消化3-4分钟后加入dmem终止消化。经750rpm离心5分钟，弃上清加入opti-mem重悬，并将细胞分配到1.5ml ep管中。将ep管3500rpm室温离心5分钟，弃上清后，加入或不加入hel处理，放入孵箱孵育1小时，再给予刺激因子尼日尼亚菌素。刺激结束后，ep管经3500rpm离心5分钟之后弃去上清，并用hbss(含0.5％fbs)清洗1次。ep管经3500rpm离心5分钟之后弃去上清，除空白管外，每个ep管加入4μm的mitosox red mitochondrial superoxide indicator(ex/em:510/580nm)，放入孵箱孵育5-15分钟。染色结束后用hbss清洗1次，每管加入200μl pbs后流式细胞仪(bd biosciences，美国)监测mtros的产生。
[0080]
线粒体损伤
[0081]
将线粒体染色的小鼠bmdm按5
×
105cells/ml密度种板至放有细胞爬片的24孔板中，每孔加入0.5ml液体，经12小时过夜贴壁。然后用lps处理4小时，加入或没加入hel处理1小时，然后用尼日尼亚菌素刺激45分钟。刺激结束后丢弃上清液，用经37℃温浴后的pbs清洗两次后加入4％的多聚甲醛进行固定，在室温放置20分钟。丢弃上清液，用pbs清洗，放室温摇床，清洗两次，每次5分钟。用dapi进行封片，并用激光共聚焦显微镜观察线粒体损伤情况。
[0082]
lps引起的感染性休克
[0083]
对于感染性休克模型，将8周龄c57bl/6雄性小鼠随机分为4组，每组10只。先腹腔注射基质(5％dmso、5％tween 80和生理盐水)、mcc950(40mg/kg)或hel(30mg/kg)或mcc950(40mg/kg)+hel(30mg/kg)，1小时后腹腔注射lps(20mg/kg)(o55：b5；sigma-aldrich)，观察并记录每组小鼠死亡情况。
[0084]
为检测感染性休克模型小鼠中炎症因子与腹腔巨噬细胞的变化，c57bl/6雄性小鼠随机分为6组，每组6只,先腹腔注射基质(5％dmso、5％tween 80和生理盐水)、mcc950(40mg/kg)或hel(15mg/kg)或hel(30mg/kg)或mcc950(40mg/kg)+hel(30mg/kg),1小时后腹腔注射lps(20mg/kg)或生理盐水，3小时后小鼠眼眶取血，静置半小时后，常温3500rpm离心10分钟后吸取血清，-80℃保存备用。用8ml pbs冲洗腹腔，收集腹腔灌洗液，细胞计数器用于测量腹膜灌洗液中腹膜渗出细胞的数量，并通过流式细胞仪分析腹腔液中单核巨噬细胞(f4/80细胞)数量。elisa法检测血清和腹膜灌洗液中的il-1β与tnf-α的水平。
[0085]
msu诱导的体内腹膜炎模型
[0086]
对于腹膜炎模型，将8周龄c57bl/6雄性小鼠随机分为4组。为检测感染性休克模型小鼠中炎症因子与腹腔巨噬细胞的变化，c57bl/6雄性小鼠随机分为5组，每组6只,先腹腔
注射基质(5％dmso、5％tween 80和生理盐水)、mcc950(40mg/kg)或hel(30mg/kg)或mcc950(40mg/kg)+hel(30mg/kg),1小时后然后腹腔注射msu晶体(50mg/kg，溶解在1
×
pbs)，6小时后小鼠眼眶取血，静置半小时后，常温3500rpm离心10分钟后吸取血清，-80℃保存备用。用8ml pbs冲洗腹腔，收集腹腔灌洗液，细胞计数器用于测量腹膜灌洗液中腹膜渗出细胞的数量。elisa法检测血清和腹膜灌洗液中的il-1β、il-18、il-6与tnf-α的水平。
[0087]
统计分析
[0088]
所有实验设计均为随机化和盲法。数据分析采用graphpad prism(prism6)软件或office excel进行作图。所有实验结果均以均值
±
标准误差(sem)表示。两组间比较：先检验统计资料是否符合正态分布，并进行方差齐性检验，随后采用双尾独立样本t检验比较两组间数据是否具有显著性差异。多组间比较：采用多组单因素anova方差分析。结果以p《0.05认为有显著性差异。
[0089]
实施例1hel抑制nlrp3炎症小体的激活
[0090]
