一种基于改性壳聚糖共价固定化右旋糖酐酶的应用

1.本发明属于多糖固定化酶制备技术领域，尤其是一种固定化酶的制备方法。


背景技术：

2.在食品加工和生物技术当中，已知酶、产生酶的微生物、细胞和一些细胞组分可以固定到某些载体，特别是当他们用作生物催化剂时，这个过程一般称为固定化。
3.右旋糖酐酶是一类由微生物发酵生产的水解右旋糖酐的酶，属于糖酐水解酶，它可以专一性的水解右旋糖酐分子中的α-1，6糖苷键，从而降低右旋糖酐的分子量。右旋糖酐酶存在多种微生物当中，不同的微生物来源的右旋糖酐酶的酶学性质各有差异，酶活容易受到外界环境(如温度、ph等)的影响，并且随着保存时间和反应时间的延长而缩短，由于游离的右旋糖酐酶在应用过程中存在稳定性差、不可重复使用、难与目标产品分离的问题，限制了其在食品工业中的应用。因此有必要对右旋糖酐酶进行固定化。
4.壳聚糖是一是天然多糖甲壳素经过脱除部分乙酰基的产物，化学名称为β-(1，4)-2-氨基-2-脱氧-d-葡萄糖(β-(1，4)-2-amino-2-deoxy-d-glucose)，具有生物相容性、无毒性等优点，其分子链上分布有大量的羟基和游离氨基，因此可以被开发为抗原、抗体、酶等生理活性物质的固定化载体。
5.在现有的固定化酶制备技术当中，主要有吸附法、包埋法、交联和共价结合法。
6.本发明利用中和滴定法制备制备壳聚糖小球(cs)，再通过京尼平(genipin))和壳聚糖小球的交联反应制备得到改性的壳聚糖小球(cs-gn)，使用改性的壳聚糖小球和右旋糖酐酶反应得到固定化右旋糖酐酶。


技术实现要素：

7.本发明以壳聚糖为基质，中和滴定法制备出壳聚糖小球，再以京尼平作为交联改性剂，使壳聚糖小球进一步交联，制备得到具有稳定性强、不溶于酸、安全无毒的改性壳聚糖小球，并对右旋糖酐酶进行固定化应用。
8.本发明为实现上述目的，提供的方案如下：
9.(1)制备壳聚糖小球(cs)：取4g壳聚糖粉末溶解于2％乙酸溶液中，并置于磁力搅拌器中搅拌溶解完全，得到壳聚糖溶液，超声40min除去气泡，使用使用0.45
×
15mm的针管将壳聚糖溶液滴加到1m的naoh和无水乙醇体积比为4∶1的凝结液当中，凝固2h，用纯水冲洗至壳聚糖小球ph为中性，使用布式漏斗抽滤除去壳聚糖小球的表面水分，得到壳聚糖小球4℃保存冰箱备用；
10.(2)制备京尼平交联壳聚糖小球(cs-gn)：把制备好的cs置于0.6％的京尼平溶液中，在75℃水浴下反应2～6h，；反应完成后用ph＝5，0.02m的醋酸钠缓冲溶液清洗至无京尼平残留，使用布式漏斗抽滤除去cs-gn的残留的醋酸钠缓冲溶液，得到京尼平交联壳聚糖小球；
11.(3)制备固定化右旋糖酐酶(cs-gn-dex)：配制右旋糖酐酶溶液，将cs-gn置于溶液
中，在4℃和100rpm的摇床中固定化10h，反应完成后用ph＝5，0.02m的醋酸钠缓冲溶液清洗掉未固定的右旋糖酐酶，即得到cs-gn-dex。
12.1、优选的：步骤(1)所述的壳聚糖粉末的脱乙酰度≥95％。
13.2、优选的：步骤(1)所述的壳聚糖的乙酸溶液中壳聚糖与水的质量比为2∶49。
14.3、具体的：步骤(2)所述的0.6％京尼平溶液体积为6ml。
15.4、优选的：步骤(2)所述的配制京尼平的溶液为ph＝7的醋酸钠缓冲溶液。
16.5、优选的：步骤(2)所述的水浴反应时间为4h。
17.6、具体的：步骤(3)所述的酶溶液为2ml 34u/ml的右旋糖酐酶溶液。
18.7、具体的：步骤(3)所述的所用右旋糖酐酶的储存在ph＝5，0.02m的醋酸钠缓冲溶液。
19.8、优选的：步骤(3)所述的固定化温度为4℃。
20.9、优选的：步骤(3)所述的固定化转速为100rpm。
21.10、优选的：步骤(3)所述的固定化时间为10h。
22.本发明制备得到的固定化右旋糖酐酶的壳聚糖小球大小均一，具有良好的机械性能，同时保留了壳聚糖原有的特性，拥有较高的生物安全性；重复使用性强，可用于生物医药和食品加工行业中低分子量右旋糖酐的生产。
附图说明
23.图1为cs、cs-gn和cs-gn-edex表面的sem图；
24.图2为cs、cs-gn和cs-gn-edex的傅里叶变换红外(ftir)分析图；
