一种水稻OsLOX10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用

一种水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用
技术领域
1.本发明属于植物学和生物技术领域，具体涉及一种水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用。


背景技术：

2.脂氧合酶(lipoxygenase，简称lox；ec 1.13.11.12)又称脂肪氧化酶或脂肪氧合酶，是一种含非血红素铁或锰的双加氧酶，在生物体内专一催化具有顺,顺1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸(pufa)的加氧反应。在高等植物体中主要以不饱和脂肪酸中的亚麻酸(linolenic acid；lea)和亚油酸(linoleic acid；la)为反应底物。目前，在许多物种(大豆、玉米、拟南芥、水稻、大麦、番茄、马铃薯及茶树)等中均已发现loxs基因家族，其广泛存在于植物的不同器官和组织中，如植物的根、茎、叶、花、果实和种子等，且具有不同的表达丰度。
3.另一方面，植物在生活史中会面对各种生存压力，包括生物胁迫(病害、虫害)和非生物胁迫(干旱、低温、高温、盐胁迫及机械损伤等)。水稻是我国主要粮食作物，对于水稻的盐碱抗性的研究一直是领域内的热点。现有技术中，具有优良抗盐碱性能的水稻品种通常是通过以下两种方法获得，一方面是通过杂交的方式，另一方面是通过基因编辑技术。针对基因编辑技术，已有通过编辑水稻oscsn5基因、osg2基因、onac103基因等调节水稻的抗盐碱性能的报道。但是通过oslox10基因调节水稻的抗盐碱胁迫性未见相关的报道。
4.技术方案
5.为了获得一种新的具有良好盐碱胁迫抗性的水稻品种，本发明提供了一种水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其中oslox10基因为如seq no:1所示的基因或其互补基因，本专利中oslox10基因也称为lox10基因。
6.本发明首先提供一种敲除oslox10基因的方法包括：通过选定oslox10敲除靶点，通过pcr扩增以引入靶点，最后利用golden gate克隆法构建该基因的crispr/cas9敲除载体。其中oslox10敲除靶点oslox10-cas9-t1如seq no:2示；oslox10-cas9-t2:如seqno:3所示。
7.oslox10-cas9-t1:ataatggtctctggcgggatcatcgacaccatcacgttttagagctag；
8.oslox10-cas9-t2:attattggtctctaaacccatgcccttgagccgcgacgcttcttggtgcc。
9.本发明进一步包括基于上述方法制备得到的基因敲除载体，通过农杆菌将携带有oslox10-crispr-cas9敲除靶点的载体dna片段整合到水稻愈伤组织细胞中并诱导分化成苗。
10.本发明进一步提供一种过表达oslox10基因的方法包括：以包含目的基因的质粒作为模板进行pcr扩增，然后进行连接转化构建oslox10过表达载体，通过农杆菌将过表达载体整合到水稻愈伤组织细胞中并诱导分化成苗；其中所述pcr扩增中，引物如下：oslox10-oe-f如seq no:5，oslox10-oe-r如seq no:6所示。
11.其中：
12.oslox10-oe-f：ggactcttgaccatggcagcagccgcaggcgag；
13.oslox10-oe-r：ggaaattcgagctggtcacctcagatggaggcgctg。
14.本发明进一步提供一种通过调节lox10在水稻中的表达，影响水稻幼苗对盐碱胁迫的抗性的方法。
15.本发明通过对在光照培养箱将水稻幼苗培养至3叶期，然后用25mm na2co
3 ph＝10.0处理5d,然后复水7d并统计存活率。本发明通过实验发现，oslox10基因过表达增强了水稻对盐碱胁迫的抗性。
16.本发明中，为了获得良好的水稻抗盐碱胁迫性，所述过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量或表达活性为：通过荧光定量分析，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，oslox10基因的相对表达量不小于100倍，优选地，oslox10基因的相对表达量为100～150倍。
17.本发明中，所述碱胁迫抗性是碱性环境下的胁迫抗性，特别是ph值不小于10.0的碱性环境的水稻盐碱胁迫抗性。
18.本发明通过实验发现，oslox10基因过表达增强了水稻幼苗对盐碱胁迫的抗性。对于ph＝10的盐碱胁迫，其第5天过表达植株的活性明显高于空白样和基因敲除植株。复水7天后的植株，oslox10基因过表达植株的存活率明显高于空白样和基因敲除植株。对于过表达苗，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，oslox10基因优选的相对表达量为100～150倍，在此范围内水稻盐碱胁迫抗性更优。
附图说明
19.图1为：oslox10基因cds扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果示意图；
