一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜及其制备方法和应用。


背景技术：

2.纤维素是地球上最为丰富的天然聚合物。生物纤维素(bacterial cellulose，bc)是由微生物经生物合成所分泌的纤维素类物质的统称，通常是通过体外酶促合成或由藻类、真菌和细菌等微生物合成。生物纤维素膜，作为一种新型的生物纳米纤维膜材料，具有较高的机械强度和亲水能力，同时具备较强的持水性和较好的生物相容性等优异性能，已被广泛应用于食品、医药、环保等领域。
3.生物纤维素膜通常是在不同培养条件下，由醋酸杆菌属(gluconacetobacter)、根瘤菌属(rhizobium)、假单胞菌属(pseudomonas)、沙门氏菌属(salmonella)和八叠球菌属(sarcina)等中的某种微生物通过动态或静态发酵产生，其中木葡糖酸醋杆菌为典型代表。基于上述菌种制备生物纤维素膜，仍存在菌种单一、生产速率较低等问题。因此，探寻新型菌种或开发混合菌种以提高生物纤维素膜的生产效率、降低生产成本是目前的研究热点。通过微生物发酵工程获取生物纤维素膜是一个复杂的生物学过程，并且生物纤维素膜产量受多种混合因素的影响，如生产菌种、培养方式等，选择合适的生产菌种并结合合适的培养方法对于缩短培养周期、提高纤维素膜产量具有重要意义。
4.专利cn112760265 a公布了一种利用木葡糖酸醋杆菌171027-per1动态发酵培养细菌纤维素的方法，其中以含蔗糖的培养液作为发酵原料，将木葡糖酸醋杆菌进行动态培养所得的生物纤维素产量较高，所获纤维素较细，提供了一种适合动态培养的细菌纤维素菌株。
5.专利cn 103923865 a公开了一种通过深层动态与浅层静态交替进行发酵培养纤维素的方法，所用菌种为木葡糖酸醋杆菌bc13，采用深层动态与浅层静态进行发酵的方式不会形成块状或球形的生物纤维素，所得产物为膜片状的细菌纤维素。
6.以上方法虽然能够通过发酵生产得到生物纤维素，但通过动态培养容易获得球状、絮状的纤维素，均匀成膜难度较大，得到的多为生物纤维素粉末；若通过动静态结合的方法进行发酵生产则工艺复杂、成本较高，因此静态培养方法仍是目前获得膜片状生物纤维素的较适宜方法。但适合制备纤维素的菌种仍然需要探索，均匀、形状可控而成本低廉的纤维素膜的制备也是市场的急切需求的。