为了避免因其毒性而减弱炎症小体的活性，首先我们评估了hel在bmdm中24小时的细胞毒性(图1b)。我们观察到在bmdm中hel的剂量低于20μm时，细胞活力没有表现出任何细胞毒性(图1b)。接下来，为了研究hel是否能抑制nlrp3炎症小体，我们测试了其对caspase-1激活和il-1β分泌的影响。在刺激因子的影响下，nlrp3的激活导致asc和原caspase-1的招募，并导致原caspase-1裂解为具有生物活性的caspase-1。裂解的caspase-1将原il-1β裂解为其活性形式，即成熟的il-1β，然后释放到细胞外环境中。在lps刺激的bmdm中，hel对caspase-1p20、il-1β的分泌和ldh的释放表现出呈剂量依赖性的抑制作用(图1c-f)，但对肿瘤坏死因子-α(tnf-α)没有影响(图1g)。同样，在pma预处理的thp-1中，hel对caspase-1p20、il-1β的分泌和ldh的释放表现出呈剂量依赖性的抑制作用(图1h-k)，但对肿瘤坏死因子-α(tnf-α)没有影响(图1l)。
[0091]
hel也阻断了尼日尼亚菌素诱导的pma刺激的thp-1中nlrp3炎症小体的激活。总之，在nlrp3炎症小体激活过程中，hel以剂量依赖的方式抑制了诱导的caspase-1激活、il-1β分泌和ldh释放(图1h-k)，但并不影响tnf-α的产生(图1l)。
[0092]
实施例2hel抑制经典和非经典nlrp3炎症小体的活性
[0093]
鉴于nlrp3炎症小体激动剂的种类繁多，我们评估了hel是否能抑制诱导nlrp3炎症小体激活的多种激动剂。如图所示，用hel处理也能抑制其他nlrp3激动剂(包括atp、sio2或poly(i：c))刺激的caspase-1激活和il-β释放(图2a、b、c)，但对tnf-a水平没有影响(图2d)。除了典型的nlrp3炎症小体，nlrp3炎症小体的非典型激活是在caspase-11识别细胞膜lps后启动的。随后，我们测试了hel影响非经典nlrp3炎症小体。如图2e-h所示，细胞膜lps可以激活非经典的nlrp3炎症小体途径。我们的结果表明，hel是一种有效的、广泛的抑制剂，可以通过典型和非典型途径激活bmdm的nlrp3炎症小体。
[0094]
实施例3hel抑制nlrp3炎症小体依赖的asc寡聚化
[0095]
除了nlrp3炎症小体，还有其他炎症小体，如aim2和nlrc4炎症小体。然后，我们对hel进行检测，以确定它是否以aim2依赖或nlrc4依赖的方式触发炎症小体的激活，这也可以调节caspase-1激活和il-1β分泌。lps预处理的bmdm被沙门氏菌感染以激活nlrc4炎症小体，或者dsdna类似物聚(da:dt)与aim2结合导致aim2炎症小体的激活。hel没有抑制aim2或nlrc4炎症小体介导的caspase-1激活和上清液中il-1β的释放(图2f,g)，以及细胞裂解液
中pro-caspase-1或pro-il-1β水平(图2e)。这些结果表明，hel是一种专门针对nlrp3炎症小体的抑制剂。
[0096]
为了研究hel是否通过抑制nf-κb信号来抑制pro-caspase-1的前体蛋白表达以抑制nlrp3炎症小体的激活，我们比较了lps给药前后的蛋白表达水平。在hel给药前用lps预处理，western blot结果显示nlrp3、pro-il-1β、caspase-1p45蛋白表达水平(图3a)。hel给药后再用lps预处理，pro-il-1β蛋白表达没有变化(图3a)。elisa结果表明，本研究中的任何一种给药方式都不影响tnf-α分泌(图3b)。炎症激活系统是在lps处理后给药的情况下进行的。因此，如图所示，hel不通过影响前体蛋白pro-il-1β和caspase-1p45的表达来抑制nlrp3炎症小体激活。
[0097]
一旦被激活，nlrp3与asc适配体结合，招募原caspase-1蛋白，形成nlrp3炎症小体复合物。因此，nlrp3与asc分子结合并引发asc寡聚，这是激活nlrp3炎症小体的关键。这些结果表明，hel抑制作用发生在asc寡聚化的上游和/或通过抑制asc本身来抑制nlrp3炎症小体的激活(图3c)。hel可以抑制尼日尼亚菌素、atp、sio2、poly(i:c)、pam3csk4和clps诱导的asc寡聚，但对poly(da:dt)和沙门氏菌诱导的asc寡聚没有影响(图3d-e)。
[0098]
实施例4hel不影响k+通道的激活，或ca2+信号或mtros的产生，但通过阻断nek7-nlrp3的相互作用抑制nlrp3炎症小体的组装
[0099]
