一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸及其应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸及其应用。


背景技术：

2.细胞间质上皮转换因子(cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-met)，为受体酪氨酸激酶家族成员。c-met信号通路在正常细胞中很难完全激活，但在癌细胞中频繁激活，促使肿瘤形成、侵袭性生长和转移。研究显示，c-met信号通路在多种类型的实体瘤中如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、大肠癌等均存在异常表达或突变，在肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用。目前，癌症是威胁人类健康的主要“杀手”，且预后不良。目前针对c-met靶点的靶向药物寥寥无几，c-met突变不仅会导致癌症的产生，同时也是导致抗癌药物耐药的一个主要原因。因此，新型生物治疗手段的开发是目前亟待解决的问题。
3.近几年，核酸治疗成为研究的热点。核酸药物的快速发展标志着该领域的新时代，为继小分子药物、抗体之后的现代新药第三次浪潮。与靶向蛋白质的常规治疗手段相比，核酸药物能够通过抑制、编辑、添加或替换手段调节基因表达，从而对疾病产生长期甚至治愈的效果。小核酸药物能够从源头进行干预，具有“治标治本”的特点。其中，三链形成寡核苷酸可以通过hoogsteen氢键以序列特异性方式与双链dna大沟位置结合，形成三链dna，也称之为靶向基因组dna的反基因技术。三链dna在基因诊断和测序技术等基因靶向技术发展中具有巨大潜力。其次，tfo可以特异性靶向与疾病密切相关的异常基因启动子序列，形成稳定的三链dna结构，阻碍转录起始复合物的形成，从而抑制基因的表达，是实现潜在靶标靶向治疗的新途径，有着广阔的应用前景。到目前为止，三链形成寡核苷酸已成功应用于多个基因调控表达及相关疾病治疗研究，如c-myc、survivin、bcl-2、met、cyclin d1、htert和her2等。
4.目前，天然的碱基不能特异性识别靶序列内多聚嘌呤核苷区域内的嘧啶位点，如cg或ta碱基对，严重影响反平行三链dna的形成及稳定性，称之为cg或ta反转位点(如图1所示)。针对cg反转位点选择性识别难题。基于额外氢键位点构建策略和pka增强设计策略，本技术提出一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸及其应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸及其应用，其可以有效降低细胞间质上皮转换因子(c-met)基因表达及抑制肿瘤细胞增殖的能力。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸，所述三链形成寡
核苷酸能与细胞间质上皮转换因子基因启动子核心区域形成三链dna的寡核苷酸序列。
8.优选地，包括以下几种三链形成寡核苷酸，其序列如下：
9.c-met-t 5
’‑
aaggagggzggagazggggzg-3’z＝dt
10.c-met-3me 5
’‑
aaggagggzggagazggggzg-3’z＝
3me
ap-ψdc。
11.优选地，所述三链形成寡核苷酸通过化学修饰具体为序列5’端第九和十五个核苷酸采用2
’‑
脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dt)或2-氨基-3-甲基吡啶基-2
’‑
脱氧假胞嘧啶核苷酸(
3me
ap-ψdc)。
12.优选地，所述三链形成寡核苷酸通过3’端丙氨基修饰得下列三链形成寡核苷酸：
13.c-met-t-pa
[0014]5’‑
aaggagggzggagazggggzg-ch2ch2ch2nh
2-3’z＝dt
[0015]
c-met-3me-pa
[0016]5’‑
aaggagggzggagazggggzg-ch2ch2ch2nh
2-3’z＝
3me
ap-ψdc。
[0017]
本发明还提供了一种采用上述的一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸在制备治疗肿瘤发生和生长药物中的应用。
[0018]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0019]
