一种珍珠肽及其制备方法

1.本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种具有多种生物活性的马氏珠母贝珍珠肽的制备方法。


背景技术：

2.珍珠贝壳为珍珠贝加工的主要副产物，目前其加工利用程度角度，大部分作为废弃物丢弃或简单加工成建筑材料。研究表明，珍珠层粉的主要成分与珍珠粉的成为极为接近。珍珠(层)粉主要成分为无机成分、有机质成分和水，不同种类珍珠(层)粉，其化学成分的含量稍有差异，一般而言，珍珠(层)粉所含的无机成分含量为90％～96％，有机质含量约为2.0％～7.0％，水的含量约为0.2％～2.0％。其中，有机成分主要为外套膜细胞分泌的各类蛋白质和多糖几丁质，蛋白质主要为壳角蛋白，有机质与无机质结合牢固，具有水不溶性等特点，难以直接利用。
3.《本草纲目》记载珍珠粉具有多种功效，如明目、安定、解毒、美白等。近年来，随着珍珠功效因子的研究的不断深入，珍珠蛋白及其酶解产物活性肽功能活性备注国内外研究学者的关注。然而，由于珍珠蛋白常与无机质结合，相互交联形成较强的网络状结构，且壳角蛋白结构较为复杂，氢键、疏水健、二硫键等相互作用导致其肽链卷曲紧密，存在不易降解、提取小分子肽低等问题。另外，目前未见从马氏珠母贝珍珠层粉提取酪氨酸酶抑制肽和抗皮肤光老化肽的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明公开了一种，一种珍珠肽，包括如seq no.1所述短肽或如seq no.2所述短肽中的至少一种。
5.本发明还公开了上述珍珠肽的制备方法，具体包括以下步骤：
6.(1)珍珠层粉经酸性离子水处理、高温高压处理后，按照比例加入复合蛋白酶酶解，灭酶后离心得到上清液；
7.(2)取步骤(1)的上清液，经脱色后，采用超滤膜截留小分子组分，浓缩，冻干即可得到具有生物活性的珍珠肽；
8.(3)将步骤(2)得到的珍珠肽经固相萃取和亲水相互作用色谱(tskgel amide-80)分离富集即可获得目标肽。
9.进一步的，步骤(1)中以马氏珠母贝珍珠层粉为原料；按照1：3～1：5比例加入蒸馏水；采用高温高压处条件为：115-121℃，20-30min。
10.进一步的，步骤(1)中酶解选用的酶为菠萝蛋白酶和中性蛋白酶，添加量分别为：0.10-0.30g/100g和0.2-0.6g/100g；采用同步酶解，酶解条件为：ph值5.5-7.5，酶解温度45-60℃，酶解时间为4-7h，100℃灭酶后，离心取上清液。
11.进一步的，步骤(2)中采用活性碳和硅藻土联合脱色，过滤后，滤液进一步采用超滤膜截留分子量小于3000da的组分。
12.本发明具有以下有益效果：
13.本发明对珍珠层粉制备活性肽工艺的进行优化，比较分析了四种不同的前处理方式、单一酶及不同复合酶组合对可溶性小分子肽含量的影响，结果表明，高温高压前处理能够有效提高酶解制备可溶性小分子肽的含量；复合酶解能显著提高单一菠萝蛋白酶水解不溶性蛋白的效率，其中菠萝蛋白酶与中性蛋白酶复合方法效果最佳，与空白组(未经高温高压处理)(已有的酶解技术)相比，水解度提高了155％。由此可知，合理的前处理方式(热变性处理)和蛋白酶种类选择，对降解不溶性珍珠蛋白起关键因素。可解决现有技术中珍珠层蛋白水溶性差、利用难等技术问题。
14.本发明制备得到的珍珠肽，具有较高的酪氨酸酶抑制活性，同时具有清除自由基和抗皮肤光老化功能，且安全性高、无毒副作用，可以解决现有技术中氢醌、曲酸和熊果苷等酪氨酸酶抑制剂可能存在毒副作用的技术问题。
15.采用本发明的制备方法，既有效提高珍珠贝贝壳废弃物的附加值，同时拓展其功能活性，为化妆品领域提供一种新型的生物活性肽，具有较高的经济价值。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1不同前处理方式对酶解珍珠粉蛋白效果的影响；
18.图2复合同步酶解的酶解效果；
19.图3珍珠肽分离鉴定的lc-ms总离子图；
20.图4珍珠肽对abts自由基清除效果；
21.图5珍珠肽对dpph自由基清除效果；
22.图6珍珠肽对酪氨酸单酚酶的抑制曲线；
23.图7珍珠肽对酪氨酸双酚酶的抑制曲线；
24.图8珍珠肽对hacat细胞活力的影响；
25.图9珍珠肽对uv-b损伤后hacat细胞活力的影响。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.实施例1
32.海水珍珠贝壳(马氏珠母贝)清洗、烘干，并粉碎成200目以上粉末，取40g为一组，共5组，分别按照1：5比例加入200ml蒸馏水。其中一组作为对照组(不处理组)，其他4组分别采用常压热处理(常压加热组)、高温高压处理(高压高温组)、超声波(超声组)、微波(微波组)对珍珠粉混悬液进行预处理。常压热处理的条件为：100℃，1.0h；高温高压的条件为：121℃，20min；超声波处理：50℃，40min，100w；微波处理的条件为：350w，8min。
33.改性后的珍珠粉液，按照每100g珍珠粉重量添加菠萝蛋白酶0.1g，ph值6.5，50℃酶解时间4h，灭酶后冷却离心取上清液。采用bca试剂盒检测上清液中水溶性肽含量，根据水解度(dh)作为评价酶解效果的指标。
34.dh(％)＝上清液中蛋白肽浓度(mg/ml)*上清液总体积(ml)/珍珠粉重量(g)*总蛋白含量(％)*1000*100
35.结果如图1所示，四种前处理方式均能提高菠萝蛋白酶水解不溶性蛋白的效率，其中121℃高温高压方法效果最佳。
36.实施例2
37.本实施例中，优选采用菠萝蛋白酶为首选酶，与角蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶进行复配同步酶解。
