一种对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法与流程

1.本发明涉及对虾养殖技术领域，尤其涉及一种对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法。


背景技术：

2.凡纳滨对虾,又称南美白对虾，但现有对虾新品种育种总体技术比较传统，品牌竞争力不强，迫切需要培育出适应市场需求且具有产品竞争力的对虾新品种。
3.近十年来受养殖环境变化，对虾养殖病害频发，其中以早期死亡综合症(ems)为代表的弧菌病影响尤为严重，抗弧菌感染能力强的对虾品种成为养殖市场的巨大需求。
4.在经验性的对虾抗弧菌性状测试中，通常从群体或家系中的抽取对虾样本，进行抗弧菌性状测试，以样本的性状表现代表来源群体或家系的性状表现，这种做法的明显缺陷在于三个方面：第一，测试个体由于接触了弧菌致病菌，并不能直接留作育种材料，导致在性状测试中表现良好的个体一起被淘汰；第二，样本的性状测试结果用于评估群体或家系的整体性状特征，掩盖了群体或家系内个体间的差异，导致后期的进一步亲本选育中，可能出现没有弧菌抗性的育种材料混杂其中，从而导致抗弧菌性状选育工作趋于失败；第三，具备优良抗弧菌性状的对虾可能是群体或家系中存在遗传变异或独特基因型的个体，其性状特征并非属于整个群体或家系的特征，因此以个体样本代表家系或群体的抗弧菌性状的筛选方法会失去准确性。
5.鉴于此，有必要提供一种新的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，以解决上述不足。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供了一种对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法。本发明中经过筛选后，可直接用作对虾育种材料，能真实准确的反馈育种材料的性状，避免常规的经验性抗弧菌性状测试中结果不准确、测试对象不能直接用作育种材料的突出问题，提高对虾育种材料选育的精准度。
7.本发明的目的是提供一种对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法。
8.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，包括以下步骤：
9.(1)对虾抗弧菌性状压力测试
10.将虾苗在测试中暂养一周后，将测试池中的海水排至30～40％，向测试池中加入含致病菌的菌液浸浴感染12～16h后，再排掉测试池中剩余50％的海水，之后添加清洁海水至暂养过程的水位，继续饲养对虾；
11.(2)一次筛选
12.在所述浸浴感染之后，每天3～5次观察测试池中对虾的活动和摄食情况，清除死亡或濒死的对虾，持续2～5d，一次筛选后保留存活的对虾继续饲养；
13.(3)致病菌清除
14.一次筛选完成后进行致病菌清除过程，包括：
15.测试池每天换水一次，每隔三天消毒一次；
16.致病菌清除的0～7d，施用药饲；
17.致病菌清除的7～21d，停用药饲，施用含益生菌的菌饲；
18.(4)二次筛选
19.致病菌清除饲养对虾过程中，每天早、中、晚检查测试池，清除测试池中死亡或濒死的对虾，保留存活的对虾；
20.(5)养殖
21.致病菌清除和二次筛选完成后，存活的对虾继续养殖70～90d；
22.(6)三次筛选
23.采集养殖后的对虾的粪便，检测粪便中的致病菌，选择检测结果呈阴性的对虾，完成对虾抗弧菌性状育种材料的筛选；
24.准备多个水桶，将养殖后的对虾分配到水桶中，投喂养殖，采集各水桶中的对虾粪便，基于pcr扩增测试，合并测试呈阴性的对虾，即完成对虾抗弧菌性状育种材料的筛选。
25.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，步骤(1)对虾抗弧菌性状压力测试中，测试池饲养的对虾密度为300～1500尾/m3，对虾的体长为2～3cm。
26.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，步骤(1)对虾抗弧菌性状压力测试中，所述致病菌为副溶血弧菌或哈式弧菌；所述致病菌液的od
600nm