本发明通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验、体外转录抑制实验、细胞增殖抑制实验证明了这些三链形成寡核苷酸可与启动子核心区域形成稳定的三链dna结构，抑制c-met基因的转录水平；本发明能够有效降低细胞间质上皮转换因子(c-met)基因表达及抑制肿瘤细胞增殖的能力。
附图说明
[0020]
图1为本发明背景技术中的cg反转位点(a)及2-氨基-3-甲基吡啶基-2
’‑
脱氧假胞嘧啶核苷(
3me
ap-ψdc，b)的示意图；
[0021]
图2为本发明实施例2的tfo与c-met靶序列间三链dna形成能力评价实验结果图；
[0022]
图3为本发明实施例4中处理组和对照组的c-met的相对表达量柱状图；
[0023]
图4为本发明实施例5中处理组和对照组的细胞增殖效果柱状图。
具体实施方式
[0024]
下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]
本发明针对细胞间质上皮转换因子(cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-met)基因在肿瘤细胞中高丰度表达的现状，设计了针对c-met的三链形成寡核苷酸。具体的，本发明所述三链形成寡核苷酸的序列为针对c-met核酸序列的chr7:116672038-116672058位点设计(human genome,grch38/hg38，dec,2013序列)，其序列具体如下，以下简称为c-met-t和c-met-3me。
[0026]
c-met-t 5
’‑
aaggagggzggagazggggzg-3’z＝dt
[0027]
c-met-3me 5
’‑
aaggagggzggagazggggzg-3’z＝
3me
ap-ψdc
[0028]
具体的，三链形成寡核苷酸可以通过3’端丙氨基修饰得下列三链形成寡核苷酸序列，以下简称为c-met-t-pa和c-met-3me-pa。
[0029]
c-met-t-pa
[0030]5’‑
aaggagggzggagazggggzg-ch2ch2ch2nh
2-3’z＝dt
[0031]
c-met-3me-pa
[0032]5’‑
aaggagggzggagazggggzg-ch2ch2ch2nh
2-3’z＝
3me
ap-ψdc
[0033]
实施例1：tfo及相应靶双链的合成
[0034]
1.tfo的合成
[0035]
c-met-t-pa
[0036]5’‑
aaggagggzggagazggggzg-ch2ch2ch2nh
2-3’z＝dt
[0037]
c-met-3me-pa5
’‑
aaggagggzggagazggggzg-ch2ch2ch2nh
2-3’z＝
3me
ap-ψdc
[0038]
c-met-pu 3
’‑
tgtaacggggagaaggagaaggtt-5’[0039]
c-met-py-fam 5
’‑
fam-acattgcccctcttcctcttccaa-3’[0040]
其中，编号c-met-pu和c-met-py-fam退火为双链c-met靶序列。以上寡核苷酸均在beckman-oligo1000 dna合成仪上，用磷酰胺三酯固相法，以1.0μmol规模合成。
[0041]
2.寡核苷酸的纯化
[0042]
固相载体装入可密封小瓶，注入1ml浓氨水，盖紧瓶口，55℃加热过夜，并通过逆向高效液相色谱仪纯化，条件如下，目标产物冻干收集；
[0043]
色谱柱:nacalai tesque cosmosil 5c18-ms-ii,10
×
250mm；
[0044]
洗脱剂:a:0.1m triethylamineacetate(teaa)buffer(ph＝7.0),b:ch3cn；
[0045]
洗脱程序:b for 10-40％/20min；
[0046]
流速：3.0ml/min；检测波长:254nm；柱温：35℃；
[0047]
以上产物溶于5％醋酸溶液，室温反应30分钟，并通过逆向高效液相色谱仪纯化，条件如下，目标产物冻干收集；
[0048]
色谱柱：shiseido mg-i c18,4.6
×
250mm；
[0049]
洗脱剂:a:0.1m teaabuffer(ph 7.0),b:ch3cn；
[0050]
洗脱程序：b:8％to 20％/20min；
[0051]
流速:1.0ml/min；检测波长:254nm；柱温:55℃；
[0052]
以上所有寡核苷酸序列溶于去离子水，测a
260
，计算浓度，-20℃保存。
[0053]
实施例2：tfo与c-met靶序列间三链dna形成能力评价
[0054]
本实施例对上述合成的tfo和c-met靶序列共同孵育，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析所述的tfo对c-met靶序列的三链dna形成能力。具体实验步骤如下：
[0055]