20.其中，m＝dl5000marker；2：lox10。
21.图2为：oslox10基因敲除和过表达载体的构建示意图。
22.图3为：农杆菌介导水稻遗传转化流程图。
23.图4为：oslox10基因突变类型示意图。
24.图5为：oslox10基因相对表达量检测结果。
25.图6为：oslox10基因过表达增强了水稻幼对盐碱胁迫的抗性；
26.其中，a:oslox10基因过表达盐碱胁迫处理图，b:复水7d后的存活率。
具体实施方式
27.本发明提供以下具体实施例，用于对本发明的技术方案进行进一步的说明。
28.本实施例首先提供一种水稻oslox10基因的克隆方法。
29.经ncbi网站查询后设计相应引物，以水稻kitaake cdna为模板，克隆得到oslox10基因基因。其扩增引物如下：lox10-cds-f如seq no:7，lox10-cds-r如seq no:8。
30.lox10-cds-f：aggtagctagtagtacgatgcag
31.lox10-cds-r：acacgagaagagaaatgttgct
32.采用toyobo公司提供的pcr扩增酶kod fx dna polymerase进行扩增，pcr扩增体系：primer star 10μl，ddh2o 7μl，primer-f 1.5μl，primer-r 1.5μl，模板dna1μl。样品添加后混匀离心，pcr扩增程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸
90s，共34cycle；72℃延伸10min；4℃恒温。即从kitaake中获得oslox10基因cds。扩增后利用琼脂糖凝胶电泳将pcr产物进行检测，将扩增产物通过胶回收后送往公司测序，即从kitaake中获得oslox10基因cds。经测序，oslox10基因的cds区具有如seq no:1所示序列或其互补序列的基因；oslox10基因编码的蛋白具有如seq no:2所示的氨基酸序列。
33.本实施例的第二方面是提供一种oslox10基因敲除载体的构建方法。
34.将oslox10基因的登录号loc_os11g36719登录到crispr-plant(https://www.genome.arizona.edu/crispr/crisprsearch.html)网站进行crispr/cas9敲除靶点的预测，同时在编码区的不同区段或蛋白质活性部位选择合适的靶点序列作为grna靶点(如下红色即为靶点)，然后将靶点序列登录到crispr rgen tools(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)网站进行脱靶分析。然后选定如下靶点，其中oslox10敲除靶点oslox10-cas9-t1如seq no:3示；oslox10-cas9-t2:如seqno:4所示。
35.oslox10-cas9-t1:ataatggtctctggcgggatcatcgacaccatcacgttttagagctag
36.oslox10-cas9-t2:attattggtctctaaacccatgcccttgagccgcgacgcttcttggtgcc
37.然后通过pcr扩增以引入靶点。最后利用golden gate克隆法构建phue411该基因的crispr/cas9敲除载体。
38.重组质粒转化dh5α粒感受态细胞
39.1.取5μl连接产物转移置分装好的dh5α的感受态细胞轻轻混匀后于冰上静置30min左右。
40.2.于42℃热激90s后置于冰上3min。
41.3.加入500μl lb液体培养基后于220rpm 37℃摇床复苏培养1h。
42.4.取出后3000rpm离心3min。收集沉淀约100μl均匀涂布于kan平板。置于37℃培养箱过夜培养。
43.5.挑选单菌落送往公司次序，及成功构建lox10-cas9载体。选用载体提供的特异性测序引物：osu3-fd3如seq no:9，tau3-rd如seq no:10。
44.osu3-fd3：5'-gacaggcgtcttctactggtgctac-3'
45.tau3-rd：5'-ctcacaaattatcagcacgctagtc-3'
46.重组质粒的提取
47.取将测序正确的阳性菌株转移置含kan的lb液体培养基中进行扩大培养(50ml左右)后进行质粒提取。质粒提取采用上海生工生物工程有限公司提供的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒，具体步骤见其说明书。
48.重组质粒转化农杆菌(eha105)感受态细胞
49.(1)农杆菌感受态细胞(eha105)的制备，具体步骤：
50.1.将超低温保存的eha105甘油菌于冰上缓慢解冻，待超净台灭菌后将其在含rif抗性的固体培养基中划线，在28℃的暗培养箱中培养2～3d。
51.2.挑选生长状态良好的单菌落转移置含有rif抗性的液体lb培养基中，180rpm，28℃暗培养。
52.3.待od值达到0.4～0.6后将其置冰浴30min。
53.4.4℃5000rpm离心10min，去上清液后向菌体沉淀中加入10ml 0.15mol/l的冰nacl，菌体重悬后4℃5000rpm离心10min。
54.5.收集菌体沉淀并加入1ml 0.02mol/l的冰cacl2后吹打混匀使细胞悬浮。
