一种按比例转化成丹酚酸A的丹参酚酸转化产物、制备方法、工艺参数确定方法及其用途

一种按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物、制备方法、工艺参数确定方法及其用途
技术领域
1.本发明涉及一种按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物、制备方法、工艺参数确定方法及其用途，属于医药技术领域。


背景技术：

2.丹参为唇形科植物，药用部位为干燥的根及根茎，是我国在冠心病等心血管疾病中的常用药物，具有活血化瘀、治疗胸痹心痛的疗效。丹参的有效成分主要为水溶性成分和脂溶性成分。其中水溶性成分主要为丹酚酸b，而丹酚酸a的含量很低。有研究表明丹酚酸b和丹酚酸a对冠心病、心绞痛等心血管方面的疾病都具有比较好地治疗作用。临床上已有以丹酚酸b为主要有效成分的注射用丹参多酚酸盐，用于治疗冠心病、心绞痛等心血管疾病。而丹酚酸a也具有较强的抗氧化作用，可以有效抑制细胞膜所受的氧化应激损伤并减轻心肌缺血再灌注损伤；具有良好的抗血小板聚集作用，可以有效降低血液黏度，显著升高血小板中camp含量，抑制胶原涂层表面血小板黏附，抑制血小板与纤维蛋白原结合；还具有抗肝纤维化和预防糖尿病并发症药理活性。
3.丹酚酸b与丹酚酸a具有协同作用，配伍使用疗效更好。丹酚酸a和丹酚酸b不同配比(4:1，2:1，1:1，1:2，1:4)均能显著减少大鼠心肌缺血再灌注损伤所致的大鼠心肌梗死范围，且单独使用丹酚酸a或者丹酚酸b效果不如二者配伍组明显，各配比组中以丹酚酸a：丹酚酸b为2∶1配比效果最显著(王国振等，丹酚酸a/丹酚酸b不同配比对大鼠心肌缺血再灌注性损伤的保护作用,河北中医药学报,2006,21(2):4-5,12)。
4.但由于丹参或白花丹参等同属植物中丹酚酸a的含量不高，难以满足工业化生产，限制了丹酚酸a的应用。目前，丹酚酸b转化为丹酚酸a的方式主要有两种：(1)将丹酚酸b的水溶液调节一定的ph值，在高温高压条件下转化为丹酚酸a(王颖等，高温高压转化合成丹酚酸a的工艺研究，大连工业大学学报，2011,30(6)：412-415；姜峰等，丹参中丹酚酸a转化方法，中成药，2018,40(9)：2091-2096)；(2)将丹参或白花丹参等同属植物的药材粉末，加入酸或碱液，调节一定的ph值，在高温高压条件下，使丹酚酸b在植物组织中转化为丹酚酸a(孙隆儒等，一种丹酚酸a高含量的药材、制备方法和用途,zl 2012 1 0334295.7)。但上述两种方法仍然存在不足之处：方法(1)(前者)，丹酚酸b以及转化生产的丹酚酸a均在水溶液中，因水溶液的温度较高，而丹酚酸b和丹酚酸a在水溶液中(尤其温度较高时)稳定性较差，影响其收率；此外，水溶液中丹酚酸b的最佳浓度为5mg/ml，限制了每一次转化丹酚酸a的投料量。方法(2)(后者)：虽然丹酚酸b转化为丹酚酸a是在药材植物组织中进行，稳定性较好，但因药材的体积比较大，实际操作过程中所处理的药材量受到限制，影响了该方法在工业生产过程中的应用。


技术实现要素：

5.为克服现有技术的不足之处，本发明提供一种按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸
转化产物、制备方法、工艺参数确定方法及其用途。本发明通过将丹参或其它作丹参使用的鼠尾草属药材中的丹酚酸b提取出来，使其被吸附在大孔吸附树脂上，然后在大孔吸附树脂上使丹酚酸b转化成丹酚酸a，制备得到含有丹酚酸a和丹酚酸b的丹参酚酸转化产物；方法简单，成本低，产物稳定性好，损失小，适合工业化生产。
6.本发明可以根据丹酚酸a和丹酚酸b具体比例需求，按照本发明工艺参数确定方法高效、准确地优化出所需转化产物工艺参数，方法简便，试验次数少，结果准确度高，可行性强。
7.本发明的丹参酚酸转化产物可用于抗血栓药、抗动脉粥样硬化药物的制备。
8.本发明的技术方案如下：
9.一种按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物，所述丹参酚酸转化产物中包括：丹酚酸b、丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸d、迷迭香酸，且丹参酚酸转化产物中六种成分的总含量不低于60wt％；其中，丹酚酸b、丹酚酸a、丹参素为主要成分，占六种成分总量的80wt％以上；丹酚酸b和丹酚酸a的含量比可根据需要设定为任意比例；所述丹参酚酸转化产物是以鼠尾草属植物药材为原料，经提取丹酚酸b、将丹酚酸b吸附在大孔吸附树脂上、根据需要按比例将丹酚酸b转化成丹酚酸a、然后分离得到丹参酚酸转化产物。
