一种夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法及应用与流程

1.本发明属于质量检测领域，特别涉及一种夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法及应用。


背景技术：

2.夏枯草为唇形科(lamiaceae)植物夏枯草prunella vulgaris l.的干燥果穗，始载于《神农本草经》，因“此草夏至后即枯”而得名，是一种药食同源的多年生草本植物，至今已有几千年的药用历史，现收载于2015年版之《中国药典》。夏枯草味苦、辛，性寒，归肝、胆经，可清肝散火、明目、散结消肿，对目赤肿痛、畏光流泪、目珠夜痛、头晕目眩、瘰疬、瘿瘤、乳腺癌、高血压、淋巴结核、浸润性肺结核、单纯性甲状腺肿、腮腺炎、急性黄疸型传染性肝炎等多种疾病均有良好的临床治疗效果。现代研究表明，夏枯草中含有多种化学成分：包括三萜、甾醇、黄酮、有机酸、香豆素等类型化合物。其具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、降血压、降血糖、降血脂等药理作用。
3.夏枯草籽为唇形科(lamiaceae)植物夏枯草prunella vulgaris l.的干燥成熟种子，为夏枯草的生殖种子。夏枯草在收割时，基于夏枯草籽成熟脱落以及收割操作(如抖动)等原因，夏枯草果穗(即中药名的夏枯草)几乎不含或很少含有夏枯草籽。目前，夏枯草籽除了用于繁殖夏枯草外，并没有其他应用。
4.本技术申请人在开发夏枯草籽价值的研究过程中，首次以夏枯草籽为原料得到夏枯草籽油，发现夏枯草籽和夏枯草籽油中富含熊果酸等三萜类成分。但是，现有技术中并没有夏枯草籽、夏枯草籽油的质量控制方法的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法。
6.本发明的另一目的在于提供通过上述夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，包括如下步骤：利用薄层色谱检测法对夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸进行定性鉴别；利用柱分离将干扰总三萜测定的油脂类成分分离去除，再以熊果酸或齐墩果酸为对照，用分光光度法对夏枯草籽及夏枯草籽油中的总三萜进行含量测定。
8.所述的薄层色谱检测法的具体步骤如下：
9.(1)供试品溶液的制备：
10.①
夏枯草籽供试品溶液的制备：将夏枯草籽粉末加入甲醇水溶液中超声提取，过滤，得到的滤液除去溶剂，残渣用甲醇溶解，得到夏枯草籽粉供试品溶液；其中，甲醇水溶液中甲醇的浓度为体积百分比70～90％；
11.②
夏枯草籽油供试品溶液的制备：将夏枯草籽油和沸程为60-90℃的石油醚混合均匀后，用甲醇水溶液进行萃取，分离获取下层的甲醇水溶液相；将获取的甲醇水溶液相除去溶剂，残渣用甲醇溶解，得到夏枯草籽油供试品溶液；其中，甲醇水溶液中甲醇的浓度为体积百分比70～90％；
12.(2)对照品溶液的制备：用甲醇溶解熊果酸对照品，作为对照品溶液；
13.(3)薄层色谱(tlc)检测：吸取供试品溶液和对照品溶液分别点于同一高效硅胶g薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，在100～110℃加热至斑点显色淸晰；
14.(4)观察硅胶g薄层板：将步骤(3)得到的硅胶g薄层板分别置日光灯下及置紫外光灯下检视，观察供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上是否存在相同颜色的斑点，即可鉴定出夏枯草籽及夏枯草籽油中是否含有三萜类成分熊果酸。
15.步骤(1)中所述的夏枯草粉末优选为通过如下步骤得到：将夏枯草籽粉碎破壁，过至少40目筛，得到夏枯草粉末。
16.所述的筛优选为40-50目的筛。
17.步骤(1)
①
中所述的超声提取的条件优选为于功率50～200w、频率40～ 60khz提取20～80分钟；更优选为于功率80～150w、频率45～50khz提取30～ 60分钟；最优选为于功率150w、频率45khz提取30～60分钟。
18.步骤(1)
①
中所述的甲醇水溶液中甲醇的浓度优选为体积百分比80％。
19.步骤(1)
①
中所述的甲醇水溶液的用量优选按2.0～5.0g夏枯草籽粉末配比30～60ml甲醇水溶液计算。
20.步骤(1)
①
中所述的除去溶剂优选为通过蒸干方式除去溶剂。
21.步骤(1)
①
中所述的甲醇的用量优选按2.0～5.0g夏枯草籽粉末配比1～3ml 甲醇水溶液计算；更优选按2.0～5.0g夏枯草籽粉末配比2ml甲醇水溶液计算。
22.步骤(1)
②
中所述的石油醚的用量优选按0.6～1.5g夏枯草籽油配比30ml 石油醚计算。
23.步骤(1)
②
中所述的甲醇水溶液中甲醇的浓度优选为体积百分比80％。
24.步骤(1)
②
中所述的甲醇水溶液的用量优选按0.6～1.5g夏枯草籽油配比 30ml甲醇水溶液计算。
25.步骤(1)
②
中所述的萃取的次数为1次以上；优选为2～3次，合并甲醇水溶液相。
26.步骤(1)
②
中所述的除去溶剂优选为通过蒸干方式除去溶剂。
27.步骤(1)
①
中所述的甲醇的用量优选按0.6～1.5g夏枯草籽粉末配比1～3ml 甲醇水溶液计算；更优选按0.6～1.5g夏枯草籽粉末配比2ml甲醇水溶液计算。
28.步骤(2)中所述的对照品溶液中熊果酸的浓度优选为0.9～1.1mg/ml；更优选为1mg/ml。
29.步骤(2)中所述的供试品溶液的用量为2～10μl。
30.步骤(2)中所述的对照品溶液的用量为2～10μl。
