一种微藻活性成分的连续提取方法

1.本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种微藻活性成分的连续提取方法。


背景技术：

2.这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
3.微藻作为一种广泛分布在自然环境中的自养植物，能够通过光合作用，合成多种活性物质如多糖、蛋白质、脂质等高附加值的代谢产物，具有抗氧化、抗癌和抑菌活性等特性，在食品、饲料添加剂、制药、化妆品以及生物柴油生产等行业都具有应用前景。
4.然而，目前从微藻中提取代谢产物的主要手段是通过溶剂提取结合其他辅助手段如高温、超声等获得单一产物，例如热水提取多糖、氯仿/甲醇超声提取油脂等。此外，产物提取后还会产生大量剩余藻渣。如何使提取物利用率达到最大化，减少藻渣的产生量成为问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种微藻活性成分的连续提取方法。
6.为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
7.一种微藻活性成分的连续提取方法，包括如下步骤：
8.将栅藻收获后，热水提取，热水温度为75-90℃，收集上清液和藻泥a，上清液经醇沉，得粗多糖；
9.向藻泥a中加入无水甲醇，超声提取，分别收集上清液和藻泥b，上清液为甲醇提取物；
10.向藻泥b中加入氯仿和甲醇混合溶液，氯仿和甲醇的体积比为1.5-2.5:1，超声辅助提取，收集上清液，得到粗脂；
11.所述栅藻的保藏编号为：cctcc m 20211488。
12.在一些实施例中，热水提取的时间为2-6h。
13.在一些实施例中，还包括将上清液进行浓缩的步骤，将浓缩后的水提物进行醇沉。
14.优选的，所述浓缩的方法为旋转蒸发浓缩或冷冻干燥。
15.优选的，所述醇沉中，每次醇沉，水提物与无水乙醇的体积比为1:3-5。
16.优选的，所述醇沉为两步醇沉，第一步醇沉中，无水乙醇加入后，在0-10℃静置10-15h，然后离心除去上清；第二步醇沉中，无水乙醇加入后，超声混匀，静置后除去上清，得到粗多糖。
17.低温降低多糖在水中的溶解度，进一步增加多糖的析出，增加多糖得率。超声混匀，使水分子与乙醇分子充分混合，破坏水分子中的氢键,从而降低多糖在水中的溶解度。
18.在一些实施例中，超声提取的频率为800-1000w。
19.优选的，藻泥a的干重与甲醇的质量比为1:15-25。
20.在一些实施例中，还包括将甲醇提取物进行氮吹浓缩的步骤。
21.在一些实施例中，藻泥b干重与氯仿和甲醇混合溶液的质量比为1:40-60。
22.优选的，超声辅助提取的频率为800-1000w
，
处理时间为5-15min。
23.进一步优选的，超声辅助提取完毕后，向上清液中加入nacl溶液，充分摇匀，静置，氮吹浓缩后，得到粗脂。加盐利于甲醇和水的分离,降低提取成分在水中的溶解度。
24.更进一步优选的，所述nacl溶液的质量百分数为0.5％-1％。
25.上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
26.本发明公开了一种从栅藻coelastrella sp.sdec-28中提取粗多糖、甲醇提取物和粗脂三种高价值产物的方法，这三种产物分别具有抗氧化特性、抗癌细胞活性以及富含甘油三酯(中性脂)的粗脂(用于生物柴油生产)，具有多种应用潜力。
27.采用本发明的连续提取方法由于第一步为热水提，提取过程会增加细胞膜的通透性，因此在甲醇提取时细胞内会更容易被提取，同时由于溶剂的不同不会导致甲醇提取物在第一步水提被提取出来，因此连续提取可以提高甲醇提取物的提取率。
28.该方法能同时提高甲醇提取物的提取率以及粗脂质中中性脂的含量，并且提取物总量可达39％，能有效减少提取后藻渣的剩余量，为微藻生物质的应用提供新方法。
附图说明
29.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