10.上述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的制备方法，包括步骤：
11.(1)丹酚酸b的提取
12.以水为溶剂，采用超声提取法：将鼠尾草属植物药材粉碎，过40目筛；加入蒸馏水，在40～80℃条件下超声提取20～60分钟，过滤得滤液和药渣；所得药渣重复上述超声提取步骤1～5次；合并滤液得丹酚酸b提取液。
13.(2)吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂的制备
14.将丹酚酸b提取液全部上样至大孔吸附树脂柱上，流速为每分钟0.5～1ml，待滤液流尽，用1～5倍保留体积的蒸馏水洗脱，流速为每分钟0.5～2ml，获得吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂为d101、hpd100、hpd300、hpd450、hpd600或hpd700。
15.(3)丹参酚酸转化产物的转化
16.将吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂用ph＝1.0～5.0的酸性溶液湿润，置入高温高压蒸汽灭菌锅中，在105～125℃条件下处理1～5小时，得吸附有丹参酚酸转化产物的大孔吸附树脂；所述酸为盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、甲酸或乙酸。
17.(4)丹参酚酸转化产物的分离
18.将吸附有丹参酚酸转化产物的大孔吸附树脂装柱进行洗脱，或，将吸附有丹参酚酸转化产物的大孔吸附树脂进行超声提取；然后经减压浓缩，或经减压浓缩、冻干，得丹参酚酸转化产物。
19.根据本发明优选的，步骤(1)中，鼠尾草属植物为丹参、白花丹参、云南丹参、南丹参、甘肃丹参、褐毛丹参、土丹参、白背丹参、三对叶丹参或小丹参。
20.根据本发明优选的，步骤(1)中，蒸馏水的质量为药材粉末质量的5～40倍；优选的，蒸馏水的质量为药材粉末质量的20～40倍；更优选为30倍。
21.根据本发明优选的，步骤(1)中，提取温度为60～80℃，优选为73℃。
22.根据本发明优选的，步骤(1)中，提取时间为30～50分钟，优选为41分钟。
23.根据本发明优选的，步骤(1)中，重复超声提取步骤2～4次，优选为2次。
24.根据本发明优选的，步骤(1)中，通过星点设计-效应面法对液料比、提取时间及提取温度进行细致的考察，得出最佳丹酚酸b提取工艺的液料比、提取时间和提取温度工艺参数。
25.根据本发明优选的，步骤(2)中，大孔吸附树脂柱的预处理方法如下：大孔吸附树脂于90-100wt％的乙醇中浸泡20-30h，以90-100wt％的乙醇悬浮，进行湿法装柱；以90-100wt％的乙醇冲至流出液加等量水不变浑浊；以蒸馏水冲柱至流出液无醇味；3～4倍保留体积(bv)的0.5wt％的hcl水溶液冲柱，浸泡2～4h；蒸馏水冲至流出液ph呈中性；3～4倍保留体积(bv)的2wt％的naoh水溶液冲柱，浸泡2～4h；蒸馏水冲至流出液ph呈中性，即完成大孔吸附树脂柱的预处理。
26.根据本发明优选的，步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为hpd450。
27.根据本发明优选的，步骤(2)中，大孔吸附树脂柱中大孔吸附树脂填料的用量(干重)与提取丹酚酸b所用药材粉末的质量比为1:(0.5～3)。
28.根据本发明优选的，步骤(2)中，蒸馏水洗脱的保留体积为1～4倍，优选为4倍。
29.根据本发明优选的，步骤(3)中，所述酸为盐酸或硫酸，优选的为盐酸。
30.根据本发明优选的，步骤(3)中，酸性溶液：吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂干重为(1～2):1(v/w，ml/g),优选为1:1(v/w，ml/g)。