31.步骤(3)中所述的展开剂优选为甲苯-乙酸乙酯-甲酸溶液；更优选为按体积比8.1～8.3:1.5～1.7:0.1～0.3混合得到的甲苯-乙酸乙酯-甲酸溶液；最优选为按体积比8.2:1.6:0.2混合得到的甲苯-乙酸乙酯-甲酸溶液。
32.步骤(3)中所述的显色剂优选为硫酸乙醇溶液；更优选为10％(v/v)的硫酸乙醇溶
液。
33.步骤(3)中所述的加热的温度优选为105℃。
34.步骤(4)中所述的紫外灯的波长为365nm。
35.所述的含量测定的具体步骤如下：
36.1)供试品溶液的制备
37.①
夏枯草籽供试品溶液的制备：
38.a.取夏枯草籽粉末3.0-6.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精确加入乙酸乙酯100ml，精确称重，超声处理，再称重，补加乙酸乙酯至原来重量，放置澄清，精确吸取上清液50ml，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残余物备用；
39.b.上述残余物加入沸程为60-90℃的石油醚10ml进行溶解，再转移至已装好10g规格为100-200目的硅胶的层析柱上，层析柱的内径为15-20mm；以沸程为60-90℃的石油醚和乙酸乙酯按体积比90:10配比得到的洗脱液a100ml洗脱，洗脱液弃去；然后再以乙酸乙酯和甲醇按体积比80:20配比得到的的洗脱液 150ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加无水乙醇 80ml溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
40.②
夏枯草籽油供试品溶液的制备：称取夏枯草籽油样品0.30-0.80g，精密称定，加入沸程为60-90℃的石油醚10ml进行溶解，再转移至已装好10g规格为100-200目的硅胶的层析柱上，层析柱的内径为15-20mm；以沸程为60-90℃的石油醚和乙酸乙酯按体积比90:10配比得到的洗脱液a100ml洗脱，洗脱液弃去；然后再以乙酸乙酯和甲醇按体积比80:20配比得到的的洗脱液150ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加无水乙醇80ml溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
41.2)三萜对照品溶液的制备：取三萜对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每lml含0.1mg的溶液，即得三萜对照品溶液；
42.3)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、 1.2ml，分别置15ml具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，摇匀，在70℃水浴中加热15分钟，立即置冰浴中冷却5分钟，取出，精密加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，在 545nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线；
43.(4)测定法：精密量取供试品溶液0.2ml，置15ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中三萜对照品的含量，计算，得到供试品的总三萜含量。
44.步骤1)
①
中所述的超声提取的条件优选为于功率50～200w、频率40～ 60khz提取20～80分钟；更优选为于功率80～150w、频率45～50khz提取30～ 60分钟；最优选为于功率150w、频率45khz提取45分钟。
45.步骤2)中所述的三萜对照品为熊果酸或齐墩果酸。
46.步骤3)中所述的香草醛冰醋酸溶液优选通过如下步骤得到：精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，得到香草醛冰醋酸溶液。
47.步骤4)中所述的计算的公式如下：
48.夏枯草籽(粉末)中总三萜类物质含量的计算公式如式(1)所示；夏枯草籽油中总
三萜类物质含量的计算公式如式(2)所示；
[0049][0050][0051]
x——试样中三萜类物质的含量，单位为克每百克(g/100g)；
[0052]
m1——夏枯草籽(粉末)或夏枯草籽油试样的质量，单位为克(g)；
[0053]
m2——通过线性回归方程算得的测定用样液中三萜类物质的质量，单位为毫克(mg)；
[0054]v1
——待测液定容的体积，单位为毫升(ml)；
[0055]v2
——测定用的样液体积，单位为毫升(ml)。
[0056]
上述检测方法在夏枯草籽及夏枯草籽油开发中的应用。
[0057]
夏枯草是我国药典收载的一种药食同源的常见药味，其野生与种植资源十分丰富，但由于夏枯草籽未被开发利用，致使每年成千上万吨的夏枯草籽未被收集，散落在荒地野外，造成资源浪费。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0058]
1、本发明首次提供了一种夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，为夏枯草籽及夏枯草籽油开发利用提供了方法和依据，将减少夏枯草籽的资源浪费；
[0059]
2、本发明首次发现了夏枯草籽及夏枯草籽油中富含以熊果酸、齐墩果酸为代表的三萜类成分，为夏枯草籽及夏枯草籽油的保健与药用提供了依据；
[0060]