≥2.0。
27.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，步骤(1)对虾抗弧菌性状压力测试中，所述浸浴感染过程，测试池的致病菌浓度≥1
×
105cfu/ml。
28.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，步骤(3)致病菌清除中，所述换水的换水量：
29.0～7d的换水量为20～30％；
30.7～21d的换水量为10～20％。
31.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，步骤(3)致病菌清除中，所述杀菌是采用二氧化氯对水体进行消毒。
32.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，步骤(3)致病菌清除中，所述药饲含有1～5
‰
的氟苯尼考。
33.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，步骤(3)致病菌清除中，所述菌饲中含有0.5～1％的短小芽孢杆菌。
34.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，步骤(6)三次筛选中，所述水桶的容量为20～30l。
35.根据本发明具体实施方式提供的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，步骤(6)三次筛选中，所述水桶中对虾为10尾/桶。
36.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
37.1、本发明中经过筛选后，可直接用作对虾育种材料，能真实准确的反馈育种材料
的性状，避免常规的经验性抗弧菌性状测试中结果不准确、测试对象不能直接用作育种材料的突出问题，提高对虾育种材料选育的精准度。
38.2、本发明的筛选方法可以避免常规的经验性抗弧菌性状测试中结果不准确、测试对象不能直接用作育种材料的突出问题，提高对虾育种材料选育的精准度。
39.3、本发明采用含致病菌的菌液筛选对虾，可以获得育种价值更高的育种材料，由于对虾的抗弧菌性状增强并非是家系或群体的固有特征，通过大规模的弧菌感染测试和高比率的严格淘汰，可将具有显著抗弧菌新传的对虾个体筛选出来，这些个体是家系或群体中少数具有独特基因型或急性变异型的个体，同时筛选过程中，去除了大量感染了致病菌的对虾，特别是隐形感染致病菌的对虾，不携带致病菌而减少致病菌危害。
40.4、本发明的筛选方法中，采用频繁换水的方式稀释致病弧菌的浓度，采用二氧化氯对水体环境性残留的致病弧菌进行杀灭，采用对弧菌广谱高效且许可使用的氯苯尼考抑制对虾体内弧菌生长，在对虾技能恢复期采用的对弧菌具有广谱拮抗作用的短小芽孢杆菌抑制对虾体内弧菌，及时清除感染的对虾，减少病原传播几率，从而从多个途径将引入的致病菌从对虾和养殖环境中清除干净，进一步通过灵敏的pcr检测，确保筛选出来对虾育种不携带ems病原，保证了育种材料的品质。
41.5.采用本发明方法筛选出的对虾育种材料，生存适应能力强、对ems弧菌的抗病力强。
具体实施方式
42.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
43.实施例1
44.本实施例提供一种对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，包括如下步骤:
45.1、致病菌菌液的培养
46.(1)采用副溶血弧菌sc1907作为引起ems的致病弧菌株；
47.(2)取副溶血弧菌sc1907，于lb培养基中大量过夜培养，培养条件：30℃，摇床转速200rpm，培养时间24h，直至od
600nm
≥3.0；
48.(3)加入lb培养基进行定量稀释，得到含有致病菌的菌液。
49.2、对虾抗弧菌性状压力测试
50.(1)选择一个群体或家系的凡纳滨对虾作为测试对虾，个体数量10000尾，平均体长为2.5cm；
51.(2)在面积为10m2测试池中加入清洁海水10m3，将测试对象转移至测试池中，暂养16h；
52.(3)将测试池中的水排至水深0.35m，向测试池中加入菌液，使测试池水体中的致病菌浓度为1