按照如下表格内容准备10μl反应体系：
[0056]
[0057][0058]
具体地，将c-met-pu和c-met-py-fam与4xtfo结合缓冲液(20mm tris-hcl，20mm mgcl2，ph 7.5)混合，在95℃条件下加热3分钟，关闭热源缓慢降至室温，依次加入tfo溶液(终浓度为0-1000nm)和去离子水，反应体系在37℃条件下孵育12小时，加入2x上样缓冲液终止反应。使用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶4℃，140v电泳4小时。使用发光图像分析仪las-4000(fujifilm)对凝胶进行可视化，并量化每个条带的荧光强度以计算结合常数ks。ks(106m-1
)＝[三链dna]/([tfo][双链dna])。重复三次计算ks值的标准偏差(
±
s.d.)。
[0059]
实验结果分析
[0060]
请参阅图2，其为本实施例中聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，荧光素标记的靶双链可全部与c-met-3me-pa结合，生成迁移率更低的三链dna复合物。
[0061]
实施例3：
[0062]
本实施例选择hela、mcf7、a549、lovo和ht29五种不同肿瘤细胞作为转染目标，并对每种细胞分别进行c-met-t-pa和c-met-3me-pa的转染实验，上述所有细胞购自atcc细胞库。
[0063]
具体地，在转染实验前每种细胞均先进行贴壁培养，并在换液后将细胞重悬于不含双抗的完全培养基中，上述所有细胞使用的完全培养基为10％fbs+dmem培养基。
[0064]
上述转染实验包括以下步骤：
[0065]
(1)细胞铺板：细胞计数后，将1.0x104个细胞(共0.5ml)每孔接种于24孔板培养皿中；
[0066]
(2)转染试剂准备：配置a液和b液，其中a液为：opti-mem 100μl+lipo2000；b液为：opti-mem 100μl+tfo，室温静置5分钟；将b液缓慢滴加到a液中，静置15分钟制得转染复合物；其中上述tfo相对于体系的终浓度为400nm和800nm；lipo2000和tfo的质量比为2.5:1。
[0067]
(3)将上述的转染复合物加入已去除培养基的24孔板中，置于培养箱中继续培养4小时；加入1ml新的完全培养基继续孵育。
[0068]
上述步骤(2)制备包含任何tfo的转染复合物作为阴性对照。按照上述步骤操作后可获得分别转染所述c-met-t-pa、c-met-3me-pa的hela、mcf7、a549、lovo和ht29细胞(以下简称“处理组”)以及转染lipo2000阴性对照的hela、mcf7、a549、lovo和ht29细胞(以下简称“对照组”)。
[0069]
实施例4：
[0070]
本实施例通过qrt-pcr实验对实施例3中获得的分别转染两种tfo的细胞和阴性对照细胞中的c-met表达水平进行检测，实验包括以下步骤：
[0071]
1.总rna提取
[0072]
(1)取实施例3中培养24小时后的细胞，去除培养基，使用pbs清洗细胞一次；
[0073]
(2)选取qiagen ran提取试剂盒(rneasy mini kit)，并按照说明书流程操作；
[0074]
(3)加50μl无rna酶水溶解总rna，分光光度计检测总rna浓度和纯度，并将其保存在-80℃冰箱。
[0075]
2.逆转录
[0076]
取500ng上述总rna，用thermo fisher scientific反转录试剂盒(verso cdna synthesis kit)，并按照说明书流程操作(20μl反应体系)得到cdna产物并将其保存于-20℃冰箱。
[0077]
3.荧光定量pcr反应
[0078]
(1)按照下表配置反应体系，设置荧光定量pcr仪的参数为95℃ 60s,1cycles；95℃ 15s,60℃ 30s,40cycles。
[0079][0080][0081]
其中，针对c-met基因，上游引物(f):5’caggcagtgcagcatgtagt3’，下游引物(r):5’gatgattccctcggtcagaa3’；针对gapdh基因，上游引物(f):5’ggagtccctgccacactca3’，下游引物(r):5’gcccctcccctcttcaag3’。
[0082]
(2)每个样品的循环阈值(ct)归一化为gapdh基因的循环阈值(ct)。使用δδct方法计算基因表达水平，其中将每个样品的δct与对照的δct进行比较，然后根据仅用转染试剂处理的细胞的基因表达水平进行归一化。
[0083]
4.实验结果分析
[0084]