25.图3为cs、cs-gn和cs-gn-edex的热重分析图；
具体实施方式
26.以下结合实例对本发明进行进一步描述：
27.实施例1
28.一种壳聚糖小球固定化右旋糖酐酶的制备方法，包括以下步骤：
29.(1)制备壳聚糖小球(cs)：取4g壳聚糖粉末溶解于含有2％乙酸的100ml水溶液中，并置于磁力搅拌器中搅拌溶解完全，得到壳聚糖溶液，超声40min除去气泡，使用0.45
×
15mm的针管将壳聚糖溶液滴加到1m的naoh和无水乙醇体积比为4∶1的凝结液当中，凝固2h，用纯水冲洗至壳聚糖小球ph为中性，使用布式漏斗抽滤除去壳聚糖小球的表面水分，得到cs，4℃保存冰箱备用；
30.(2)制备京尼平交联壳聚糖小球(cs-gn)：把制备好的cs置于6ml用ph＝7的醋酸钠缓冲溶液配制的0.6％的京尼平溶液中，加热至75℃反应4h，反应完成后用ph＝5，0.02m的醋酸钠缓冲溶液清洗至无京尼平残留，使用布式漏斗抽滤除去cs-gn的残留的醋酸钠缓冲溶液，得到cs-gn；
31.(3)制备固定化右旋糖酐酶的壳聚糖小球(cs-gn-edex)：配制右旋糖酐酶溶液，将cs-gn置于溶液中，在4℃和100rpm的摇床中固定化10h，反应完成后用ph＝5，0.02m的醋酸钠缓冲溶液清洗掉未固定的右旋糖酐酶，即得到cs-gn-dex。
32.实施例2
33.与实施例1的区别是，步骤(1)中的壳聚糖质量为5g，其余参数条件和操作步骤均相同。
34.实施例3
35.与实施例1的区别是，步骤(2)中的京尼平浓度为0.2％、0.3％，0.4％、0.5％和0.7％，其余参数条件和操作步骤均相同。
36.实施例4
37.与实施例1的区别是，步骤(2)中的反应温度为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃和85℃，其余参数条件和操作步骤均相同。
38.实施例5
39.与实施例1的区别是，步骤(2)中的反应时间为2h、3h、5h和6h，其余参数条件和操作步骤均相同。
40.实施例6
41.与实施例1的区别是，步骤(3)中的固定化温度为9℃、14℃、19℃和24℃，其余参数条件和操作步骤均相同。
42.实施例7
43.与实施例1的区别是，步骤(3)中的固定化摇床转速为80rpm、120rpm、140rpm、160rpm，其余参数条件和操作步骤均相同。
44.实施例8
45.与实施例1的区别是，步骤(3)中的固定化时间为4h、6h、8h、12h，其余参数条件和操作步骤均相同。
46.对以上实施例1～8制备得到的固定化右旋糖酐酶进行测试分析。实验所用的试剂、仪器如下：
47.壳聚糖：脱乙酰度≥95％，上海麦克林生化科技有限公司；京尼平(98％)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；右旋糖酐t70：北京索莱宝科技有限公司；右旋糖酐酶，本课题组对圆弧青霉cicc-4022的培养基和培养条件进行优化，采用硫酸铵沉淀和切膜过滤系统纯化得到；冷冻干燥机：fd-1a-50+，博医康仪器有限公司；场发射扫描电子显微镜：mira lms，捷克泰瑞肯(中国)有限公司；傅里叶变换红外光谱仪：magna-1r 550，美国赛默飞世尔科技公司；热重分析仪：tg 209 f3，德国耐驰仪器制造有限公司。
48.固定化右旋糖酐酶效果分析及结构分析：
49.1、固定化右旋糖酐酶酶活力和固定化率的测定：
50.按照实施案例1所述的方法制备固定化右旋糖酐酶，测定酶活：底物选用30mg/ml的t70，用(0.02m，ph＝5)的醋酸钠缓冲溶液配制。取1g固定化酶沸水浴灭活10min作标样。在55℃下保温10min，接着将三组未灭火的固定化酶分别加入到底物当中，继续在50℃下保温10min后，沸水浴10min灭活，冷水降温。取1ml产物溶液加入25ml的具塞试管，加1ml的dns，沸水浴10min显色，冷却后用醋酸钠缓冲溶液定容。根据葡萄糖标准曲线计算还原糖含量(mg)，再按照下面公式计算右旋糖酐酶酶活。在上述条件下，每小时右旋糖酐t70被水解产生1mg还原糖(葡萄糖当量)所需的酶量为一个单位酶活(u)。：固定化酶测定每克干固定化酶含有的酶活单位数(u/g)和固定化率。计算方法为：固定化酶比活力(u/g)＝固定化酶的活性(u)/固定化干基载体的质量(g)；固定化率(％)＝(用于固定化酶的酶活力-剩余固