线粒体损伤和mtros在nlpr3炎症小体激活上游过程中起着至关重要的作用，也是一条重要的上游信号通路。我们探讨了hel是否对线粒体损伤和mtros的产生有影响。结果显示，与对照组相比，加入尼日尼亚菌素后处理组的mtros产生明显增强，线粒体发生了明显的损伤。然而，hel处理组中mtros的产生(图4a-c)和线粒体损伤无变化(图3f)。结合上述结果，hel不影响nlrp3炎症小体激活的线粒体损伤和mtros。
[0100]
除线粒体损伤和mtros外，离子流在nlrp3炎症小体的激活中也起着重要作用。k
+
外流和ca
2+
流入也是nlrp3炎症小体上游激活信号。加入尼日尼亚菌素后，细胞内k
+
明显减少，这表明hel在nlrp3炎症小体激活过程中不影响k
+
外流(图4d)。加入尼日尼亚菌素后，ca
2+
流入量随时间推移有动态变化，但加入hel后，ca
2+
离子流入量与尼日尼亚菌素组相比没有明显变化(图4e)。综上所述，hel没有通过调节k
+
离子外流和ca
2+
离子流入来激活nlrp3炎症小体。
[0101]
实施例5hel通过活性碳-碳双键影响nlrp3炎症小体组装
[0102]
既然hel对nlrp3炎症小体激活的上游信号没有影响，那么它是否直接影响炎症小体的组装？在nlrp3炎症小体组装过程中，nima相关激酶7(nek7)与nlrp3相互作用并介导nlrp3低聚体和nlrp3-asc相互作用，这对促进nlrp3炎症小体的激活是非常重要的。我们测试了hel是否影响外源蛋白的相互作用，如nek7-nlpr3、nlrp3-nlrp3或nlrp3-asc。结果显示，在质粒转染的293t细胞中，nek7和nlrp3之间存在相互作用，而hel在给药后以剂量依赖方式抑制nek7-nlrp3相互作用(图4f)。使用抗flag珠子对表达asc或myc-nlrp3的293t细胞进行外源性免疫沉淀。结果显示，nlrp3与asc或nlrp3相互作用，这种相互作用在hel给药后不能被抑制(图4g，h)。因此，相比之下，在293t过表达系统中，hel只影响nlrp3-nek7相互作用，但不影响nlrp3与nlrp3或asc的相互作用。上述研究结果表明，hel影响nlrp3炎症小体的组装。
[0103]
首先，我们分析hel与nlrp3的结合模式。当hel与nlrp3不可逆结合时，洗脱后仍有
抑制作用；如果是可逆结合，洗脱后就没有抑制作用。实验结果表明，hel在洗脱实验后仍能抑制nlrp3的炎症激活，与未洗脱时相同，说明hel与nlrp3的结合方式是不可逆的(图5e、f)。然后，我们研究了hel碳-碳双键在与nlrp3结合过程中的作用。我们研究了合成的碳碳双键断裂单体r-hel(r-hel)(图5a)是否能抑制nlrp3的激活。结果显示，r-hel不能抑制nlrp3炎症的激活(图5b-d)，说明hel与nlrp3的相互作用及其对nlrp3炎症小体激活的抑制是依赖于碳碳双键功能团。
[0104]
实施例6hel抑制小鼠免受lps诱导的败血症休克影响
[0105]
败血症休克是一种致命的疾病，是败血症最严重的并发症之一。建立腹腔注射lps诱导败血症休克小鼠模型。lps诱导的败血症休克是一种常见的nlrp3炎症介导的疾病模型，导致败血症休克期间腹膜单核巨噬细胞、中性粒细胞浸润、血清il-1β和tnf-α增加。用nlrp3炎症小体抑制剂mcc950治疗被用来模拟nlrp3炎症小体敲除。结果显示，mcc950明显提高了小鼠的存活率，表明nlrp3炎症在该模型中发挥了重要作用(图6a)。
[0106]
从右移的生存曲线可以看出，hel和mcc950对lps诱导的小鼠败血症休克有明显的保护作用。此外，hel和mcc950具有相同的药理作用，两者之间的差异并不明显。hel与mcc950联合给药并没有比hel或mcc950更能延长败血症休克模型的存活时间，这表明hel主要通过靶向抑制nlrp3炎症小体来延迟死亡的发生。由于炎症细胞因子通常伴随着败血症休克，我们研究了hel是否会影响这一过程中炎症细胞因子的释放。结果显示，hel明显降低了模型小鼠血清和腹腔灌洗液中的il-1β水平(图6b、d)，并减少了腹腔中性粒细胞和巨噬细胞的数量(图6f、g)，但未影响小鼠血清和腹腔灌洗液中的tnf-α水平(图6c、e)。综上所述，hel通过抑制nlrp3炎症小体明显改善了小鼠败血症模型生存率。
[0107]
实施例7hel调控nlrp3炎症小体依赖性腹膜炎
