一种植物超长基因组DNA的提取方法

tris-hcl，ph8.0、25mm乙二胺四乙酸二钠，ph8.0、350mm山梨糖醇、0.1％十六烷基三甲基溴化铵组成。
11.进一步地，所述的酚/氯仿/异戊醇的体积比为25：24：1。
12.进一步地，所述的氯仿/异戊醇的体积比为24：1。
13.进一步地，所述的乙醇为70％的乙醇。
14.植物超长基因组dna的提取方法，具体步骤包括：
15.1)使用1-2g小麦的幼嫩叶片或者小麦胚芽鞘材料，在研钵中用液氮研磨至粉末状，转移粉末到含有20-40ml预冷的细胞核提取液中，并加入0.1％-0.2％的β-巯基乙醇，轻柔上下颠倒混匀，置于冰上；在冰上静置10min以上，待植物组织粉末完全溶解混匀后，分别采用miracloth滤布、40μm滤膜、30μm滤膜过滤一次；过滤后的提取液于4℃下，50-60rcf离心3-5min两次去除杂质，取上清，后1000-2500rcf离心5min，弃上清得到细胞核沉淀；用10ml细胞核提取液重悬细胞核沉淀，清洗2次，弃上清。
16.2)用5ml细胞核重悬缓冲液重悬洗涤后的细胞核沉淀，清洗一次，再次加入1-2ml细胞核重悬缓冲液；加入等体积的2
×
sds裂解液，同时在裂解液中加入0.05-1mg/ml的蛋白酶k和1-100ug/ml的rnase a；颠倒混匀后，于50℃金属浴或水浴锅中裂解0.5-2.5h。
17.3)裂解完成后，待裂解液冷却至室温，加入3ml的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提，10rpm混匀10min，4000g离心10min，用宽口枪头取上清加入到新的离心管；上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇抽提1次；再加入等体积的氯仿，抽提1次，取上清加入新的离心管中；加入0.7
×
体积的异丙醇溶液，轻轻混匀直到絮状沉淀析出；用移液器将絮状沉淀转移到1.5ml离心管中，用70％乙醇清洗两次，晾干30s，加水或te缓冲液过夜溶解dna。
18.本发明的植物超长基因组dna的提取方法获得的大于400kb的高质量dna。
19.本发明的植物超长基因组dna的提取方法获得的n50大于120kb的高质量dna。
20.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
21.1)本发明细胞核提取采用三次过滤的方法，可去除大部分植物碎片组织杂质，获得较纯净的细胞核，减少了提取后dna中的杂质。
22.2)本发明获得的dna长度有明显优势，无需进一步纯化去除小片段，就可获得长度大于485kb的片段。
23.3)本发明的方法提取的dna，无需经过hls等仪器的纯化，可直接进行超长文库构建测序，n50高达125.25kb，最长测序reads可达4.98mb。
24.4)本发明的方法提取的小麦dna、辣椒dna、南瓜dna、西瓜dna以及番茄dna都可获得大于400kb的高质量dna，其中小麦和辣椒的测序获得的n50均可达120kb。
附图说明
25.图1为本发明方法提取小麦基因组电泳图；
26.图2为本发明方法提取辣椒基因组电泳图；
27.图3为本发明方法提取南瓜基因组电泳图；
28.图4为本发明方法提取西瓜基因组电泳图；
29.图5为本发明方法提取番茄基因组电泳图；
30.图6为ctab法提取小麦基因组电泳图；
31.图7为neb试剂盒法提取番茄基因组电泳图。
具体实施方式
32.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
33.细胞核提取液的组成成分：0.5m蔗糖、10mm ph8.0tris-hcl、10mm ph 8.0乙二胺四乙酸二钠、80mm氯化钾、1％聚乙烯吡咯烷酮、350mm山梨糖醇、0.5％triton x-100、1mm精胺、1mm亚精胺、0.1％-0.2％巯基乙醇，在使用前加入。
34.细胞核重悬缓冲液的组成成分：150mm氯化钠、100mm ph8.0tris-hcl、25mm ph 8.0乙二胺四乙酸二钠、350mm山梨糖醇。
[0035]2×
sds裂解液的组成成分：20g/l十二烷基磺酸钠、150mm氯化钠、100mm ph8.0tris-hcl、25mm ph 8.0乙二胺四乙酸二钠、350mm山梨糖醇、0.1％十六烷基三甲基溴化铵。
[0036]
ctab法使用ctab裂解液组成成分：100mm ph8.0tris-hcl、20mm ph 8.0乙二胺四乙酸二钠、1.50m氯化钠、3％十六烷基三甲基溴化铵、1％聚乙二醇6000、0.5％亚硫酸钠、1％聚乙烯吡咯烷酮。
[0037]
实施例1
[0038]
1、细胞核提取和分离
[0039]
使用1-2g小麦的幼嫩叶片或者小麦胚芽鞘材料，在研钵中用液氮研磨至粉末状，转移粉末到含有20-40ml预冷的细胞核提取液中，并加入0.1％-0.2％的β-巯基乙醇，轻柔上下颠倒混匀，置于冰上；在冰上静置10min以上，待植物组织粉末完全溶解混匀后，分别采用miracloth滤布、40μm滤膜、30μm滤膜过滤一次；过滤后的提取液于4℃下，50-60rcf离心3-5min两次去除杂质，取上清，后在1000-2500rcf离心5min，弃上清得到细胞核沉淀；用10ml细胞核提取液重悬细胞核沉淀，清洗2次，弃上清。