3、本发明克服了以往油类成分中总三萜成分含量测定时油脂的干扰问题及总三萜成分虚假高含量(油脂杂质也会参与显色反应导致)的问题；本发明通过大量实验，摸索不同的柱层析分离条件(包括但不限于洗脱液)，以最大程度去除油脂、保留总三萜成分为目的，得到最佳的分离条件：石油醚(60-90℃): 乙酸乙酯＝体积比90:10的洗脱液洗脱，能除去90％以上的油脂，同时总三萜成分保留在柱子上(通过检测洗脱出来的溶液中是否含总三萜成分确定)；以乙酸乙酯:甲醇＝体积比80:20的洗脱液，能将柱子上的总三萜洗脱完全；从而本发明提供的夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，具有准确度和精密度高、稳定性和重复性好等特点。
附图说明
[0061]
图1是夏枯草籽油中三萜成分熊果酸的tlc鉴别结果在可见光下的照片图；其中，1、2、3、5、6、7为夏枯草籽油供试品，4为熊果酸对照品。
[0062]
图2是夏枯草籽油中三萜成分熊果酸的tlc鉴别结果在紫外光下的照片图；其中，1、2、3、5、6、7为夏枯草籽油供试品，4为熊果酸对照品。
[0063]
图3是夏枯草籽油中三萜成分熊果酸的tlc鉴别结果在可见光下的照片图；其中，1、2、3、4、6、7为夏枯草籽油供试品，5为熊果酸对照品。
[0064]
图4是夏枯草籽油中三萜成分熊果酸的tlc鉴别结果在紫外光下的照片图；其中，1、2、3、4、6、7为夏枯草籽油供试品，5为熊果酸对照品。
[0065]
图5是齐墩果酸标准溶液线性拟合曲线图。
具体实施方式
[0066]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0067]
实施例1夏枯草籽中熊果酸的薄层色谱(tlc)检测
[0068]
(1)供试品溶液的制备：取夏枯草籽样品6份，分别粉碎破壁，过40目筛，准确称取夏枯草籽粉各2.5g，分别加入含80％(v/v)甲醇的水溶液50ml，超声提取45min，过滤，滤液置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加甲醇2ml 使溶解，分别得夏枯草籽粉供试品1、2、3、5、6、7号溶液，备用。
[0069]
(2)对照品溶液的制备：称取熊果酸对照品2.01mg，加甲醇2ml使溶解，成每lml约含l.01mg熊果酸的溶液，作为对照品溶液，编号4号，备用。
[0070]
(3)薄层色谱(tlc)检测：
[0071]
按照《中华人民共和国药典》一部2015年版一部中薄层色谱法(通则0502) 试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一高效硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比8.2:1.6:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液(即浓度为98％的浓硫酸与无水乙醇按体积比1：9配比得到)，在 105℃加热至斑点显色淸晰，分别置可见光灯与紫外光灯下检识；
[0072]
可见光灯下检识：供试品色谱中，在与对照品熊果酸色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；见图1。
[0073]
置紫外光灯(365nm)下检视：供试品色谱中，在与对照品熊果酸色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；见图2。
[0074]
(4)薄层色谱(tlc)检测结果与结论：
[0075]
从可见光灯下检识：供试品色谱中，在与对照品熊果酸色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点及置紫外光灯(365nm)下检视：供试品色谱中，在与对照品熊果酸色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点的结果证明：6份夏枯草籽样品中均含有三萜类成分熊果酸。且6份供试品色谱中的主要三萜类成分色谱基本相同。
[0076]
实施例2夏枯草籽油中熊果酸的薄层色谱(tlc)检测
[0077]
(1)供试品溶液的制备：取夏枯草籽油样品6份，分别各称取约0.8g；分别加入30ml石油醚(60-90℃)溶解后，再分别转移至分液漏斗中，分别加入含80％(v/v)甲醇的水溶液30ml，振摇萃取二次，每次振摇1分钟，静置分层，分取下层的甲醇的水溶液，分别置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣分别加甲醇2ml使溶解，分别得夏枯草籽油的1、2、3、4、6、7号供试品溶液，备用。
[0078]
(2)对照品溶液的制备：称取熊果酸对照品2.01mg，加甲醇2ml使溶解，成每lml约含l.01mg熊果酸的溶液，作为对照品溶液，编号5号，备用。
[0079]
(3)薄层色谱(tlc)检测：
[0080]
按照《中华人民共和国药典》一部2015年版一部中薄层色谱法(通则0502) 试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一高效硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比8.2:1.6:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰，分别置可见光灯与紫外光灯下检识；
[0081]
可见光灯下检识：供试品色谱中，在与对照品熊果酸色谱相应的位置上，显相同的
紫红色斑点；见图3。
[0082]