定化酶酶活力)/用于固定化酶的酶活力。测试结果显示，实施例1固定化右旋糖酐酶的比活力为59.13u/g，固定化率为89.33％。
51.2、固定化右旋糖酐酶的重复使用性
52.按照实施案例1所述的方法制备固定化右旋糖酐酶，然后按照以下条件进行9次反应：加入1ml用ph 5.0的醋酸钠缓冲溶液配制的30mg/ml的t70底物，加入1g制备好的固定化酶和1ml的ph 5.0的醋酸钠缓冲溶液，温度为50℃的条件下水浴保温10min。测定反应后的酶活，计算相对酶活。相对酶活的计算方法为：以固定化右旋糖酐酶第一次反应之后的酶活力为100％，计算重复使用固定化右旋糖酐酶之后的相对活力。测试结果显示，重复使用9次，固定化酶仍维持60％的相对活力。
53.3、扫描电子显微镜(sem)分析cs、cs-gn和cs-gn-edex形貌：
54.用两层导电胶带制成铜片夹层，取下一块制备好的omtcs薄片粘在一端导电胶带上，然后将另一端导电胶带粘在样品座上，然后把样品置于蒸金室中蒸镀导电层。
55.cs、cs-gn和cs-gn-edex的扫描电镜图如图1所示。cs为多孔结构，表面疏松，孔径大而不均；cs-gn表明京尼平的交联会使壳聚糖形成三维交联网络，孔径变小，孔道密度增加使壳聚糖整体更加稳定牢固，这有利于固定化酶的负载。cs-gn-edex表明载体经固载酶后仍维持良好的孔径和孔道分布，这有利于降低负载酶和底物之间的传质阻力。
56.4、傅里叶变换红外光谱仪(ftir)分析cs、cs-gn和cs-gn-edex化学组成：
57.cs、cs-gn和cs-gn-edex的ftir分析如图2所示。cs在1650cm-1
和1600cm-1
出现吸收峰，表明伯胺在壳聚糖结构上发生n-h弯曲振动。1381cm-1
处的峰是ch3-对称角变形特征峰。在1000cm-1
和1100cm-1
之间的吸收峰主要是c-o和c-n的伸缩振动和c-c-n的弯曲振动。在3000cm-1
到3600cm-1
之间的宽波段属于o-h拉伸振动，n-h的的拉伸振动可能在此区域重叠，在2800cm-1
到3000cm-1
之间的宽波段属于c-h的拉伸振动。京尼平与壳聚糖的反应首先是壳聚糖的氨基对京尼平的c-3处碳原子的亲核攻击，京尼平发生开环反应。随后较慢的反应是壳聚糖上得氨基与京尼平上的酯基形成酰胺。同时，已经壳聚糖氨基链接的京尼平分子间可以发生自聚，形成短链的京尼平分子。在与京尼平交联之后，在1565cm-1
的酰胺ii带具有n-h形变的特征峰，这可能是由于京尼平的酯基和羟基与壳聚糖氨基之间的反应形成了仲酰胺。在1000cm-1
和1400cm-1
之间峰值的增加主要归因于壳聚糖与京尼平交联之后引起的c-n拉伸振动和c-oh拉伸振动。1648cm-1
处的峰值归因于仲酰胺中的c＝o键的拉伸振动。cs-gn-edex的光谱具有与cs-gn相似的酰胺带(1648cm-1
和1565cm-1
)，因为在酶的存在下参与交联反应的机制与壳聚糖小球(cs)的交联反应相同。特征带强度的增加可能是由于来自于增加的氨基(来自吸附酶)与京尼平反应从而导致交联基团(如酰胺键)的增加。这些结果表明京尼平基团结合在壳聚糖小球上。
58.5、热重分析仪(tga)分析cs、cs-gn和cs-gn-edex的热稳定性：
59.热重分析如图3所示。如图为cs、cs-gn和cs-gn-edex的热重分析结果。当温度达到100℃时，所有样品均表现出质量下降，这归因于样品表面吸附水的消除。此外，壳聚糖小球cs在第一失重平台的失重比最大为8.82％，表明其载体内部水分含量较高，并且在259℃到303℃的温度范围内表现出显著的质量损失，这是因为壳聚糖的多糖结构c-o-c和c-c键的复杂脱水、解聚和热解反应及挥发性产物的蒸发和消除。cs-gn和cs-gn-edex在210℃到400℃的温度范围内失重率分别为47.28％和48.96％，这可归因于京尼平交联壳聚糖后结构的
弱化。此外，tga热重曲线显示，cs-gn和cs-gn-edex的总质量损失分别为68.83％和69.24％，相较于cs的总质量损失增加，分别证明了交联和酶的固定化。tga热重曲线还表明了所获得的的壳聚糖小球在用于大多数酶反应的温度范围内(100℃内)是稳定的，这能够充分满足实际使用中的反应条件。