[0040]
2、细胞核裂解
[0041]
用1-2ml细胞核重悬缓冲液重悬洗涤后的细胞核沉淀；加入等体积的2
×
sds裂解液，同时在裂解液中加入40ul 20mg/ml的蛋白酶k和20ul 10mg/ml的rnase a；颠倒混匀后，于50℃金属浴或水浴锅中裂解1.5h。
[0042]
3、dna抽提
[0043]
裂解完成后，待裂解液冷却至室温，加入3ml的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)溶液抽提，10rpm混匀10min，4000g离心10min，用宽口枪头取上清加入到新的离心管；上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提1次；再加入等体积的氯仿，抽提1次，取上清加入新的离心管中；加入0.7
×
体积的异丙醇溶液，轻轻混匀直到絮状沉淀析出；用移液器将絮状沉淀转移到1.5ml离心管中，用70％乙醇清洗两次，晾干30s，加水或te缓冲液过夜溶解dna。
[0044]
4、取2μldna在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图1所示，4.5v电压下运行18h的脉冲场电泳，marker m1最长片段为48.5kb，marker m2在胶图上能分散开的最大条带为485kb；dna集中在485kb以上，且短片段较少，使用该发明提取的dna进行nanopore三代建库，测序文库n50长度最高可达124kb。
[0045]
实施例2
[0046]
以辣椒果实为材料，使用本发明方法提取辣椒基因组dna，具体操作步骤同实施例1。
[0047]
取2μl dna在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图2所示，dna集中在485kb以上，且短片段较少，后续建库n50长度最高可达120kb，表明该方法提取的小麦dna无弥散现象，样品dna长度和完整性都较好，适用于三代ont建库。
[0048]
实施例3
[0049]
以南瓜的幼嫩叶片为材料，使用本发明方法提取南瓜基因组dna，具体操作步骤同实施例1。
[0050]
取2μl dna在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图3所示，dna集中在485kb以上，且短片段较少，表明该方法提取的南瓜dna无弥散现象，样品dna长度和完整性都较好。
[0051]
实施例4
[0052]
以西瓜的幼嫩叶片为材料，使用本发明方法提取西瓜基因组dna，具体操作步骤同实施例1。
[0053]
取2μl dna在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图4所示，dna集中在485kb以上，且短片段较少，表明该方法提取的西瓜dna无弥散现象，样品dna长度和完整性都较好。
[0054]
实施例5
[0055]
以番茄的幼嫩叶片为材料，使用本发明方法提取番茄基因组dna，具体操作步骤同实施例1。
[0056]
取2μl dna在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图5所示，dna集中在485kb以上，且短片段较少，表明该方法提取的西瓜dna无弥散现象，样品dna长度和完整性都较好。
[0057]
实施例6
[0058]
1、细胞核提取和分离
[0059]
使用1-2g小麦的幼嫩叶片或者小麦胚芽鞘材料，在研钵中用液氮研磨至粉末状，转移粉末到含有20-40ml预冷的细胞核提取液中，并加入0.1％-0.2％的β-巯基乙醇，轻柔上下颠倒混匀，置于冰上；在冰上静置10min以上，待植物组织粉末完全溶解混匀后，分别采用miracloth滤布、40μm滤膜、30μm滤膜过滤一次；过滤后的提取液于4℃下，1000-2500rcf离心5min，弃上清得到细胞核沉淀。
[0060]
2、细胞核裂解
[0061]
用2ml ctab裂解液重悬细胞核沉淀，同时在裂解液中加入40ul 20mg/ml的蛋白酶k和20ul 10mg/ml的rnasea；颠倒混匀后，于65℃金属浴或水浴锅中裂解1h。
[0062]
3、dna抽提
[0063]
裂解完成后，待裂解液冷却至室温，加入3ml的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)溶液抽提，10rpm混匀10min，4000g离心10min，用宽口枪头取上清加入到新的离心管；上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提1次；再加入等体积的氯仿，抽提1次，取上清加入新的离心管中；加入0.7
×
体积的异丙醇溶液，轻轻混匀直到絮状沉淀析出；用移液器将絮状沉淀转移到1.5ml离心管中，用70％乙醇清洗两次，晾干30s，加水或te缓冲液过夜溶解dna。