31.根据本发明优选的，步骤(3)中，酸性溶液的ph为2.0～5.0，优选ph为3.0。
32.根据本发明优选的，步骤(3)中，反应温度为115～125℃，优选为118.5～125℃。
33.根据本发明优选的，步骤(3)中，反应时间为2～5小时，优选为2～4小时。
34.根据本发明优选的，步骤(3)中，酸性溶液的ph、转化时间、转化温度工艺参数可根据所需丹参酚酸转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比，按本发明转化工艺参数确定方法来确定。
35.根据本发明优选的，步骤(4)中，洗脱溶剂或提取溶剂为水、10wt％～90wt％乙醇水溶液、纯甲醇或任意比例的甲醇-水混合溶液；优选的，洗脱溶剂或提取溶剂为30wt％～60wt％乙醇水溶液或纯甲醇；更优选的，洗脱溶剂或提取溶剂为40wt％～50wt％乙醇水溶液或纯甲醇。
36.根据本发明优选的，步骤(4)中，洗脱溶剂体积为2～8个保留体积；优选的，洗脱溶剂体积为2～6个保留体积；更优选的，洗脱溶剂体积为5～6个保留体积。
37.根据本发明优选的，步骤(4)中，减压浓缩温度均为40～60℃；优选的，减压浓缩温度均为40～50℃；更有选的，减压浓缩温度均为40～45℃。
38.根据本发明优选的，步骤(4)中，洗脱溶剂或提取溶剂为纯甲醇时，所得洗脱液或提取液减压浓缩至无溶剂得丹参酚酸转化产物；或，洗脱溶剂或提取溶剂为乙醇水溶液或甲醇-水混合溶液时，洗脱液或提取液经减压浓缩至小体积、冻干得丹参酚酸转化产物。
39.上述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的转化工艺参数确定方法，包括步骤：
40.(1)以酸性溶液的ph、转化时间、转化温度为考察因素，采用三因素五水平的星点设计-效应曲面法，测定各组转化产物中丹酚酸a、丹酚酸b的质量含量，并以丹酚酸a、丹酚酸b的质量含量为响应值，通过design expert8.0软件进行数据处理，分别建立丹酚酸a(y1)、丹酚酸b(y2)的质量含量与考察因素的拟合方程如下：
41.拟合方程y1：
42.y1＝270.35+66a+106.7b+126.25c+2.7ab+26.72ac+48.03bc-27.31a2+29.97b2+15.35c243.(r2＝0.9514，p＜0.001)
44.拟合方程y2：
45.y2＝886.66-57.79a-141.41b-329.34c-154.25ab-39.3ac+134.42bc+2.99a2+86.55b
2-25.2c246.(r2＝0.9220，p＜0.001)
47.其中：a为酸性溶液的ph，b为转化时间(小时)，c为转化温度(℃)。
48.(2)根据所需的转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比，利用拟合方程y1和拟合方程y2，应用design expert 8.0软件进行分析，预测所需的转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比对应的最佳工艺参数；
49.(3)根据步骤(2)预测的最佳工艺参数以确定最终的最佳工艺参数。
50.根据本发明优选的，步骤(1)中，确定各组转化产物中丹酚酸a、丹酚酸b的质量含量，其测定实验按现有方法即可。
51.根据本发明优选的，步骤(2)中，应用design expert 8.0软件进行分析的方法如下：拟合方程y1所对应的数据集合中，确定丹酚酸a质量含量为37.1～701.5μg/ml范围内所对应的数据集合i；在拟合方程y2所对应的数据集合中，确定丹酚酸b质量含量为191.2～1662.5μg/ml范围内所对应的数据集合ii；根据所需的转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比，对比分析数据集合i和数据集合ii，数据集合i和数据集合ii中考察因素数值最接近所对应的两组数值即为预测的最佳工艺参数。
52.根据本发明优选的，步骤(3)中，以步骤(2)预测的最佳工艺参数为基点，经进一步优化实验，得到最终的最佳工艺参数。以预测的最佳工艺参数为基点，在基点附近微调工艺参数，经进一步小范围的优化实验，来确定最终的最佳工艺参数；优化实验按现有方法即可。