技术实现要素：

7.本发明针对现有技术中细菌发酵制备细胞纤维素成膜难度大，形状不可控的问题，提供一种以棘孢木霉菌种进行生物纤维素膜的发酵生产方法，采用静态培养的方式进行生物纤维素膜的培养，所产纤维素膜均匀、形状可控，所用方法简便易行，成本低廉，易于大规模培养。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
9.一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，包括步骤：
10.步骤1，配制用于制备生物纤维素膜的培养液，并进行灭菌处理；
11.步骤2，在灭菌后的培养液中接种生产菌种；
12.步骤3，将接种菌种的培养液静态恒温培养，发酵制得生物纤维素膜；
13.步骤4，将生物纤维素膜洗涤、干燥得到生物纤维素膜成品；
14.所述生产菌种为棘孢木霉(trichoderma asperellum)，命名为rpt1，于2022年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no:m20221879。
15.本发明以棘孢木霉为生产菌种，通过静态恒温培养，可得到完整、均匀的生物纤维素膜成品，生物纤维素膜的形状和尺寸可根据培养皿的形状和尺寸调整。其原因可能为容器与外界接触表面给真菌提供充足的氧气，真菌倾向于在培养液与空气接触界面生长。因此可通过使用不用形状和尺寸的培养皿来获得不同形状和尺寸的生物纤维素膜。同时得到的生物纤维素膜成品产量好，孔隙率高，各项性能优异。
16.优选地，步骤1中灭菌处理采用高温高压灭菌处理，如在压力蒸汽灭菌锅中100-150℃灭菌10-30min。
17.步骤1中培养液的原料组成为：葡萄糖10-20g，酵母提取物5-15g，蛋白胨5-10g，磷酸二氢钾1.5-3g，去离子水1000ml。该培养液能够快速发酵制得生物纤维素膜，所制得的生物纤维素膜厚度均匀，尺寸可调。
18.所述培养液的ph为5.5-7.5。采用氢氧化钠、柠檬酸或乙酸等常规酸碱调剂调节培养液的ph值。在培养液中添加柠檬酸、乙酸可以促进葡萄糖转化为纤维素，但过高的柠檬酸或乙酸含量可能会促进棘孢木霉菌孢子的产生，降低纤维素的产量。本发明中弱碱性的环境有利于棘孢木霉菌的菌丝生长，促进生物纤维素膜的形成。
19.步骤2中生产菌种的接种率为10-30％。
20.所述生物纤维素膜的尺寸通过盛装培养液进行恒温培养的容器控制。
21.步骤3中恒温培养的温度范围为20-37℃，培养3-8天。优选地，培养温度范围为25-37℃。
22.优选地，步骤4中清洗的步骤包括：将生物纤维素膜取出后用蒸馏水洗涤、再加入氢氧化钠溶液浸泡，再用去离子水反复冲洗至溶液ph为中性。
23.优选地，氢氧化钠溶液的浓度为0.1-0.2mol/l，浸泡温度为80-100℃，洗涤时间60-120min，以除去残存的菌体和培养液。
24.优选地，所述干燥采用冷冻干燥。
25.根据上述方法制备的生物纤维素膜的产量约为8-12g/l，膜厚度约为2-3mm。在一些实施方式中，产量约为8.89-10.02g/l，
26.本发明还提供根据所述的制备方法制得的生物纤维素膜，所述生物纤维素膜的孔隙率约为60-80％，吸液量约为2-5g/g，水蒸气透过率约为900-1000g/m2/d。本发明还提供所述的生物纤维素膜在生物医学领域中的应用。
27.在一些实施方式中，所述生物纤维素膜的孔隙率约为60-80％。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.本发明提供一种棘孢木霉菌制备生物纤维素膜的方法，能够得到均匀、完整的整片膜结构的纤维素，一方面拓宽了生产生物纤维素膜的菌种可选择面，同时生物纤维素膜的形状可控，制备方法具有操作简单、效率高、成本低、原料易得等优点，在生物纤维素膜的生产技术领域中具有推广应用价值。
附图说明
30.图1为实施例1生物纤维素湿膜片宏观形貌图。
31.图2为实施例1生物纤维素干膜片的红外光谱图。
32.图3为实施例1生物纤维素干膜片的微观形貌图。
33.图4为对比例1生物纤维素湿膜片的宏观形貌图。
34.图5为对比例2生物纤维素湿膜片的宏观形貌图。
35.图6为实施例1制备的生物纤维素膜的毒性测试结果。
36.图7为实施例1制备的生物纤维素膜的细胞迁移测试结果。
具体实施方式
37.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。
38.以下具体实施方式中棘孢木霉为cn115948252a中分离鉴定菌种，于2022年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m20221879，其他原料均购于市场，未经处理直接使用。
39.实施例1
40.制备生物纤维素膜的方法：
41.步骤1，菌种活化：利用接种环从pda培养基上刮取少量菌丝，并置于pdb培养基中，25～28℃条件下120～180rpm振荡培养24h，得到菌液；
42.步骤2，培养基配制：称取葡萄糖20g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1.5g，依次加入到500ml去离子水中，并用去离子水定容至1000ml，磁力搅拌溶解后，使用乙酸将溶液的ph值调整为6；将培养基放入压力蒸汽灭菌锅中121℃灭菌15min，灭菌结束后冷却至室温；
43.步骤3，将冷却至室温的液体培养液、灭菌后的枪头和移液枪放置于超净台内，随后打开超净台内的紫外灯灭菌30min；在灭菌后的超净台内，将培养液倒入直径为90mm的培养皿中，将棘孢木霉菌种接种到培养液中，并反复吹打，以确保真菌均匀分散于培养液中，接种量为20％；
44.步骤4，将接种棘孢木霉菌种的培养液置于37℃培养箱中，静态发酵，发酵5天后在培养容器内形成生物纤维素膜片；
45.步骤5，将生长在容器内的生物纤维素膜片取出，用蒸馏水或去离子水洗涤多次以除去表面杂质，随后浸没于0.1％naoh溶液中，并于80℃水浴锅中加热至60min-120min至生物纤维素膜片变成乳白色后取出，得到乳白色生物纤维素湿膜片；将纤维素湿膜片置于冷
冻干燥机零下20℃冷冻干燥24h，即得到白色纤维素干膜片。