置紫外光灯(365nm)下检视：供试品色谱中，在与对照品熊果酸色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；见图4。
[0083]
(4)薄层色谱(tlc)检测结果与结论:
[0084]
从可见光灯下检识：供试品色谱中，在与对照品熊果酸色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点及置紫外光灯(365nm)下检视：供试品色谱中，在与对照品熊果酸色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点的结果证明：6份夏枯草籽油样品中均含有三萜类成分熊果酸。且6份供试品色谱中的主要三萜类成分色谱基本相同。
[0085]
实施例3夏枯草籽及夏枯草籽油中总三萜的含量测定方法及方法学验证
[0086]
一、夏枯草籽及夏枯草籽油中总三萜的含量测定方法：
[0087]
1.1原理
[0088]
夏枯草籽及夏枯草籽油中的油脂类物质与三萜类物质在优化好条件的层析柱上分离除去油脂类物质，富集获得的三萜类物质在高氯酸作用下与香草醛反应生成有色物质。在545nm波长下，其吸光度大小与三萜类物质含量成正比。以齐墩果酸或熊果酸为对照品，用比色法测定三萜类物质的含量。
[0089]
1.2试剂
[0090]
1.2.1高氯酸、无水乙醇、冰乙酸、香草醛均为分析纯，齐墩果酸或熊果酸为标准品。
[0091]
1.2.2齐墩果酸标准液(0.1mg/ml)：齐墩果酸对照品10.0mg，用无水乙醇溶解并定容至100ml。
[0092]
1.2.3 5％(v/v)香草醛-冰乙酸溶液：准确称取0.5g香草醛于10ml容量瓶，加冰乙酸溶解并定容至刻度线。此溶液需现配现用。
[0093]
1.3仪器
[0094]
紫外分光光度计、分析天平、水浴锅、常用玻璃仪器、干燥箱。
[0095]
1.4标准曲线的制备
[0096]
吸取齐墩果酸标准液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml于具塞比色管中，置于干燥箱内，90℃烘干溶剂。加入新配制的5％香草醛-冰乙酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，轻轻振荡。于70℃(此温度需严格控制，请用温度计确认实时温度)水浴加热15min，取出，立即置冰水冷却5min，用自来水浴调至室温。用5ml移液管准确移取冰乙酸5.0ml稀释，摇匀。以试剂空白作参比，在30min内用紫外分光光度计在 545nm处测其吸光度值a。以吸光度a为纵坐标，以齐墩果酸的质量(mg)为横坐标，绘制标准曲线，求出直线回归方程并计算相关系数。
[0097]
1.5样品测定
[0098]
1.5.1夏枯草籽样品测定
[0099]
(1)夏枯草籽样品，粉碎破壁，过40目筛，取夏枯草籽粉末5.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精确加入乙酸乙酯100ml，精确称重，超声处理(功率150w，频率45khz)45分钟，再称重，补加乙酸乙酯至原来重量，放置澄清，放置澄清，精确吸取上清液50ml，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残余物加入石油醚(60-90℃)10ml使溶解，再转移至已装好10g(100-200目)硅胶的内径15-20mm的层析柱上，以石油醚(60-90℃):乙酸乙酯＝体积比90:10的洗
脱液100ml洗脱，洗脱液弃去；然后再以乙酸乙酯:甲醇＝体积比80:20的洗脱液150ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加无水乙醇80ml使溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
[0100]
(2)取0.2ml供试品溶液于具塞比色管，置于干燥箱内，90℃烘干溶剂。分别加入0.2ml 5％香草醛-冰乙酸溶液和0.8ml高氯酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，轻轻振荡，于70℃(此温度需严格控制，请用温度计确认实时温度)水浴加热15min，取出，立即置冰水冷却5min，用自来水浴调至室温。用5ml移液管准确移取冰乙酸5.0ml稀释，摇匀。以试剂空白作参比，在30min内用紫外分光光度计在545nm处测其吸光度a。通过线性回归方程计算得到供试液中夏枯草籽总三萜的质量。
[0101]
1.5.2夏枯草籽油样品测定
[0102]
(1)准确称取夏枯草籽油样品0.50g，精密称定，加入石油醚(60-90℃) 10ml使溶解，再转移至已装好10g(100-200目)硅胶的内径15-20mm的层析柱上，以石油醚(60-90℃):乙酸乙酯＝体积比90:10的洗脱液100ml洗脱，洗脱液弃去；然后再以乙酸乙酯:甲醇＝体积比80:20的洗脱液150ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加无水乙醇80ml使溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
[0103]
(2)取0.2ml供试品溶液于具塞比色管，置于干燥箱内，90℃烘干溶剂。分别加入0.2ml 5％香草醛-冰乙酸溶液和0.8ml高氯酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，轻轻振荡，于70℃(此温度需严格控制，请用温度计确认实时温度)水浴加热15min，取出，立即置冰水冷却5min，用自来水浴调至室温。用5ml移液管准确移取冰乙酸5.0ml稀释，摇匀。以试剂空白作参比，在30min内用紫外分光光度计在545nm处测其吸光度a。通过线性回归方程计算得到供试液中夏枯草籽油总三萜的质量。