30.图1是本发明实施例选择的栅藻sdec-28产物的传统提取方法a和连续提取b流程图；
31.图2为本发明实施例选择的栅藻sdec-28的产物粗多糖的抗氧化特性说明；
32.图3为本发明实施例选择的栅藻sdec-28甲醇提取物的抗黑色素瘤细胞效果说明图；
33.图4为本发明实施例选择的栅藻sdec-28的粗脂脂质组成说明图。
具体实施方式
34.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
35.下面结合实施例对本发明作进一步说明。
36.实施例1
37.微藻的培养
38.微藻coelastrella sp.sdec-28(保藏编号：cctcc m 20211488)单独提取的粗多糖、甲醇提取物、粗脂分别具有较好的抗氧化、抗癌和生物柴油生产特性，是一株具有多种高价值产物的优质藻株。微藻预先养殖在bg11培养基(常见淡水蓝藻和绿藻培养基)中。
39.sdec-28经过扩大培养以初始接种密度为0.5g/l接种于bg11培养基中，实验室微藻培养用的光生物反应器的材料为有机玻璃，总体积为3l，培养体系放置于人工气候室中，温度为25
±
1℃，光暗周期为24:0，光照强度为60μmol/m2/s。待到藻生长至稳定期，4000rpm
的转速下离心10min进行离心收获，得到藻泥。
40.微藻产物连续提取方法
41.一种高价值栅藻的产物三重提取和纯化方法，过程如图1所示，具体操作如下：
42.1、粗多糖的提取
43.取研磨后的sdec-28藻粉10g于烧杯中，加250ml水(1:25)，混合均匀后转移至圆底烧瓶(1000ml)的圆底烧瓶，加入液体体积不要超过烧瓶容积的1/3，以免溢出)中，放入适量沸石，热水回流两次，每次两小时。两次提取后均离心取上清液。合并两次上清液，60℃旋转蒸发仪浓缩(或冷冻干燥)使体积缩小为原来的1/4。得到水提物。醇沉：加入四倍体积的无水乙醇(80％乙醇)，缓慢加入，加入过程中不断用玻璃棒搅拌，在4℃静置12h，离心倾去上清，再加入4倍80％乙醇，超声10min(混合均匀)，静置12h，离心去上清，得到粗多糖，蒽酮硫酸法测定多糖含量。
44.2、甲醇提取物的提取
45.实施例1(1)中剩余藻泥，按干重1:20比例加入甲醇，用超声破碎仪在80％的超声频率下处理60min，后再次进行离心(4000rpm10min)，收集上清液，重复两次，氮吹浓缩，得到甲醇提取物，重量法确定含量。
46.3、粗脂的提取
47.实施例1(2)中剩余藻泥，按干重1:50比例加入氯仿/甲醇(2:1)混合溶液，用超声破碎仪在80％的超声频率下处理10min，后再次进行离心(4000rpm 10min)，将上清液倒入分液漏斗，再重复该操作。向分液漏斗中加入5ml 0.9％的nacl溶液，充分摇匀，静置15min，氮吹浓缩，得到粗脂，重量法得到含量。
48.产物提取率
49.粗多糖、甲醇提取物和粗脂的单独提取(提取方法分别与连续提取中相应提取物一致)和连续提取得率如表1所示，热水提法提取栅藻sdec-28粗多糖提取率为14％，其中多糖含量为81％；热水提后以甲醇做溶剂提取的高价值产物比单独提取的得率提高了5％；两步提取后粗脂的得率较单独提取有所降低。与单独提取相比，连续提取总产物提取率可达39％，极大地提高了产物得率，减少藻渣剩余。
50.表1三种产物传统提取方式和连续提取方式的提取率
[0051][0052]
连续提取由于第一步为热水提，提取过程会增加细胞膜的通透性，因此在甲醇提取时细胞内会更容易被提取，同时由于溶剂的不同不会导致甲醇提取物在第一步水提被提取出来，因此连续提取可以提高甲醇提取物的提取率。在连续提取中，由于第二步的溶剂为甲醇，脂质尤其是极性脂溶于甲醇，导致粗脂的提取率较一次提取偏低。
[0053]
实施例2
[0054]
微藻sdec-28中粗多糖的抗氧化特性测定
[0055]
取粗多糖加水配置至浓度0.5，1.0和2.0mg/ml。
[0056]
abts[2,2
’‑