[0108]
msu诱导的腹膜炎是一种典型的nlrp3相关急性疾病模型。在腹膜炎的发展过程中，它导致血清、腹腔灌洗液中il-1β的分泌和腹腔灌洗液中中性粒细胞数量的增加。nlrp3的缺陷或抑制nlrp3的激活可能抑制il-1β的分泌和中性粒细胞的浸润。我们使用mcc950作为nlrp3炎症抑制剂来模拟nlrp3基因敲除小鼠，并与hel联合给药。通过这种方式，我们评估了hel在msu诱导的腹膜炎中作用。结果发现，腹腔注射msu明显诱导血清中il-1β的分泌增加，以及腹腔灌洗液中il-1β、il-6、il-18和tnf-α的增加。在注射msu前一小时注射hel，它能显著减少msu引起的腹膜炎，表现为血清il-1β(图7a)和腹腔灌洗液il-1β、il-6、il-18和tnf-α(图7b、d、f、h)的减少。这些结果表明，hel通过抑制nlrp3炎症小体来调控msu诱导的腹膜炎。
[0109]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.土木香内酯在制备如下产品中的应用：1)nlrp3炎症小体抑制剂；2)nlrp3炎症小体特异性抑制剂；3)预防和/或治疗nlrp3介导的相关疾病的药物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：3)中，nlrp3介导的相关疾病，所述疾病为炎症性疾病。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述炎症性疾病包括：痛风、神经退行性疾病、肠炎、感染性炎症性疾病、感染休克、溃疡性结肠炎、神经性疾病及脑损伤、2型糖尿病、冷热蛋白相关周期性综合征、动脉粥样硬化或非酒精性肝炎。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述炎症性疾病为感染性休克或腹膜炎。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为制备具有如下至少一种功能的药物中的应用：1’)抑制经典和非经典nlrp3激活；2’)阻断nlrp3依赖的asc寡聚化；3’)抑制nek7-nlrp3相互作用；4’)特异性地抑制nlrp3炎症小体。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：1’)中，所述经典nlrp3激活指经典nlrp3炎症小体激动剂诱导的caspase-1激活和il-1β分泌，其中所述经典nlrp3炎症小体激动剂包括尼日利亚菌素、atp、poly(i:c)和sio2；所述非经典nlrp3激活指非经典nlrp3炎症小体激活，即抑制pam3csk4引发的bmdm中lps转染诱导的caspase-1裂解和il-1β分泌。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：3’)中，hel通过碳碳双键与nlrp3共价结合从而抑制nek7-nlrp3相互作用。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：4’)中，特异性抑制nlrp3炎症小体指hel特异性抑制nlrp3炎症小体介导的caspase-1的裂解和il-1β的分泌；hel不抑制aim2或nlrc4介导的caspase-1激活和il-1β分泌。

技术总结
本发明公开了土木香内酯在制备预防和治疗NLRP3介导的疾病的药物中的应用。所述疾病包括但不限于：痛风、神经退行性疾病、肠炎、感染性炎症性疾病、感染休克、溃疡性结肠炎、神经性疾病及脑损伤、2型糖尿病、冷热蛋白相关周期性综合征、动脉粥样硬化或非酒精性肝炎。发明人发现Hel是一种潜在且有效的特异性靶向NLRP3炎症小体抑制剂。Hel直接与NLRP3通过碳碳双键共价结合，干扰了NLRP3和NEK7之间的相互作用，从而抑制了NLRP3炎症小体的激活。此外，Hel在NLRP3介导的疾病的几种小鼠模型中显示出显著的治疗效果，并且可能被开发为治疗NLRP3炎症小体相关炎症疾病的潜在候选药物。NLRP3炎症小体相关炎症疾病的潜在候选药物。


技术研发人员：权利要求书1页说明书12页附图7页
受保护的技术使用者：重庆市中医院
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/9/12