38.取40g为一组，共4组，分别按照1：3比例加入120ml蒸馏水。高温高压处理(121℃，20min)，分别按照每100g珍珠粉重量添加菠萝蛋白酶0.1g，菠萝蛋白酶0.1g+角蛋白酶0.06g，菠萝蛋白酶0.1g+中性蛋白酶0.2g，菠萝蛋白酶0.1g+木瓜蛋白酶0.06g，ph值6.5，酶解温度50℃，酶解时间4h，酶解结束后，100℃灭酶10min后，离心取上清液。采用bca试剂盒检测上清液中蛋白/肽含量，根据水解度(dh)作为评价酶解效果的指标。
39.结果显示，复合酶解均能显著提高单一菠萝蛋白酶水解不溶性蛋白的效率，其中菠萝蛋白酶与中性蛋白酶复合方法效果最佳，dh得到58.67％，与空白组(未经高温高压处理)(已有的酶解技术)相比，水解度提高了155％(图2)。
40.实施例3
41.实施案例2中，菠萝蛋白酶复合中性蛋白酶制得上清液，按照添加量为0.1-0.5％(w/v)加入活性炭，和硅藻土(0.01％，w/v)，保温50℃，20min后，12000g条件下离心20min，除去脱色剂，采用超滤膜截留分子量小于3000da的组分，经冷冻干燥后，得到珍珠肽(np-pm-p)。
42.实施例4
43.将珍珠肽分别进行还原烷基化处理作为样品，通过液质联用(lc-ms/ms)分析，得到质谱原始结果的raw文件，使用xcalibur软件得到总离子流色谱图(图3)。质谱数据经过软件peaks studio8.5分析，鉴别出得分较高的肽序列，进一步以酪氨酸酶(pdb:2y9x)作为受体，小分子肽作为配体，采用autodockvina软件实施分子对接，得到结合能最低的美白活性肽序列，分别为：tfsgnyp、kpiwt、ghsltqf、ggfgnw、atfdai、lkghedl、hssahs、htleskpnpd、ahyyd、tdiidg、fgslsf、ggsfsvr。其中，kpiwt和ahyyd结合能较低(如表1所示)。
44.表1活性肽序列
[0045][0046]
实施例5
[0047]
珍珠肽kpiwt和ahyyd经人工合成后(纯度99％)，其生物活性测定包括抗氧化活性、美白活性、抗皮肤光老化。
[0048]
(1)抗氧化活性
[0049]
按照试剂盒说明进行操作。abts、dpph自由基清除率均按下计算：
[0050][0051]
式中：
[0052]
a0——空白对照吸光值；
[0053]
a1——样品与abts(dpph)反应后的吸光值；
[0054]
a2——样品吸光度值。
[0055]
珍珠肽具有较强的abts、dpph自由基清除能力，且其清除率随浓度增加表现出递增趋势(图4、图5)
[0056]
(2)美白活性(酪氨酸酶抑制活性)
[0057]
参照t/gdca 006-2021的规定进行。在96孔板加入l-酪氨酸溶液、不同浓度的珍珠肽液、pbs缓冲液，37℃水浴10min，加入20μl酪氨酸酶溶液，37℃混匀反应5min
±
5s后立刻放入酶标仪进行测定。将l-酪氨酸换成l-多巴重复上述操作。单、双酚酶活性抑制率按下式计算：
[0058][0059]
式中：
[0060]
y——酪氨酸酶活性抑制率，％；
[0061]
ad——样品反应孔吸光度；
[0062]
ac——样品本底孔吸光度；
[0063]
ab——溶剂反应孔吸光度平均值；
[0064]
aa——溶剂本底孔吸光度平均值。
[0065]
将抑制率曲线拟合得到回归方程并计算活性肽的ic50值，按式(4)换算成曲酸当
量值。
[0066][0067]
式中：
[0068]
d——曲酸当量值，mg/mg；
[0069]
c——受试样品的ic50值，mg/ml；
[0070]
c0——曲酸的ic50值，mg/ml。
[0071]
酪氨酸酶抑制活性是美白活性评定的体外活性之一，可用于反映其对黑色素生成的抑制能力。单酚的曲酸ic50值为0.004mg/ml，双酚的曲酸ic50值为0.030mg/ml，认为试验系统有效可行。由如图6和图7和表2可知，在1.00mg/ml～14.00mg/ml浓度范围内，珍珠肽(np-pm-p)对酪氨酸单酚酶和多酚酶的抑制率与珍珠活性肽浓度存在较好的量效关系，就单酚酶而言，其ic50值为6.73mg/ml，其曲酸当量值为1877.38g/g，珍珠肽表现出良好的酪氨酸酶抑制能力。
[0072]
表2两种合成珍珠肽的酪氨酸酶抑制活性
[0073]
peptidepeptide sequenceic50kpiwtlysproiletrpthr1.5mg/mlahyydalahistyrtyrasp2.21mg/ml
[0074]
(3)抗皮肤光老化(uv-b损伤后hacat细胞活力的影响)
[0075]
将细胞培养在含10％胎牛血清的dmem培养基中置于5％ co2，37℃的恒温恒湿细胞培养箱备用。将hacat细胞置于t25细胞培养至75％左右时，用0.25％的胰酶消化并转移到96孔细胞板，细胞附壁后将培养基吸除，用pbs清洗，uv-b紫外灯(9w，光谱在285～350nm之间，)在96孔板上距离16cm处照射1min，加入100μl含有不同浓度的珍珠肽的dmem，24h培养后用cck-8试剂盒测定其细胞活力。
[0076]
结果显示，相比ct组，np-pm-p能够显著提高正常hacat细胞的细胞活力(图8)；同时对uv-b损伤的hacat细胞有显著的修复作用，提示其具有抗皮肤光老化功效(图9)。
[0077]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0078]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过任一现有技术实现。