55.6.加入等体积预冷的30％的甘油，此时eha105感受态细胞已制备完毕，分装(每管50μl)后可用于重组质粒的转化，或液氮速冻后于-80℃保存。
56.(2)感受态细胞(eha105)的转化，具体步骤：
57.1.取1ug的重组质粒转移置分装好的eha105感受态细胞中，混匀后置于冰上30min。
58.2.液氮速冻3min，接着37℃温浴3min，再冰浴3min。
59.3.加入500μl的lb液体培养基后于28℃180rpm摇床复苏培养5h左右。
60.4.取出后3000rpm离心3min。收集菌液约100μl吹打混匀后涂于含有kan和rif平板。置于28℃的暗培养箱中培养2～3d。
61.5.挑选单克隆菌落转移至含有kan和rif抗性的lb液体培养基中，放置于28℃180rpm摇床培养36h左右，待菌液混浊后进行pcr检测，阳性菌液可直接在含有kan和rif抗性的固体培养基上划线进行愈伤组织的侵染，也可加入等体积30％的甘油速冻后于-80℃冰箱保存。
62.本实施例的第三方面是提供一种oslox10基因超表达载体的构建方法。
63.本实验以camv 35s双向驱动的pcambia-1302载体为基础构建了该基因的过量表达融合载体，通过对载体序列和该基因的cds序列分析后，以ncoi和bsteii为酶切位点设计了带载体酶切位点同源末端的过表达扩增引物，其中所述pcr扩增中，引物如下：oslox10-oe-f如seq no:5，oslox10-oe-r如seq no:6所示，如下：
64.oslox10-oe-f：ggactcttgaccatggcagcagccgcaggcgag
65.oslox10-oe-r：ggaaattcgagctggtcacctcagatggaggcgctg
66.以包含目的基因的质粒作为模板，采用vazyme公司提供的高保真酶进行pcr扩增，然后进行连接转化，并送往公司测序，将测序正确的菌液提取质粒后进行农杆菌转化，及成功构建oslox10过表达载体。
67.本实施例的第四方面是农杆菌介导水稻遗传转化及转基因苗检测。
68.1.材料准备
69.挑选当年新收的饱满的水稻种子，本发明中选取kitaake水稻种子，剥去外壳，注意去壳时保持胚的完整性以确保发芽率，每个品种约30～50粒左右。
70.2.洗种
71.将去壳的水稻种子于灭菌三角瓶中用无菌水清洗3～5次，以清除杂质，若杂质比较多可用无菌水多清洗几次。用75％的乙醇溶液表面消毒3min。再用2.5％的naclo溶液消毒10min左右，期间可将其置于摇床轻轻摇动以达到更好的消毒效果。最后用灭菌水清洗3～5次后于超净台吹干。
72.3.愈伤组织的诱导及继代
73.将洗种处理的水稻种子转移到nb诱导培养基上，注意让种胚接触到培养基,然后于28℃暗培养约12d后进行去芽继待培养。
74.4.农杆菌转化水稻愈伤组织
75.(1)菌体活化
76.将-80℃保存的阳性农杆菌菌液划线于含kan(50mg/l-1
)和rif(50mg/l-1
)抗性的
平板，倒置于28℃培养箱暗培养2d左右。
77.(2)愈伤组织的筛选
78.挑选生长状态良好、结构致密、颜色亮黄及大小适中的愈伤组织于28℃预培养2～3d。
79.(3)愈伤组织的侵染
80.1.用枪头吸取适量aam液(含100μm的as)在划线平板上轻轻吹打使菌液悬浮混匀，将悬浮菌液转移至灭菌的培养皿中并调整其od为0.2～0.3，密封后于28℃暗培养箱复苏1h。
81.2.取适量预培养的水稻愈伤组织转移至已活化农杆菌侵染液中并轻轻摇动侵染3～5min。
82.3.侵染结束后将愈伤组织转移至无菌滤纸上，放置于超净台吹10min左右。然后转移至含有100umdas的共培养培养基上，28℃培养1～2d。
83.4.最后转移到含500mg/lcar和50mg/lhyg的筛选培养基(筛1)中进行愈伤组织的筛选培养。
84.(4)抗性愈伤组织的筛选
85.在筛选过程中，非抗性愈伤组织会出现黑死、褐化及活力下降等现象，而抗性愈伤组织在培养一段时间后又可长出新的愈伤组织。将这些新生愈伤组织再依次进行第2代和第3代的筛选培养。
86.(5)预分化及分化培养
87.经筛选获得的生长状态良好的抗性愈伤组织可转移至预分化培养基中，于28℃光照条件进行培养，待其出现绿点或部分愈伤组织长出绿芽时可将其转移至分化培养基进行培养。
88.(6)生根培养
89.将分化形成的小苗移至生根培养基中继续培养一段时间。
90.(7)炼苗
91.小苗在生根培养基中生长一段时间后可将其转移至营养液或营养土中培养，让其适应外界或大田环境,即获得相应的转基因植株。
92.6.敲除植株和过表达植株的检测
93.利用特异性引物检测获得两个纯合的敲除植株，其突变类型如下：
94.lox10突变类型
95.同时设计相应的荧光定量引物，对过表达植株的表达量进行检测，引物如下：lox10-qpcr-f如seq no:11，lox10-qpcr-r如seq no:12。
96.lox10-qpcr-f：ttccttctcaccatcactaa
97.lox10-qpcr-r：gttcttctccacctccaa
98.本实施例的第五方面是分别基于oslox10基因敲除植株和oslox10基因过表达植株得到的种子培育得到水稻幼苗，提供一种水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用。