联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]法，又称teac(trolox equivalent antioxidant capacity)法。abts与适当氧化剂作用后，会生成蓝绿色的abts阳离子自由基(abts
·
+)，在734nm波长处产生特征吸收峰，当抗氧化物质存在时，abts
·
+的生成会受到抑制，使吸光度降低。abts法操作简单，结果重复性较好，非常适合实验室的体外抗氧化能力测定。
[0057]
配制7mmol l-1
的abts自由基溶液及140mmol l-1
的过硫酸钾溶液。将5ml 7mmol l-1
abts自由基溶液与88μl 140mmol l-1
过硫酸钾溶液混匀，避光放置14h,使用前加水稀释至734nm处吸光度为0.7左右，即得abts自由基工作液。取3ml abts自由基工作液与1ml无水乙醇混匀，振荡10s后静置30min,作为对照组；将1ml不同浓度的多糖提取液与3ml abts自由基工作液混匀，振荡10s后静置6min,测定734nm处吸光度，重复测定3次，取平均值；以vc为阳性对照。按公式计算abts自由基清除率：
[0058][0059]
式中：a0为3ml abts自由基工作液+1ml无水乙醇的吸光度；
[0060]
a1为3ml abts自由基工作液+1ml多糖提取液的吸光度。
[0061]
sdec-28粗多糖的抗氧化特性如图2所示。随粗多糖浓度增加，abts自由基去除率提高，抗氧化能力增强。当sdec-28粗多糖浓度为0.5mg/ml时，abts自由基去除率就可达到92％，sdec-28粗多糖对abts自由基有很好的去除效果。
[0062]
实施例3
[0063]
栅藻sdec-28中甲醇提取物的抗黑色素瘤细胞活性测定
[0064]
1)取提取液母液(100mg/ml)，用甲醇分别稀释至50mg/ml、25mg/ml、10mg/ml、5mg/ml。取以上五组浓度的提取物100μl，分别加入10ml完全dmem培养基(含10％胎牛血清)，即获得提取物浓度分别为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、100μg/ml和50μg/ml的黑色素瘤细胞培养基。
[0065]
2)抗癌测定选用黑色素瘤a375细胞，用含有10％胎牛血清的dmem培养基，在37℃、5％ co2条件下培养，2—3天传代1次，实验用细胞为处于对数生长期的细胞。取a375细胞，用pbs缓冲液洗涤两次，加入胰酶消化液，调整细胞浓度至50000个/ml，接种于96孔板中，每孔接种200μl相应的细胞悬液。置于5％ co2，37℃培养箱中孵育4h(融合度达到40％)。待细胞状态趋于稳定，重新加入不同浓度提取物(终浓度为50、100、250、500、1000μg/ml)，同时设立空白对照组(不含甲醇和微藻提取物)和溶剂对照组(添加100μl甲醇至10ml完全培养基)。继续孵育24h后每孔加入10μlcck8溶液，并在培养箱孵育2h。用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞活力：
[0066][0067]
3)sdec-28甲醇提取物单独提取和连续提取对黑色素瘤细胞抑制的效果见图3，两种提取方式下的甲醇提取物在各个浓度下都对黑色素瘤细胞a375有抑制作用，并且随着浓
度的提高，抑制作用进一步加强，呈明显的剂量-效应关系。采用连续提取后，半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,ic50)从148.41降低至73.69μg/ml。可见采用连续提取，不仅提高了甲醇提取物的提取率，也提高了其抗癌生物活性。
[0068]
实施例3
[0069]
栅藻sdec-28中粗脂的脂质组成分布
[0070]
液液萃取分离法：将等体积50ml的两种溶剂石油醚(沸程90℃9120℃)和95％的含水甲醇加入到粗脂肪中，充分振荡后静置片刻，清晰分层后移去下层甲醇，再用同样量的甲醇重复萃取上层溶液2次；移去的甲醇再加入同量的石油醚重复萃取2次，基本上可以把中性脂和极性脂彻底分离，于石油醚中的为中性脂，于甲醇中的为极性脂，然后旋转蒸发去除溶剂，烘干至恒重，准确称重，计算中性脂和极性脂的含量。