53.本发明的丹参酚酸转化产物的用途，可用于制备抗血栓的药物，特别是用于制备预防动脉粥样硬化病治疗中的血栓形成的药物。优选的，丹参酚酸转化产物中，丹酚酸b和丹酚酸a质量含量比为1:2。
54.本发明的丹参酚酸转化产物或其药学上可接受的盐与药用辅料组合制成不同剂型的药物制剂，用于抗血栓。
55.一种抗血栓的丹参酚酸转化产物的药物组合物，包括本发明的丹参酚酸转化产物或其药学上可接受的盐、一种或多种药学上可接受载体或赋形剂、抗氧化剂。
56.根据本发明优选的，药学上可接受的丹参酚酸转化产物盐是将丹参酚酸转化产物溶于蒸馏水中，以碱化试剂naoh、koh、na2co3、k2co3、nahco3、khco3、mghpo3、mg(h2po3)2中的一种调ph＝6.8～8.0，使其形成钠盐、钾盐或镁盐而制得；优选的碱化试剂是nahco3、khco3或mgh2po3。
57.根据本发明优选的，所述的抗氧化剂选自抗坏血酸钠、抗坏血酸、枸橼酸或焦亚硫酸钠。
58.根据本发明优选的，所述的药物组合物为丹参酚酸转化产物的片剂、胶囊剂、冲
剂、注射用冻干制剂之一，可按照药剂学常规生产工艺制备。
59.所述药物组合物不同剂型的药物制剂详细说明如下：
60.(1)丹参酚酸转化产物片剂、胶囊剂或冲剂的制作，下述原料用量均按占丹参酚酸转化产物的重量百分比记：
61.取丹参酚酸转化产物，加入2～4重量倍的稀释剂i，5wt％～10wt％的湿润剂，4wt％～15wt％的崩解剂，按常规湿法制粒，干燥，整粒，装袋，得冲剂；或者在整粒后的颗粒中再加入0.5wt％～3wt％的润滑剂，混匀，或压片得片剂，或装入胶囊壳得胶囊剂。
62.上述稀释剂i选自淀粉、糖粉、糊精或微晶纤维；
63.上述湿润剂选自水或乙醇；
64.上述崩解剂为羧甲基淀粉钠；
65.上述润滑剂为硬脂酸镁或滑石粉。
66.(2)丹参酚酸转化产物肠溶片剂、肠溶胶囊剂的制作，下述原料用量均按占丹参酚酸转化产物的重量百分比记：
67.取丹参酚酸转化产物，加入预胶化淀粉3～5重量倍，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素1～2重量倍，微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉适量，混匀，用交联聚乙烯吡咯烷酮水溶液制成软材，制粒，干燥，整粒，或压片得片剂，或装入肠溶胶囊壳得肠溶胶囊剂。
68.(3)丹参酚酸转化产物肠溶缓释片剂的制作，下述原料用量均按占丹参酚酸转化产物的重量百分比记：
69.取丹参酚酸转化产物，加入羟丙基甲基纤维素1～2重量倍、微晶纤维素3～5重量倍，适量的淀粉(或糊精)和羧甲基纤维素钠，喷以10wt％聚乙烯砒咯烷酮无水乙醇制软材，制粒，干燥，整粒，加适量的硬脂酸镁，混匀，压片，得缓释片芯；将1～2重量倍的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或丙烯酸树脂l-100溶于乙醇，加入适量的滑石粉，匀浆，以之将缓释片芯包衣，即得其肠溶缓释片剂。
70.(4)丹参酚酸转化产物注射用冻干制剂的制作
71.取丹参酚酸酸转化产物，加入抗氧化剂适量，加入占总体积5％(w/v)的甘露醇，溶解于蒸馏水中，定容，过滤除菌，无菌条件下分装，冷冻干燥，然后在氮气下密封，即得。用时以无菌的注射用水或碳酸氢钠注射用水溶解即可。
72.(5)丹参酚酸转化产物盐注射用冻干制剂的制作
73.取丹参酚酸转化产物，溶于蒸馏水中，加入抗氧化剂适量，加入占总体积5％(w/v)的甘露醇，以碱化试剂khco3水溶液调ph＝6.8～8.0，过滤除去不溶物，再过滤除菌，无菌条件下分装到西林瓶中，冷冻干燥，然后在氮气下密封，即得。
74.本发明的一种丹参酚酸转化产物及其药物组合物制剂，用于抗血栓药物的制备，特别是用于预防动脉粥样硬化病治疗中的血栓形成，对于动脉粥样硬化病有一定辅助治疗的作用。
75.本发明丹参酚酸酸转化产物的制备是经过系统的工艺参数筛选和优化的。首先，采用简单易行的水溶液超声提取法，通过星点设计-效应曲面法对液料比、提取时间及提取温度等影响丹酚酸b提取的主要因素进行细致的考察，得出其最佳提取工艺的液料比、提取时间和提取温度等工艺参数。其次，考虑到丹酚酸b和丹酚酸a在热水中稳定性差的因素，将水提液中的丹酚酸b吸附在大孔吸附树脂上，经水洗脱除水提液中的多糖等水溶性杂质后，