46.制得的纤维素干膜片为圆形，其外观图如图1所示，外观较为完整，干膜片直径为90mm，与培养容器的直径基本相当，厚度均匀，为1mm。
47.将干燥后的生物纤维素膜产量进行测试，测试方法为：生物纤维素膜产量＝干燥后的生物纤维素膜质量(g)/生物纤维素膜制备培养液体积(l)，计算可得纤维素膜的产量为8-12g/l；
48.将干燥后的生物纤维素膜含水量进行测试，测试方法为：；采用介质饱和法测定生物纤维素膜的孔隙率，测试方法为：将生物纤维素膜浸泡于无水乙醇中，至完全吸附饱和后，两面附以滤纸一定压力吸收30s后，使用精密天平称重为w1，之后将生物纤维素膜置于干燥箱中烘干并称重为w2，根据以下公式计算孔隙率：ε＝(w
1-w2)/8ρd。
49.式中，ε为生物纤维素膜孔隙率(％)，d为生物纤维素膜厚度(cm)，ρ为无水乙醇的密度(g/cm-3
)。计算得到本发明制备所得生物纤维素膜的孔隙率约为71-60％；吸液量约为2-5g/g，水蒸气透过率约为900-1000g/m2/d。
50.将得到的生物纤维素干膜片进行傅氏转换红外线光谱(fourier transform infrared spectroscopy，ftir)扫描，结果如图2所示，包括3274cm-1
处为分子内氢键的伸缩振动峰，2923cm-1
处为c-h伸缩振动吸收峰、1646cm-1
处为h-o-h弯曲振动吸收峰，1022cm-1
处为吡喃糖环骨架振动，1500cm-1
和1377cm-1
处为巯基乙酸中羧酸阴离子的不对称与对称振动吸收峰，与文献报道的细菌纤维素膜的红外光谱结果基本一致，证明本实施1中制备得到的产品为生物纤维素。
51.该生物纤维素干膜片的微观扫描电镜如图3所示，可见制得的生物纤维素膜内部呈现多孔结构，纤维素带的宽度约为200-450nm。
52.实施例2
53.本实施例中，生物纤维素膜的制备方法与实施例1中区别仅在于：培养液配制为称取葡萄糖10g，酵母提取物2.5g，蛋白胨2.5g，磷酸二氢钾0.75g，菌种接种量为20％，发现培养容器中生长较为完整的生物纤维素膜需要培养8天。经观察，本实施例所得生物纤维素膜与实施例1中所得生物纤维素膜片的结构类似。本实施例说明降低培养液中的试剂添加含量，延长培养时间可得到结构完整、厚度均匀的生物纤维素膜片。
54.实施例3
55.本实施例中，生物纤维素膜的制备方法与实施例1中区别仅在于：菌种接种量为10％，培养时间为7天。本实施例所得生物纤维素膜与实施例1中所得生物纤维素膜片的结构类似。本实施例说明降低菌种含量，延长培养时间可得到结构完整、厚度均匀的生物纤维素膜片。
56.实施例4
57.本实施例中，生物纤维素膜的制备方法与实施例1中区别仅在于：菌种接种量为20％，培养温度为28℃，培养时间为7天。本实施例所得生物纤维素膜与实施例1中所得生物纤维素膜片的结构类似。本实施例说明降低培养温度，延长培养时间可得到结构完整、厚度均匀的生物纤维素膜片。
58.实施例5
59.本实施例中，生物纤维素膜的制备方法与实施例1中区别仅在于：步骤4中，将液体
培养液倒入直径为15mm的离心管中。本实施得到的生物纤维素膜片与实施例1中所得生物纤维素膜片的结构类似，区别在于所得纤维素膜片的直径为15mm。本实施例说明，通过改变培养容器的尺寸可获不同尺寸的生物纤维素膜片。
60.实施例6
61.本实施例中，生物纤维素膜的制备方法与实施例1中区别仅在于：步骤2中，采用氢氧化钠将培养液的ph值调节为7.5。采用本实施例中所提供的培养液，延长培养时间7天，可得到结构完整、厚度均匀的生物纤维素膜片。
62.对比例1
63.本对比例中生物纤维素膜的制备方法与实施例1中区别仅在于：在培养液制备过程中，使用柠檬酸将溶液的ph值调整为5，本实施例所得生物纤维素膜片不完整，多为絮状结构，如图4所示。
64.对比例2
65.按照实施例1的工艺，区别仅在于，步骤2中培养液的原料组分中去离子水换成人工海水，人工海水配方为：氯化钠24.53g/l，氯化镁5.2g/l，硫酸钠4.09g/l，氯化钙1.16g/l，氯化钾0.695g/l，碳酸氢钠0.201g/l，溴化钾0.101g/l，硼酸0.027g/l，氯化锶0.025g/l，氟化钠0.003g/l，余量为去离子水，溶液ph值为8.2(使用氢氧化钠调节ph值)。本实施例所得生物纤维素膜片不完整，多为絮状结构，如图5所示。
66.应用例1
67.将实施例1制得的生物纤维素膜进行cck8细胞毒性测试观察其细胞相容性，具体步骤包括：
68.将处于对数生长期的l929小鼠成纤维细胞以1
×
103个/孔的密度接种于96孔板，于37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h后，将细胞培养液吸弃，并于对照组中加入100μl含dmem完全培养基(含10％fbs和1％双抗的dmem培养基)，实验组中加入含有10％生物纤维素膜浸提液的dmem完全培养基，分别培养1，3，5，7天后，采用cck-8方法检测生物纤维素膜浸提液对细胞增殖的影响。其中生物纤维膜浸提液的制备方法为：采用细胞破碎机将生物纤维素膜破碎在细胞培养液中，并置于37℃恒温培养箱中，浸泡24h后，离心，过滤得到生物纤维膜浸提液。
69.试验结果如图6所示，从图中可以看出含10％本实施例所得生物纤维素膜浸提液对成纤维细胞具有一定的促增殖作用。
70.将实施例1制得的生物纤维素膜进行细胞划痕试验测试细胞的迁移能力，具体步骤为：
71.通过成纤维细胞划痕愈合实验探究生物纤维素膜浸提液对成纤维细胞迁移的影响，以表征生物纤维素膜浸提液对伤口愈合的潜在作用。
72.将处于生长对数期的l929小鼠成纤维细胞以105/孔的密度接种于6孔板中，用马克笔在6孔板的盖子中央垂直划十字标记线，并置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。当细胞融合到80％时，将培养液移去，然后用20微升移液枪头沿十字标记线划线。用磷酸盐缓冲液轻柔3次，以洗去分离的细胞。分别加入dmem完全培养基(对照组)、含10％生物纤维素膜浸提液的dmem完全培养基(实验组)，每组设3个复孔。培养0、12、24、48h后置于倒置显微镜下观察拍照。
73.试验结果如图7所示，由图可以看出，与空白对照组相比，相同时间下，添加10％生物纤维素膜浸提液的培养基中细胞迁移速度较快，说明本实施例所得生物纤维素膜可以促进细胞迁移。