技术特征：
1.一种珍珠肽，其特征在于，所述珍珠肽包括如seq no.1所述短肽或如seq no.2所述短肽中的至少一种。2.如权利要求1所述的一种珍珠肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)珍珠层粉经酸性离子水处理、高温高压处理后，按照比例加入复合蛋白酶酶解，灭酶后离心得到上清液；(2)取步骤(1)的上清液，经脱色后，采用超滤膜截留小分子组分，浓缩，冻干即可得到具有生物活性的珍珠肽；(3)将步骤(2)得到的珍珠肽经固相萃取和亲水相互作用色谱分离富集即可获得目标肽。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中以马氏珠母贝珍珠层粉为原料；按照1：3～1：5比例加入蒸馏水；采用高温高压处条件为：115-121℃，20-30min。4.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于，步骤(1)中酶解选用的酶为菠萝蛋白酶和中性蛋白酶，添加量分别为：0.10-0.30g/100g和0.2-0.6g/100g；采用同步酶解，酶解条件为：ph值5.5-7.5，酶解温度45-60℃，酶解时间为4-7h，100℃灭酶后，离心取上清液。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中采用活性碳和硅藻土联合脱色，过滤后，滤液进一步采用超滤膜截留分子量小于3000da的组分。6.如权利要求2-5任意一项所述的制备方法制得的珍珠肽在制备清除自由基、抑制酪氨酸酶、抗皮肤光老化相关产品中的应用。

技术总结
本发明涉及多肽技术领域，公开了一种具有多种生物活性的马氏珠母贝珍珠肽的制备方法及应用。所述珍珠肽为短肽或至少两种短肽的混合物；所述短肽为KPIWT和AHYYD中的一种；所述珍珠肽以马氏珠母贝珍珠层粉为原料，按比例加入水，采用高温高压物理改性后，依次经过菠萝蛋白酶和中心蛋白酶复合降解、灭酶、离心、分离纯化并鉴别得到。本发明制备的珍珠美白肽，具有美白、清除自由基、抗皮肤光老化等多重功效。本发明为化妆品领域提供一种新型的生物活性肽，同时提高了珍珠(层)粉在生物医药和食品领域的应用价值。域的应用价值。


技术研发人员：林海生 秦小明 曹文红 谢绍河 高加龙 郑惠娜 谢郁 庄毓秀 王嘉怡 沈炜强 林展新 王雯
受保护的技术使用者：广东海洋大学
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/9/12