[0071]
微藻的脂质分为两大类：中性脂和极性脂。中性脂主要由甘油三酯，固醇酯类，游离脂肪酸组成。微藻生物柴油是指微藻油脂(主要为甘油三酯)与醇类经转酯作用而形成的单烷基脂肪酸酯。直接提取粗油脂得率为20％，但其中中性脂仅占30％，中性脂占总藻粉的6％。采用连续提取，粗油脂得率为10％，其中可作为生物柴油原料的中性脂含量高达75％，中性脂提取率可达7.5％。
[0072]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：包括如下步骤：将栅藻收获后，热水提取，热水温度为75-90℃，收集上清液和藻泥a，上清液经醇沉，得粗多糖；向藻泥a中加入无水甲醇，超声提取，分别收集上清液和藻泥b，上清液为甲醇提取物；向藻泥b中加入氯仿和甲醇混合溶液，氯仿和甲醇的体积比为1.5-2.5:1，超声辅助提取，收集上清液，得到粗脂；所述栅藻的保藏编号为：cctcc m 20211488。2.根据权利要求1所述的微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：热水提取的时间为2-6h。3.根据权利要求2所述的微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：还包括将上清液进行浓缩的步骤，将浓缩后的水提物进行醇沉。4.根据权利要求3所述的微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：所述浓缩的方法为旋转蒸发浓缩或冷冻干燥。5.根据权利要求1所述的微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：所述醇沉中，每次醇沉，水提物与无水乙醇的体积比为1:3-5。6.根据权利要求5所述的微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：所述醇沉为两步醇沉，第一步醇沉中，无水乙醇加入后，在0-10℃静置10-15h，然后离心除去上清；第二步醇沉中，无水乙醇加入后，超声混匀，静置后除去上清，得到粗多糖。7.根据权利要求1所述的微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：超声提取的频率为800-1000w。8.根据权利要求1所述的微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：藻泥a的干重与甲醇的质量比为1:15-25。9.根据权利要求1所述的微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：还包括将甲醇提取物进行氮吹浓缩的步骤。10.根据权利要求1所述的微藻活性成分的连续提取方法，其特征在于：藻泥b干重与氯仿和甲醇混合溶液的质量比为1:40-60；优选的，超声辅助提取的频率为800-1000w
，
处理时间为5-15min；进一步优选的，超声辅助提取完毕后，向上清液中加入nacl溶液，充分摇匀，静置，氮吹浓缩后，得到粗脂；更进一步优选的，所述nacl溶液的质量百分数为0.5％-1％。

技术总结
本发明公开了一种微藻活性成分的连续提取方法，包括如下步骤：将栅藻收获后，热水提取，热水温度为75-90℃，收集上清液和藻泥A，上清液经醇沉，得粗多糖；向藻泥A中加入无水甲醇，超声提取，分别收集上清液和藻泥B，上清液为甲醇提取物；向藻泥B中加入氯仿和甲醇混合溶液，氯仿和甲醇的体积比为1.5-2.5:1，超声辅助提取，收集上清液，得到粗脂。该方法能同时提高甲醇提取物的提取率以及粗脂质中中性脂的含量，并且提取物总量可达39％，能有效减少提取后藻渣的剩余量，为微藻生物质的应用提供新方法。方法。方法。


技术研发人员：裴海燕 谢真
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/9/12