[0104]
1.6.计算
[0105]
1.6.1夏枯草籽中总三萜类物质的含量计算
[0106][0107]
(1)式中：
[0108]
x——试样中三萜类物质的含量，单位为克每百克(g/100g)；
[0109]
m1——夏枯草籽粉试样的质量，单位为克(g)；
[0110]
m2——通过线性回归方程算得的测定用样液中三萜类物质的质量，单位为毫克(mg)；
[0111]v1
——待测液定容的体积，单位为毫升(ml)；
[0112]v2
——测定用的样液体积，单位为毫升(ml)。
[0113]
1.6.2夏枯草籽油中总三萜类物质的含量计算
[0114][0115]
(2)式中：
[0116]
x——试样中三萜类物质的含量，单位为克每百克(g/100g)；
[0117]
m1——夏枯草籽油试样的质量，单位为克(g)；
[0118]
m2——通过线性回归方程算得的测定用样液中三萜类物质的质量，单位为毫克
(mg)；
[0119]v1
——待测液定容的体积，单位为毫升(ml)；
[0120]v2
——测定用的样液体积，单位为毫升(ml)；
[0121]
计算结果保留三位有效数字。
[0122]
该三萜类物质的检测方法参照《中华人民共和国药典》(2015年版)一部灵芝三萜类物质检测方法制定。夏枯草籽及夏枯草籽油中均含有油脂类物质与三萜类物质，当油脂类物质与三萜类物质混存时，油脂类物质会干扰三萜类物质的含量测定，需要将油脂类物质分离除去；该三萜类物质的检测方法在优化好条件的层析柱上先分离除去油脂类物质，富集获得的三萜类物质再进行测定，方法准确可靠。
[0123]
二、夏枯草籽及夏枯草籽油中总三萜的含量测定方法学验证
[0124]
1、齐墩果酸标准储备液制备：
[0125]
称取0.01003g含量为98.7％(w/w)的齐墩果酸对照品，置100ml的量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成约0.09900mg/ml的齐墩果酸对照品储备液。
[0126]
2、试样液制备：
[0127]
取夏枯草籽样品，粉碎破壁，过40目筛，准确称取夏枯草籽破壁粉5.0032g，置具塞锥形瓶中，精确加入乙酸乙酯100ml，称定重量，超声处理(功率150w，频率45khz)45分钟，再称重，补加乙酸乙酯至原来重量，放置澄清，精确吸取上清液50ml置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残余物加入石油醚(60-90℃) 10ml使溶解，再转移至已装好10g(100-200目)硅胶柱子18
×
300mm(内径
×
长度)的层析柱上，以石油醚(60-90℃):乙酸乙酯＝体积比90:10的洗脱液100ml 洗脱，洗脱液弃去；然后再以乙酸乙酯:甲醇＝体积比80:20的洗脱液150ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加无水乙醇80ml使溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，备用。
[0128]
3、线性范围
[0129]
用建立的检测方法标准曲线的制备测定齐墩果酸标准工作曲线，x轴选取齐墩果酸的绝对含量为0.000mg、0.020、0.040、0.059、0.079、0.099、0.119mg，测定结果见表1，以质量m为横坐标，吸光度值a为纵坐标，进行线性拟合， m与a之间呈线性关系，线性回归方程和线性相关系数见表1，线性拟合曲线见图5，该方法线性关系良好，符合定量分析的要求。
[0130]
表1齐墩果酸标准溶液的线性回归方程和线性相关系数
[0131][0132][0133]
4、方法精密度
[0134]
用建立的方法对同一批次的夏枯草籽进行6次测定，其中样品取样量为5.0g, 计
算6个测定结果的相对平均偏差(rsd)，结果见表2。
[0135]
表2测定方法的精密度试验
[0136][0137]
5、方法重复性考察
[0138]
用建立的方法对同一批次的夏枯草籽进行6次测定，其中样品取样量为5.0g, 分别在不同日期、不同仪器上测定，计算6个测定结果的相对平均偏差(rsd), 结果见表3。
[0139]
表3测定方法的重复性试验
[0140][0141]
从表2和表3可知，rsd值分别为1.49％、2.25％，符合一般方法的rsd《5％的要求，可以用于夏枯草籽及夏枯草籽油中总三萜的含量测定。
[0142]
6、方法稳定性考察
[0143]
分别取0.8ml齐墩果酸标准储备溶液加入到6支比色管中，按方法操作，改设显色的稳定时间为15、30、45min后，测定其吸光度值，每个时间点做一空白比较，见表4。
[0144]
表4显色稳定时间试验
[0145][0146]
从表4中以知，显色稳定时间在15min时有较好的吸光度，且平行性好，随着时间的增长，空白吸收增大；因此，选择显色稳定时间为15min。
[0147]
7、加样回收率试验
[0148]
取夏枯草籽样品，粉碎破壁，过40目筛，准确称取夏枯草籽破壁粉5.0g(精确到0.0001g)，共称取6份样品，3份为一组，共二组；样品称量后，按试验方法操作，于样品中分
别加入14.35、14.35、14.35、17.61、17.61、17.61mg齐墩果酸对照品，按实验方法处理并进行比色测定，并计算回收率，试验结果见表5。
[0149]
表5
[0150][0151]