×
105cfu/ml，开始浸浴感染；
53.(4)对虾浸浴感染14h后，排掉测试池中50％的水体，重新加入清洁海水至测试池中水深1m，按照常规饲养管理方法进行饲养；
54.3、一次筛选
55.浸浴感染的72h内，每天4次观察测试池中对虾的活动及摄食情况，及时清除死亡、濒死的对虾，剩余的对虾为通过依次筛选的对虾育种材料。
56.4、致病弧菌清除及二次筛选
57.(1)按2
‰
的质量百分比在常规对虾饲料中拌入氟苯尼考(采购自山东德性生物科技有限公司)，并加入常用的粘合剂(采购自运城市澳威兽药有限公司)，晾干后制成药饲，4℃冰箱中储存备用；
58.(2)按0.75％的质量百分比在常规对虾饲料中拌入短小芽孢杆菌(采购自广州诺晶生物技术有限公司)，并加入常用的粘合剂(采购自运城市澳威兽药有限公司)，晾干后制成菌饲，4℃冰箱中储存备用；
59.(3)按照正常饲料的投喂方法投喂药饲，投喂1.5h后，观察测试池中对虾的活动情况，清除掉活动不正常、空肠或空胃的对虾；于每天早、中、晚三次对测试池进行检查，及时清除死亡或濒死的对虾；投喂药饲期间，每天对测试池进行换水，换水量为25％；
60.(4)投喂药饲7d后，停用药饲，按照正常饲料投喂方法开始投喂菌饲，连续投喂菌饲14d；于每天早、中、晚三次对测试池进行检查，及时清除死亡或濒死的对虾；投喂菌饲期间，每天对测试池进行换水，换水量15％；
61.(5)投喂药饲和投喂菌饲期间，每隔72h对测试池中的水体进行消毒；消毒采用二氧化氯；消毒后12h，排掉测试池中50％的池水，再加入清洁海水至正常水位。
62.5、正常养殖
63.致病弧菌清除及二次筛选完成之后，进入正常的室内养殖过程，养殖密度120尾/m3，室内养殖80d。
64.6、三次筛选
65.(1)正常养殖80d后，投喂常规对虾饲料，投喂后1h，逐尾检测对虾，选择形体完整，肝胰腺大小、色泽正常，肠胃边界清晰、肠胃饱满有内容物的个体。
66.(2)将对虾个体按10尾/桶分配至25l的水桶中，继续按照常规养殖方式投喂，投喂3h后，用吸管收集各桶内的对虾粪便，分别装于1.5ml的离心管中，离心2min，吸附多余的水分；
67.(3)采用细菌基因组提取试剂盒(takaka)进行dna提取，对粪便中ems致病菌进行第一次pcr检测(pcr检测方法参见参考文献1)，得出阴性或阳性的检测结果；
68.(4)水桶中继续投喂至第三天，再次采集水桶中的对虾粪便，按照前述测试方法，得出阴性或阳性的检测结果；
69.(5)将两次检测结果均为阴性的对虾合并到一池中，总计留存210尾对虾，留存率为2.1％，留存的210尾对虾作为最终的育种材料，进入下一步的亲虾培育环节。
70.本实施例育种材料具有以下特点：
71.随机取上述30尾育种材料，暂存于装有200l清洁海水的测试桶内，暂养16h；向测试桶中加入副溶血弧菌sc1907的菌液，浓度为1
×
105cfu/ml，进行感染试验；感染试验进行14h后，排掉测试桶中80％的海水，重新加入清洁海水至测试桶中海水总量为200l，按照常规饲养管理方法进行饲养；感染试验开始，每天分四次观察测试池中对虾的活动及摄食情况，及时清除死亡或濒死的对虾，直至7d后统计存活数。
72.试验结果：存活数28尾，存活率为93.3％。
73.实施例2
74.本实施例提供一种对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，包括如下步骤:
75.1、致病菌菌液的培养
76.(1)采用哈氏弧菌作为引起ems的致病弧菌株；
77.(2)取哈氏弧菌，于lb培养基中大量过夜培养，培养条件：30℃，摇床转速200rpm，培养时间24h，直至od
600nm
≥3.0；
78.(3)加入lb培养基进行定量稀释，得到含有致病菌的菌液
79.2、对虾抗弧菌性状压力测试
80.(1)选择一个群体或家系的凡纳滨对虾作为测试对虾，个体数量10000尾，平均体长为2.5cm；
81.(2)在面积为10m2测试池中加入清洁海水10m3，将测试对象转移至测试池中，暂养16h；
82.(3)将测试池中的水排至水深0.35m，向测试池中加入菌液，使测试池水体中的致病菌浓度为1
×
105cfu/ml，开始浸浴感染；
83.(4)对虾浸浴感染14h后，排掉测试池中50％的水体，重新加入清洁海水至测试池中水深1m，按照常规饲养管理方法进行饲养；