请参阅图2，其为本实施例中处理组和对照组的hela、mcf7、a549、lovo和ht29细胞的c-met相对表达量的柱状图。其中，对照组细胞的c-met相对表达量显著降低，证明所述的c-met-t-pa和c-met-3me-pa均具有敲低肿瘤细胞中c-met表达的作用。
[0085]
实施例5：
[0086]
本实施例对实施例1中制得的tfo进行mts实验以检测所述的寡核苷酸对肿瘤细胞增殖能力的影响。具体实验步骤如下：
[0087]
(1)细胞准备：参见上述实施例3中操作步骤。
[0088]
(2)细胞铺板：细胞计数后，将3000个细胞(共0.2ml)每孔接种于96孔板培养皿中；
[0089]
(3)转染试剂准备：配置a液和b液，其中a液为：opti-mem 50μl+lipo2000；b液为：opti-mem 50μl+tfo，室温静置5分钟；将b液缓慢滴加到a液中，静置15分钟制得转染复合物；其中上述tfo相对于体系的终浓度为50nm至400nm；lipo2000和tfo的质量比为2.5:1。
[0090]
(4)将上述的转染复合物加入已去除培养基的96孔板中，置于培养箱中继续培养4小时；加入100μl新的完全培养基继续孵育。
[0091]
上述步骤(3)制备包含任何tfo的转染复合物作为阴性对照。按照上述步骤操作后可获得分别转染所述c-met-t-pa、c-met-3me-pa的hela、mcf7、a549、lovo和ht29细胞(以下简称“处理组”)以及转染lipo2000阴性对照的hela、mcf7、a549、lovo和ht29细胞(以下简称“对照组”)。
[0092]
(5)mts检测：待细胞培养48-72小时后，在每孔中加入10μl mts溶液，避光培养4小时，用多功能酶标仪检测490nm处的吸光值。
[0093]
(6)根据吸光值计算并分析细胞增殖水平。
[0094]
实验结果分析：
[0095]
请参阅图4，其为本实施例中处理组和对照组的hela、mcf7、a549、lovo和ht29细胞的抗增殖效果柱状图。从图中可知，对照组的细胞增殖活力明显高于处理组。由此可见，通过转染tfo敲低c-met后，肿瘤细胞的增殖能力明显减弱。随着tfo浓度的增加，对肿瘤细胞的增殖抑制能力也越强。
[0096]
本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸，其特征在于，所述三链形成寡核苷酸能与细胞间质上皮转换因子基因启动子核心区域形成三链dna的寡核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸，其特征在于，包括以下几种三链形成寡核苷酸，其序列如下：c-met-t5
’‑
aaggagggzggagazggggzg-3’z＝dtc-met-3me5
’‑
aaggagggzggagazggggzg-3’z＝
3me
ap-ψdc。3.根据权利要求2所述的一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸，其特征在于，所述三链形成寡核苷酸通过化学修饰具体为序列5’端第九和十五个核苷酸采用2
’‑
脱氧胸腺嘧啶核苷酸或2-氨基-3-甲基吡啶基-2
’‑
脱氧假胞嘧啶核苷酸。4.根据权利要求3所述的一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸，其特征在于，所述三链形成寡核苷酸通过3’端丙氨基修饰得下列三链形成寡核苷酸：c-met-t-pa5
’‑
aaggagggzggagazggggzg-ch2ch2ch2nh
2-3’z＝dtc-met-3me-pa5
’‑
aaggagggzggagazggggzg-ch2ch2ch2nh
2-3’z＝
3me
ap-ψdc。5.一种采用上述1-4任意一项所述的一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸在制备治疗肿瘤发生和生长药物中的应用。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一类抑制细胞间质上皮转换因子基因表达的三链形成寡核苷酸及其应用，该三链形成寡核苷酸能与细胞间质上皮转换因子基因启动子核心区域形成三链DNA的寡核苷酸序列。本发明通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验、体外转录抑制实验、细胞增殖抑制实验证明了三链形成寡核苷酸可与启动子核心区域形成稳定的三链DNA结构，抑制c-MET基因的转录水平。本发明能够有效降低细胞间质上皮转换因子(c-MET)基因表达及抑制肿瘤细胞增殖的能力。细胞增殖的能力。细胞增殖的能力。


技术研发人员：王磊 田岩 王晓
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/9/11