60.上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种具有良好稳定性的改性壳聚糖共价固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)制备壳聚糖小球(cs)：取4g壳聚糖粉末溶解于含有2％乙酸的水溶液中，并置于磁力搅拌器中搅拌溶解完全，得到壳聚糖溶液，超声40min除去气泡，使用0.45
×
15mm的针管将壳聚糖溶液滴加到1m的naoh和无水乙醇体积比为4∶1的凝结液当中，凝固2h，用纯水冲洗至壳聚糖小球ph为中性，使用布式漏斗抽滤除去壳聚糖小球的表面水分，得到壳聚糖小球，4℃保存冰箱备用；(2)制备京尼平交联壳聚糖小球(cs-gn)：把制备好的cs置于ph＝7、0.6％的京尼平溶液中，在75℃水浴下反应4h，；反应完成后用ph＝5，0.02m的醋酸钠缓冲溶液清洗至无京尼平残留，得到京尼平交联壳聚糖小球；(3)制备固定化右旋糖酐酶(cs-gn-dex)：配制2ml浓度为34u/ml壳聚糖小球的右旋糖酐酶溶液，将cs-gn置于溶液中，在4℃和100rpm的摇床中固定化10h，反应完成后用ph＝5，0.02m的醋酸钠缓冲溶液清洗掉未固定的右旋糖酐酶，得到固定化右旋糖酐酶。2.根据权利要求1所述的固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的壳聚糖粉末的脱乙酰度≥95％。3.根据权利要求1所述的固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的壳聚糖的乙酸溶液中壳聚糖与水的质量比为2∶49。4.根据权利要求1所述的固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的凝结液中naoh为1mol/l。5.根据权利要求1所述的固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的0.6％的京尼平溶液为6ml。6.根据权利要求1所述的固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的加热反应温度为75℃。7.根据权利要求1所述的固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的加热反应时间为4h。8.根据权利要求1所述的固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的加酶量为2ml浓度为34u/ml的右旋糖酐酶溶液。9.根据权利要求1所述的固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的固定化温度为4℃。10.根据权利要求1～10任一项所述的固定化右旋糖酐酶的制备方法，其特征在于：将制得的壳聚糖小球作为酶固定化材料的应用。

技术总结
本发明属于固定化酶制备技术领域，公开了一种制备固定化右旋糖酐酶的方法，其制备方法包括如下步骤：(1)先利用中和滴定法制备壳聚糖小球CS；(2)将该小球与京尼平进行交联得到CS-GN(3)最后通过改性的壳聚糖小球对右旋糖酐酶进行交联固定，得到固定化右旋糖酐酶CS-GN-Edex。本发明采用制备出了的固定化右旋糖酐酶，通过扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、热重(TG)分析等分析手段，对所得的固定化右旋糖酐酶进行表征，并采用单因素分析得出制备固定化右旋糖酐酶的最佳条件，本发明得到的固定化酶的pH稳定性和操作稳定性得到提高，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：张东辉 李媚 张怡睿 靳玉辉 方燕 孙国梁
受保护的技术使用者：广西民族大学
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/9/12