84.3、一次筛选
85.浸浴感染的72h内，每天4次观察测试池中对虾的活动及摄食情况，及时清除死亡、濒死的对虾，剩余的对虾为通过依次筛选的对虾育种材料。
86.4、致病弧菌清除及二次筛选
87.(1)按2
‰
的质量百分比在常规对虾饲料中拌入氟苯尼考(山东德性生物科技有限公司)，并加入常用的粘合剂，晾干后制成药饲，4℃冰箱中储存备用；
88.(2)按0.75％的质量百分比在城规对虾饲料中拌入短小芽孢杆菌(广州诺晶生物技术有限公司)，并加入常用的粘合剂，晾干后制成菌饲，4℃冰箱中储存备用；
89.(3)按照正常饲料的投喂方法投喂药饲，投喂1.5h后，观察测试池中对虾的情况，清除掉活动不正常、空肠或空胃的对虾；于每天早、中、晚三次对测试池进行检查，及时清除死亡或濒死的对虾；投喂药饲期间，每天对测试池进行换水，换水量为25％；
90.(4)投喂药饲7d后，停用药饲，按照正常饲料投喂方法开始投喂菌饲，连续投喂菌饲14d；于每天早、中、晚三次对测试池进行检查，及时清除死亡或濒死的对虾；投喂菌饲期间，每天对测试池进行换水，换水量20％；
91.(5)投喂药饲和投喂菌饲期间，每隔72h对测试池中的水体进行消毒；消毒采用二氧化氯；消毒后12h，排掉测试池中50％的池水，再加入清洁海水至正常水位。
92.5、正常养殖
93.致病弧菌清除及二次筛选完成之后，进入正常的室内养殖过程，养殖密度120尾/m3，室内养殖80d。
94.6、三次筛选
95.(1)正常养殖80d后，投喂常规对虾饲料，投喂后1h，逐尾检测对虾，选择形体完整，肝胰腺大小、色泽正常，肠胃边界清晰、肠胃饱满有内容物的个体。
96.(2)将对虾个体按10尾/桶分配至25l的水桶中，继续按照常规养殖方式投喂，投喂3h后，用吸管收集各桶内的对虾粪便，分别装于1.5ml的离心管中，离心2min，吸附多余的水分；
97.(3)采用细菌基因组提取试剂盒(takaka)进行dna提取，对粪便中ems致病菌进行第一次pcr检测，得出阴性或阳性的检测结果；
98.(4)水桶中继续投喂至第三天，再次采集水桶中的对虾粪便，按照前述测试方法，得出阴性或阳性的检测结果；
99.(5)将两次检测结果均为阴性的对虾合并到一池中，总计留存250尾对虾，留存率为2.5％，留存的250尾对虾作为最终的育种材料，进入下一步的亲虾培育环节。
100.本实施例育种材料具有以下特点：
101.随机取上述30尾育种材料，暂存于装有200l清洁海水的测试桶内，暂养16h；向测试桶中加入副溶血弧菌sc1907的菌液，浓度为1
×
105cfu/ml，进行感染试验；感染试验进行14h后，排掉测试桶中80％的海水，重新加入清洁海水至测试桶中海水总量为200l，按照常规饲养管理方法进行饲养；感染试验开始，每天分四次观察测试池中对虾的活动及摄食情况，及时清除死亡或濒死的对虾，直至7d后统计存活数。
102.试验结果：存活数26尾，存活率为86.7％。
103.对比例
104.本对比例基于经验性的对虾抗弧菌性状测试，随机选择常规抗弧菌性状检测方法鉴定出的抗ems家系的对虾30尾，作为对照材料，进行如下对比试验：
105.将对照材料暂存于装有200l清洁海水的测试桶内，暂养16h；向测试桶中加入副溶血弧菌sc1907的菌液，浓度为1
×
105cfu/ml，进行感染试验；感染试验进行14h后，排掉测试桶中80％的海水，重新加入清洁海水至测试桶中海水总量为200l，按照常规饲养管理方法进行饲养；感染试验开始，每天分四次观察测试池中对虾的活动及摄食情况，及时清除死亡或濒死的对虾，直至7d后统计存活数。
106.对比试验结果：存活数20尾，存活率为66.7％。
107.参考文件1：han je,tang kf,tran lh,lightner dv.photorhabdus insect-related(pir)toxin-like genes in a plasmid of vibrio parahaemolyticus,the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease(ahpnd)of shrimp.diseases of aquatic organisms.2015,113(1):33-40.