从表5中可知，二组不同浓度的平均加标回收率分别为100.8％、98.63％，满足一般检测方法对回收率90-110％的要求。
[0152]
实施例4夏枯草籽中总三萜的含量测定实例
[0153]
(1)供试品溶液的制备：取夏枯草籽样品，粉碎破壁，过40目筛，准确称取夏枯草籽破壁粉5.0g(精确到0.0001g)，共称取3分样品，分别为5.0031、 5.0012、5.0024g，分别置具塞锥形瓶中，精确加入乙酸乙酯100ml，精确称重，超声处理(功率150w，频率45khz)45分钟，再称重，补加乙酸乙酯至原来重量，放置澄清，精确吸取上清液50ml,置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残余物加入石油醚(60-90℃)10ml使溶解，再转移至已装好10g(100-200目)硅胶的内径18
×
300mm的层析柱上，以石油醚(60-90℃):乙酸乙酯＝体积比90:10 的洗脱液100ml洗脱，洗脱液弃去；然后再以乙酸乙酯:甲醇＝体积比80:20的洗脱液150ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加无水乙醇80ml使溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，备用；
[0154]
(2)三萜对照品溶液的制备：称取0.01003g含量为98.7％的齐墩果酸对照品，置100ml的量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成约 0.0990mg/ml的齐墩果酸对照品溶液；
[0155]
(3)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、 1.2ml，分别置15ml具塞试管中，挥干，放冷，精密加人新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml高氯酸 0.8ml，摇匀，在70℃水浴中加热15分钟，立即置冰浴中冷却5分钟，取出，精密加人乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，照《中华人民共和国药典》一部2015年版一部中紫外-可见分光光度法(通则0401)，在545nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线；
[0156]
(4)含量测定：精密量取供试品溶液0.2ml，置15ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中三萜对照品的含量，计算，结果见表6。
[0157]
表6夏枯草籽中总三萜的含量测定
[0158][0159]
实施例5夏枯草籽油中总三萜的含量检测实例
[0160]
(1)夏枯草籽油供试品溶液的制备：取三批夏枯草籽油样品，准确称取0.5g (精确到0.0001g)，共称取3分样品，分别为0.5011、0.5002、0.5009g，分别加入石油醚(60-90℃)10ml使溶解，再转移至已装好10g(100-200目)硅胶的内径15-20mm的层析柱上，以石油醚(60-90℃):乙酸乙酯＝体积比90:10的洗脱液100ml洗脱，洗脱液弃去；然后再以乙酸乙酯:甲醇＝体积比80:20的洗脱液150ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加无水乙醇80ml使溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，备用；
[0161]
(2)三萜对照品溶液的制备：称取0.01005g含量为98.2％(v/v)的熊果酸对照品，置100ml的量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成约 0.0987mg/ml的熊果酸对照品溶液；
[0162]
(3)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、 1.2ml，分别置15ml具塞试管中，挥干，放冷，精密加人新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml高氯酸 0.8ml，摇匀，在70℃水浴中加热15分钟，立即置冰浴中冷却5分钟，取出，精密加人乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，照《中华人民共和国药典》一部2015年版一部中紫外-可见分光光度法(通则0401)，在545nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线；
[0163]
(4)含量测定：精密量取供试品溶液0.2ml，置15ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中三萜对照品的含量，计算，结果见表7；
[0164]
表7夏枯草籽油中总三萜的含量测定
[0165][0166]
本发明所用的夏枯草籽油通过如下方法制备得到：
[0167]
(1)夏枯草籽的收集：采摘完全成熟的干燥的夏枯草果穗，置于干净的收集装置中，将干燥的夏枯草果穗中的夏枯草种子抖落于收集装置中，收集获得的夏枯草籽，获得夏枯草籽粗品。
[0168]
(2)夏枯草籽的净选
[0169]
a、除去粗大杂质：选用孔径20目的筛网，将上述收集到的夏枯草籽粗品置于筛网中，振摇过筛，让粒径小于筛网网孔的草籽通过，除去粒径大于筛网网孔的较粗大的杂质，获得除去粗大杂质的夏枯草籽粗品；