99.在光照培养箱将水稻幼苗培养至3叶期，然后用25mm na2co
3 ph＝10.0处理5d,然后复水7d并统计存活率，如图6所示。实验结果表明oslox10过表达增强了水稻幼对盐碱胁
迫的抗性。
100.本发明基于水稻通过对oslox10基因敲除和过表达制备筛选出相应的植株，并基于由相应植株幼苗进行耐盐碱胁迫实验。参见图6-a，图6-b所示。其中，图6-a第一行：由左至右依次为野生苗(作为空白样，标记为wt)和转基因苗(从左至右依次为lox10-1，lox10-2，lox10-oe1，lox10-oe2)经光照培养箱将水稻幼苗培养至3叶期的植株，图6-a第二行：用25mm na2co
3 ph＝10.0处理5天的植株，图6-a第三行：复水7天的植株。
101.本发明通过实验发现，oslox10基因过表达增强了水稻幼对盐碱胁迫的抗性。参见图6-b所示，对于ph＝10的盐碱胁迫，其第5天oslox10过表达植株(lox10-oe1，lox10-oe2)的存活率明显高于空白样(wt)和基因敲除植株(lox10-1，lox10-2)。所述植株活性通过平均株高以及盐碱胁迫处理5天后株高与未进行盐碱胁迫处理的原始植株株高的对比表达。oslox10过表达植株(lox10-oe1，lox10-oe2)对于盐碱胁迫5天后复水7天后的植株的存活率约50％存活率，明显高于空白样(wt)。wt样本经盐碱胁迫5天后复水7天后约20％存活率。基因敲除植株(lox10-1，lox10-2)经盐碱胁迫5天后复水7天后约20％存活率。并且进一步通过比较可以看出，lox10-oe1过表达苗的植株活性和复水存活率较lox10-oe2更高。这意味着，对于过表达苗，在一定的范围内的lox10过表达对增强水稻的盐碱胁迫抗性具有更好效果。其中所述lox10过表达量，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，lox10基因优选的相对表达量为100～150倍，在此范围内获得更好的水稻盐碱胁迫抗性。

技术特征：
1.一种水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述oslox10基因为如seq no:1所示的基因或其互补基因。2.根据权利要求1所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，通过过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量或表达活性以提高水稻盐碱胁迫抗性，所述oslox10基因编码的蛋白具有如seq no:2所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量或表达活性为：通过荧光定量分析，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，oslox10基因的相对表达量不小于100倍。4.根据权利要求3所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量或表达活性为：通过荧光定量分析，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，oslox10基因的相对表达量为100～150倍。5.根据权利要求2所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量的方法包括：以包含目的基因的质粒作为模板进行pcr扩增，并构建oslox10过表达载体，通过农杆菌介导法将目的片段整合到水稻愈伤组织细胞中并诱导分化成苗；其中所述pcr扩增中，引物如下：oslox10-oe-f如seq no:2，oslox10-oe-r如seq no:3所示。6.根据权利要求1-5任一项所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述水稻为kitaake。7.根据权利要求1所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述碱胁迫抗性是碱性环境下的胁迫抗性。8.根据权利要求7所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述碱性环境是ph值不小于10.0的碱性环境。

技术总结
本发明基于水稻通过对OsLOX10基因敲除和过表达制备筛选出相应的植株，并基于由相应植株幼苗进行耐盐碱胁迫实验。OsLOX10过表达增强了水稻幼苗对盐碱胁迫的抗性。对于pH＝10的盐碱胁迫，其第5天过表达植株的存活率明显高于空白样和基因敲除植株。复水7天后的植株，OsLOX10过表达植株的存活率明显高于空白样和基因敲除植株。其中对于过表达植株，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，当OsLOX10基因相对表达量为100～150倍时，对应基因编辑植株的存活率最高。本发明为提高水稻的耐盐碱胁迫，特别是提高水稻耐碱性胁迫，提供了一种新的技术方案。术方案。术方案。


技术研发人员：张建福 王福祥 蔡秋华 何炜 张玲 谢鸿光 魏毅东 林强 郑燕梅 魏林艳
受保护的技术使用者：福建省农业科学院水稻研究所
技术研发日：2022.12.29
技术公布日：2023/9/11