108.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对虾抗弧菌性状压力测试将虾苗在测试中暂养一周后，将测试池中的海水排至30～40％，向测试池中加入含致病菌的菌液浸浴感染12～16h后，再排掉测试池中剩余50％的海水，之后添加清洁海水至暂养过程的水位，继续饲养对虾；(2)一次筛选在所述浸浴感染之后，每天3～5次观察测试池中对虾的活动和摄食情况，清除死亡或濒死的对虾，持续2～5d，一次筛选后保留存活的对虾继续饲养；(3)致病菌清除一次筛选完成后进行致病菌清除过程，包括：测试池每天换水一次，每隔三天消毒一次；致病菌清除的0～7d，施用药饲；致病菌清除的7～21d，停用药饲，施用含益生菌的菌饲；(4)二次筛选致病菌清除过程中，每天早、中、晚检查测试池，清除测试池中死亡或濒死的对虾，保留存活的对虾；(5)养殖致病菌清除和二次筛选完成后，存活的对虾继续养殖70～90d；(6)三次筛选采集养殖后的对虾的粪便，检测粪便中的致病菌，选择检测结果呈阴性的对虾，完成对虾抗弧菌性状育种材料的筛选；准备多个水桶，将养殖后的对虾分配到水桶中，投喂养殖，采集各水桶中的对虾粪便，基于pcr扩增测试，合并测试呈阴性的对虾，即完成对虾抗弧菌性状育种材料的筛选。2.根据权利要求1所述的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，步骤(1)对虾抗弧菌性状压力测试中，测试池饲养的对虾密度为300～1500尾/m3，对虾的体长为2～3cm。3.根据权利要求1所述的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，步骤(1)对虾抗弧菌性状压力测试中，所述致病菌为副溶血弧菌或哈式弧菌；所述致病菌液的od
600nm
≥2.0。4.根据权利要求1所述的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，步骤(1)对虾抗弧菌性状压力测试中，所述浸浴感染过程，测试池的致病菌浓度≥1
×
105cfu/ml。5.根据权利要求1所述的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，步骤(3)致病菌清除中，所述换水的换水量：0～7d的换水量为20～30％；7～21d的换水量为10～20％。6.根据权利要求1所述的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，步骤(3)致病菌清除中，所述杀菌是采用二氧化氯对水体进行消毒。7.根据权利要求1所述的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，步骤(3)致病菌清除中，所述药饲含有1～5
‰
的氟苯尼考。
8.根据权利要求1所述的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，步骤(3)致病菌清除中，所述菌饲中含有0.5～1％的短小芽孢杆菌。9.根据权利要求1所述的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，步骤(6)三次筛选中，所述水桶的容量为20～30l。10.根据权利要求1所述的对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法，其特征在于，步骤(6)三次筛选中，所述水桶中对虾为10尾/桶。

技术总结
本发明涉及对虾养殖技术领域，尤其涉及一种对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法。对虾抗弧菌性状育种材料的筛选方法包括以下步骤：对虾抗弧菌性状压力测试、一次筛选、致病菌清除、二次筛选、养殖和三次筛选。本发明中经过筛选后，可直接用作对虾育种材料，能真实准确的反馈育种材料的性状，避免常规的经验性抗弧菌性状测试中结果不准确、测试对象不能直接用作育种材料的突出问题，提高对虾育种材料选育的精准度。准度。


技术研发人员：陈国良 罗鹏 刘永奎 张鑫 张吕平 刘阳 周腾 胡超群 宋宏斌
受保护的技术使用者：遂溪新海茂水产种业科技有限公司
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/9/14