[0170]
b、除去细小杂质：选用孔径30目的筛网，将上述除去粗大杂质的夏枯草籽粗品置于筛网中，振摇过筛，让粒径小于筛网网孔的杂质通过，除去粒径小于筛网网孔的较细小的杂质，收集不能通过筛网网孔的夏枯草籽，获得纯净的夏枯草籽。
[0171]
(3)夏枯草籽的破壁：
[0172]
a、将上述纯净的夏枯草籽置于粉碎破壁机中，选用50目孔径的粉碎破壁机筛网进行粉碎破壁；
[0173]
b、将粉碎破壁机置于10
±
2℃的环境下；
[0174]
c、开启机粉碎，粉碎后的夏枯草籽粉置于孔径为50目的筛网中，振摇过筛，让粒径小于筛网网孔的草籽粉通过，不能通过的草籽粉加入粉碎机中继续粉碎破壁，直至全部通过为止，获得破壁的夏枯草籽粉；破壁率为99％以上。
[0175]
(4)干压制粒：
[0176]
①
加料混合：先将上述破壁夏枯草籽粉中加入糊精(糊精的用量相当于破壁夏枯草籽粉质量的0.8％)，混合均匀；
[0177]
②
制粒：上述混匀的粉末采用制粒机用干压法制成粒径大小为0.1～0.3cm 的颗粒，制粒时选择制粒机主压力为7mpa，侧压力为0.7mpa，得夏枯草籽粉颗粒5.07kg。
[0178]
(5)超临界co2萃取：
[0179]
①
萃取：将上述夏枯草籽粉颗粒5.07kg置于超临界co2萃取釜中，以co2为超临界流体，萃取温度为45℃，萃取压力为30mpa，萃取时间为4小时，萃取流量为23kg/h；
[0180]
②
分离：采用二级分离，分离的工艺条件是：一级解析器压力为12mpa，分离温度40℃；二级解析器压力为5mpa，分离温度30℃；获得黄绿色的夏枯草籽油0.92kg。
[0181]
(6)过滤除杂：取上述夏枯草籽油，置于孔径为350目的过滤装置中减压抽滤，弃去不能滤过的杂质，得清澈的夏枯草籽油。
[0182]
(7)质检及灌装：抽取上述夏枯草籽油样品进行质量检测，达标后充氮气灌装。
[0183]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，其特征在于包括如下步骤：利用薄层色谱检测法对夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸进行定性鉴别；利用柱分离将干扰总三萜测定的油脂类成分分离去除，再以熊果酸或齐墩果酸为对照，用分光光度法对夏枯草籽及夏枯草籽油中的总三萜进行含量测定。2.根据权利要求1所述的夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，其特征在于：所述的薄层色谱检测法的具体步骤如下：(1)供试品溶液的制备：
①
夏枯草籽供试品溶液的制备：将夏枯草籽粉末加入甲醇水溶液中超声提取，过滤，得到的滤液除去溶剂，残渣用甲醇溶解，得到夏枯草籽粉供试品溶液；其中，甲醇水溶液中甲醇的浓度为体积百分比70～90％；
②
夏枯草籽油供试品溶液的制备：将夏枯草籽油和沸程为60-90℃的石油醚混合均匀后，用甲醇水溶液进行萃取，分离获取下层的甲醇水溶液相；将获取的甲醇水溶液相除去溶剂，残渣用甲醇溶解，得到夏枯草籽油供试品溶液；其中，甲醇水溶液中甲醇的浓度为体积百分比70～90％；(2)对照品溶液的制备：用甲醇溶解熊果酸对照品，作为对照品溶液；(3)薄层色谱检测：吸取供试品溶液和对照品溶液分别点于同一高效硅胶g薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，在100～110℃加热至斑点显色淸晰；(4)观察硅胶g薄层板：将步骤(3)得到的硅胶g薄层板分别置日光灯下及置紫外光灯下检视，观察供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上是否存在相同颜色的斑点，即可鉴定出夏枯草籽及夏枯草籽油中是否含有三萜类成分熊果酸。3.根据权利要求2所述的夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的夏枯草粉末为通过如下步骤得到：将夏枯草籽粉碎破壁，过至少40目筛，得到夏枯草粉末；步骤(1)
①
中所述的超声提取的条件为于功率50～200w、频率40～60khz提取20～80分钟；步骤(1)
①
中所述的甲醇水溶液中甲醇的浓度为体积百分比80％；步骤(1)
①
中所述的甲醇水溶液的用量按2.0～5.0g夏枯草籽粉末配比30～60ml甲醇水溶液计算；步骤(1)
①
中所述的除去溶剂为通过蒸干方式除去溶剂；步骤(1)
①
中所述的甲醇的用量按2.0～5.0g夏枯草籽粉末配比1～3ml甲醇水溶液计算；步骤(1)
②
中所述的石油醚的用量按0.6～1.5g夏枯草籽油配比30ml石油醚计算；步骤(1)
②
中所述的甲醇水溶液中甲醇的浓度为体积百分比80％；步骤(1)
②
中所述的甲醇水溶液的用量按0.6～1.5g夏枯草籽油配比30ml甲醇水溶液计算；步骤(1)
②
中所述的萃取的次数为1次以上；步骤(1)
②
中所述的除去溶剂为通过蒸干方式除去溶剂；
步骤(1)
①
中所述的甲醇的用量按0.6～1.5g夏枯草籽粉末配比1～3ml甲醇水溶液计算。4.根据权利要求3所述的夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，其特征在于：所述的筛为40-50目的筛；所述的超声提取的条件为于功率80～150w、频率45～50khz提取30～60分钟；步骤(1)
①
中所述的甲醇的用量按2.0～5.0g夏枯草籽粉末配比2ml甲醇水溶液计算；步骤(1)
②
中所述的萃取的次数为2～3次，合并甲醇水溶液相；步骤(1)
①