[0064]
4、取2μldna在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，如图6所示，片段集中在50-200kb左右，很难获得长度超过400kb的片段，不利于后续超长dna建库测序。
[0065]
实施例7
[0066]
以番茄嫩叶为材料，使用monarch hmw组织dna提取试剂盒(neb#t3060)提取dna，获得dna长度如图7所示，片段集中在50-200kb左右，很难获得较长的片段，不利于后续的超长dna建库测序。

技术特征：
1.一种植物超长基因组dna的提取方法，其特征在于，将植物幼嫩的组织研磨成粉末后加入到细胞核提取液中，通过过滤和离心得到细胞核沉淀；用细胞核重悬缓冲液重悬细胞核，然后加入sds裂解液；后用酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇和氯仿抽提，取上清加入异丙醇获取dna沉淀，用乙醇清洗后晾干。2.根据权利要求1所述的植物超长基因组dna的提取方法，其特征在于，所述的细胞核提取液由0.5m蔗糖、10mm tris-hcl，ph8.0、10mm乙二胺四乙酸二钠，ph 8.0、80mm氯化钾、1％聚乙烯吡咯烷酮、350mm山梨糖醇、0.5％triton x-100、1mm精胺、1mm亚精胺、0.1％-0.2％巯基乙醇组成。3.根据权利要求1所述的植物超长基因组dna的提取方法，其特征在于，所述的细胞核重悬缓冲液由150mm氯化钠、100mm tris-hcl，ph8.0、25mm乙二胺四乙酸二钠，ph8.0、350mm山梨糖醇组成。4.根据权利要求1所述的植物超长基因组dna的提取方法，其特征在于，所述的sds裂解液由20g/l十二烷基磺酸钠、150mm氯化钠、100mm tris-hcl，ph8.0、25mm乙二胺四乙酸二钠，ph8.0、350mm山梨糖醇、0.1％十六烷基三甲基溴化铵组成。5.根据权利要求1所述的植物超长基因组dna的提取方法，其特征在于，所述的酚/氯仿/异戊醇的体积比为25∶24∶1。6.根据权利要求1所述的植物超长基因组dna的提取方法，其特征在于，所述的氯仿/异戊醇的体积比为24∶1。7.根据权利要求1所述的植物超长基因组dna的提取方法，其特征在于，所述的乙醇为70％的乙醇。8.根据权利要求1-7任一所述的植物超长基因组dna的提取方法，其特征在于，具体步骤包括：1)使用1-2g小麦的幼嫩叶片或者小麦胚芽鞘材料，在研钵中用液氮研磨至粉末状，转移粉末到含有20-40ml预冷的细胞核提取液中，并加入0.1％-0.2％的β-巯基乙醇，轻柔上下颠倒混匀，置于冰上；在冰上静置10min以上，待植物组织粉末完全溶解混匀后，分别采用miracloth滤布、40μm滤膜、30μm滤膜过滤一次；过滤后的提取液于4℃下，50-60rcf离心3-5min两次，去除杂质，取上清，1000-2500rcf离心5min，弃上清得到细胞核沉淀；用10ml细胞核提取液重悬细胞核沉淀，清洗2次，弃上清。2)用5ml细胞核重悬缓冲液重悬洗涤后的细胞核沉淀，清洗一次，再次加入1-2ml细胞核重悬缓冲液，加入等体积的2
×
sds裂解液；颠倒混匀后，于50℃金属浴或水浴锅中裂解0.5-2.5h。3)裂解完成后，待裂解液冷却至室温，加入3ml的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提，10rpm混匀10min，4000g离心10min，用宽口枪头取上清加入到新的离心管；上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇抽提1次；再加入等体积的氯仿，抽提1次，取上清加入新的离心管中；加入0.7
×
体积的异丙醇溶液，轻轻混匀直到絮状沉淀析出；用移液器将絮状沉淀转移到1.5ml离心管中，用70％乙醇清洗两次，晾干30s，加水或te缓冲液过夜溶解dna。9.权利要求1-8任一所述的植物超长基因组dna的提取方法获得的大于400kb的高质量dna。10.权利要求1-8任一所述的植物超长基因组dna的提取方法获得的n50大于120kb的高
质量dna。

技术总结
本发明公开了一种植物超长基因组DNA的提取方法，属于植物分子生物学技术领域。本发明的植物超长基因组DNA的提取方法，将植物幼嫩的组织研磨成粉末后加入到细胞核提取液中，通过过滤和离心得到细胞核沉淀；用细胞核重悬缓冲液重悬细胞核，然后加入SDS裂解液；后用酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇和氯仿抽提，取上清加入异丙醇获取DNA沉淀，用乙醇清洗后晾干。本发明获得的DNA长度有明显优势，无需进一步纯化去除小片段，就可获得长度大于485Kb的片段。就可获得长度大于485Kb的片段。就可获得长度大于485Kb的片段。


技术研发人员：鹿东东 李博生 李珊珊 刘彩娟 刘艳霞
受保护的技术使用者：北京大学现代农业研究院
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/9/12