直接将吸附有大量丹酚酸b的大孔吸附树脂置于高温高压高湿条件下处理，将其吸附的丹酚酸b转化为丹酚酸a等酚酸类成分；经星点设计-效应面法，以其主要成分丹酚酸b和丹酚酸a的含量比为指标，应用design expert8.0软件处理实验数据，分别得到丹酚酸b和丹酚酸a的拟合方程，根据这两个拟合方程可以优选出所需丹参酚酸转化产物中丹酚酸b和丹酚酸a的不同比例的转化工艺参数，经过小范围优化实验，达到预期目标。最后，考察了处理后大孔吸附树脂的洗脱及干燥方法。通过上述研究，获得了本发明的一种丹参酚酸转化产物的制备工艺；本发明可以任意优选出含有不同的丹酚酸b和丹酚酸a含量比例的转化工艺参数，从而获得所需的该转化产物。该发明满足于多种不同比例的丹酚酸b和丹酚酸a转化产物需求，方法简单，工艺简便，实验成本低，适用于工业生产。
76.本发明的丹参酚酸酸转化产物有治疗和预防血栓形成的作用，尤其适用于动脉粥样硬化的预防与治疗。
77.与现有技术相比，本发明的优点如下：
78.(1)本发明提供了一种高效、准确地根据要求优化出所需转化产物工艺参数的方法。依据本发明的拟合方程，结合所需丹参酚酸转化产物中的不同丹酚酸b和丹酚酸a的比例，应用design expert8.0软件预测出相应的转化工艺参数，根据预测的工艺参数经进一步少量优化实验即可确定最佳的工艺参数，方法简便，大大减少了试验次数，预测结果准确度高，可行性强，实现了控制产物中丹酚酸a、丹酚酸b含量比的目的。
79.(2)本发明的转化前样品处理是以水为提取溶剂，在加热超声条件下进行提取，所得的水提取液直接进行大孔吸附树脂上样，具有操作简单、节约成本等优点。
80.(3)丹酚酸b是在从药材中提取出来、被吸附于大孔吸附树脂上，然后在高温高压高湿条件下转化为丹酚酸a的，具有以下优点：
①
避免了直接使用药材粉末转化而存在的体积大的问题；
②
转化生成的丹酚酸a和尚未转化的丹酚酸b吸附在大孔树脂上，相比于他们溶解在较大体积的水溶液中，易于冷却处理，稳定性更好，损失更小。
81.(4)本发明所使用的转化原料及转化产物均吸附于固体的大孔吸附树脂上，且提取转化工艺也在大孔吸附树脂上进行，使得在上样、转化、洗脱、干燥等整个生产过程中都易于操作，方法操作简单，实验成本低，适用于工业生产，为丹酚酸a的大量制备和丹参酚酸转化产物的开发利用奠定了基础。
82.(5)本发明制备的丹参酚酸转化产物主要含有丹酚酸a、丹酚酸b、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸d、迷迭香酸。本发明的丹参酚酸酸转化产物可用于抗血栓药、抗动脉粥样硬化药物的制备。
附图说明
83.图1是试验例1中料液比对丹酚酸b提取量的影响。
84.图2是试验例1中提取时间对丹酚酸b提取量的影响。
85.图3是试验例1中提取温度对丹酚酸b提取量的影响。
86.图4是试验例1中提取因素对丹酚酸b提取量的响应面图。
87.图5是试验例2中ph对丹酚酸b转化为丹酚酸a的影响。
88.图6是试验例2中转化时间对丹酚酸b转化为丹酚酸a的影响。
89.图7是试验例2中转化温度对丹酚酸b转化为丹酚酸a的影响。
90.图8是试验例2中转化因素对丹酚酸a含量的响应面图。
91.图9是试验例2中转化因素对丹酚酸b含量的响应面图。
92.图10是试验例3中丹酚酸a的梯度洗脱曲线。
93.图11是试验例3中丹酚酸a的甲醇洗脱曲线。
94.图12是试验例7中下腔静脉血栓模型血栓重量比较图。
95.图13是试验例7中下腔静脉血栓模型血栓面积比较图。
96.图14是实施例1中超声法提取丹酚酸b所得提取液的hplc图谱。
97.图15是实施例1所得丹参酚酸转化产物的hplc图谱。
98.图16是实施例2所得丹参酚酸转化产物的hplc图谱。
99.图17是实施例3所得丹参酚酸转化产物的hplc图谱。
100.图18是实施例4所得丹参酚酸转化产物的hplc图谱。
具体实施方式
101.下面结合实施例、试验例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例以及试验例中所用的原料、设备均为现有技术及市购产品。
102.试验例1：白花丹参中丹酚酸b的最佳提取工艺参数研究