技术特征：
1.一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，包括步骤：步骤1，配制用于制备生物纤维素膜的培养液，并进行灭菌处理；步骤2，在灭菌后的培养液中接种生产菌种；步骤3，将接种菌种的培养液静态恒温培养，发酵制得生物纤维素膜；步骤4，将生物纤维素膜洗涤、干燥得到生物纤维素膜成品；所述生产菌种为棘孢木霉(trichoderma asperellum)，命名为rpt1，于2022年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no:m20221879。2.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，步骤1中培养液的原料组成为：葡萄糖10-20g，酵母提取物5-15g，蛋白胨5-10g，磷酸二氢钾1.5-3g，去离子水1000ml。3.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述培养液的ph为5.5-7.5。4.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，步骤2中生产菌种的接种率为10-30％。5.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述生物纤维素膜的尺寸通过盛装培养液进行恒温培养的容器控制。6.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，步骤3中恒温培养的温度范围为20-37℃，培养3-8天。7.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述生物纤维素膜的产量为8-12g/l。8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的生物纤维素膜。9.根据权利要求8所述的生物纤维素膜，其特征在于，所述生物纤维素膜的孔隙率约为60-80％，吸液量约为2-5g/g，水蒸气透过率约为900-1000g/m2/d。10.根据权利要求8所述的生物纤维素膜在生物医学领域中的应用。

技术总结
本发明涉及微生物发酵工程领域，具体公开一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜及其制备方法和应用。包括步骤：以棘孢木霉(Trichoderma asperellum)静态恒温培养方式制备生物纤维素膜；所制备的生物纤维素膜，形状可控，制备效率高，产量好，纤维素膜的各项性能优异，在生物纤维素膜的生产与应用领域具有推广应用价值。且该生物纤维素膜具有促进细胞增殖和迁移的能力，可将其应用于面膜、创伤敷料、人造皮肤等医用材料领域。人造皮肤等医用材料领域。人造皮肤等医用材料领域。


技术研发人员：冯嫩妙
受保护的技术使用者：宁波一德益生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/9/12