中所述的甲醇的用量按0.6～1.5g夏枯草籽粉末配比2ml甲醇水溶液计算。5.根据权利要求2所述的夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的对照品溶液中熊果酸的浓度为0.9～1.1mg/ml；步骤(2)中所述的供试品溶液的用量为2～10μl；步骤(2)中所述的对照品溶液的用量为2～10μl。6.根据权利要求2所述的夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸溶液；步骤(3)中所述的显色剂为硫酸乙醇溶液；步骤(3)中所述的加热的温度为105℃；步骤(4)中所述的紫外灯的波长为365nm。7.根据权利要求6所述的夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的展开剂为按体积比8.1～8.3:1.5～1.7:0.1～0.3混合得到的甲苯-乙酸乙酯-甲酸溶液液；步骤(3)中所述的显色剂为10％(v/v)的硫酸乙醇溶液。8.根据权利要求1所述的夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，其特征在于：所述的含量测定的具体步骤如下：1)供试品溶液的制备
①
夏枯草籽供试品溶液的制备：a.取夏枯草籽粉末3.0-6.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精确加入乙酸乙酯100ml，精确称重，超声处理，再称重，补加乙酸乙酯至原来重量，放置澄清，精确吸取上清液50ml，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残余物备用；b.上述残余物加入沸程为60-90℃的石油醚10ml进行溶解，再转移至已装好10g规格为100-200目的硅胶的层析柱上，层析柱的内径为15-20mm；以沸程为60-90℃的石油醚和乙酸乙酯按体积比90:10配比得到的洗脱液a100ml洗脱，洗脱液弃去；然后再以乙酸乙酯和甲醇按体积比80:20配比得到的的洗脱液150ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加无水乙醇80ml溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
②
夏枯草籽油供试品溶液的制备：称取夏枯草籽油样品0.30-0.80g，精密称定，加入沸程为60-90℃的石油醚10ml进行溶解，再转移至已装好10g规格为100-200目的硅胶的层析柱上，层析柱的内径为15-20mm；以沸程为60-90℃的石油醚和乙酸乙酯按体积比90:10配比得到的洗脱液a100ml洗脱，洗脱液弃去；然后再以乙酸乙酯和甲醇按体积比80:20配比得到的的洗脱液150ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加无水乙醇80ml溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；2)三萜对照品溶液的制备：取三萜对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每lml含0.1mg的溶液，即得三萜对照品溶液；3)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分别置15ml具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，摇匀，在70℃水浴中加热15分钟，立即置冰浴中冷却5分钟，取出，精密加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，在545nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线；(4)测定法：精密量取供试品溶液0.2ml，置15ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中三萜对照品的含量，计算，得到供试品的总三萜含量。9.根据权利要求8所述的夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法，其特征在于：步骤1)
①
中所述的超声提取的条件为于功率50～200w、频率40～60khz提取20～80分钟；步骤2)中所述的三萜对照品为熊果酸或齐墩果酸；步骤3)中所述的香草醛冰醋酸溶液通过如下步骤得到：精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，得到香草醛冰醋酸溶液。10.权利要求1～9任一项所述的检测方法在夏枯草籽及夏枯草籽油开发中的应用。

技术总结
本发明公开了一种夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸及总三萜含量的检测方法及应用。该检测方法通过利用薄层色谱法对夏枯草籽及夏枯草籽油中熊果酸进行定性鉴别；利用柱分离将干扰总三萜测定的油脂类成分分离去除，再以熊果酸或齐墩果酸为对照，用分光光度法对夏枯草籽及夏枯草籽油中的总三萜进行含量测定，克服了以往油类成分中总三萜含量测定的干扰及虚假高含量的问题。具有准确度和精密度高、稳定性和重复性好等优点，提供了夏枯草籽及夏枯草籽油开发利用中三萜类成分质量检测的方法，具有较强的专属性和良好的重现性。较强的专属性和良好的重现性。较强的专属性和良好的重现性。


技术研发人员：陈斌 李颖 陈火林 陈娇 程昌奎
受保护的技术使用者：江西鑫康健科技发展有限公司
技术研发日：2022.03.10
技术公布日：2023/9/13