103.提取方法如下：以水为溶剂，采用超声提取法：将白花丹参粉碎，过40目筛；加入蒸馏水，然后进行超声提取，过滤得滤液和药渣；所得药渣重复上述超声提取步骤(即加入蒸馏水，然后再进行超声提取，过滤)2次；合并滤液得丹酚酸b提取液。
104.试验中，以液料比(a)、提取时间(b)、提取温度(c)为考察因素，提取次数为3次，采用三因素五水平的星点设计-效应曲面法，采用常规的hplc测定方法测定各组丹参提取液中丹酚酸b的含量，并以丹酚酸b的含量为响应值，通过design expert8.0软件进行数据处理，优化确定最佳提取工艺。
105.(1)单因素考察
106.影响丹酚酸b提取的主要因素有液料比、提取时间、提取温度，固定其中的两项，考察另一变相的影响程度，结果如图1、图2、图3(见附图)所示，其最佳提取工艺参数为：液料比为1:30，提取时间为40min，温度为70℃。
107.(2)试验设计
108.将料液比为1:30，提取时间为40min，温度为70℃这三个参数分别确定为0水平。各因素与水平的编码如表1所示。将各因素与水平按一定的组合(见表2)进行试验，并测定丹参提取液中丹酚酸b的含量，结果如表2所示。
109.表1实验因素与水平编码表
[0110][0111]
表2中心组合实验设计与结果
[0112][0113][0114]
采用design-expert软件对上述实验结果进行回归模型分析，结果如表3所示，拟
合得二元多项回归方程为：y＝12.44+0.17a+0.18b+1.66c-0.059ab-0.12ac-0.076bc-0.56a
2-0.55b
2-0.64c2，其p《0.01，r2＝0.7682,说明该实验设计可靠，以丹酚酸b提取量为响应值建立的回归模型显著。
[0115]
表3丹参提取液中丹酚酸b含量的回归模型的方差分析
[0116][0117]
注：
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001
[0118]
由上述结果建立其响应曲面图，如图4所示，在温度为60.00～77.32℃、提取时间为31.34～48.66min、料液比为21.34～38.66之间时，丹酚酸b的提取量最高。经design-expert软件分析，优选出最佳提取工艺为30.08倍提取溶剂，72.86℃，超声40.71min，考虑实际因素和工业因素，可将最佳提取工艺改为30倍提取溶剂，73℃，超声41min，提取3次。
[0119]
试验例2：丹酚酸b转化成丹酚酸a的最佳工艺参数研究
[0120]
制备方法如下：按照试验例1最佳提取工艺参数，用8g丹参粉末提取得丹酚酸b水提液，大孔吸附树脂hpd450填料的用量(干重)为10g。将大孔吸附树脂预处理后，再将丹酚酸b水提液全部上样至大孔吸附树脂柱上，流速为每分钟0.5ml，待滤液流尽，用4倍保留体积的蒸馏水洗脱，流速为每分钟1ml，获得吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂。将吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂脱去大部分水分，用10ml盐酸水溶液湿润，再将湿润后的该大孔吸附树脂置入高温高压蒸汽灭菌锅中反应，得吸附有丹参酚酸转化产物的大孔吸附树脂。
[0121]
大孔吸附树脂柱的预处理方法如下：大孔吸附树脂(hpd450)于95wt％的乙醇中浸泡24h，以95wt％的乙醇悬浮，进行湿法装柱；95wt％乙醇冲柱至流出液加等量水不变浑浊；蒸馏水冲柱至流出液无醇味；4倍保留体积(bv)的0.5wt％的hcl水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性；4倍保留体积(bv)的2wt％的naoh水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性，即完成大孔吸附树脂柱的制备。
[0122]
试验以酸性溶液的ph、转化时间、转化温度为考察因素，确定ph为2，转化时间为3小时，转化温度为120℃为0水平，采用三因素五水平的星点设计-效应曲面法，采用常规的hplc测定方法测定各组转化产物中丹酚酸a(saa)、丹酚酸b(sab)的含量，并以丹酚酸a、丹酚酸b的含量为响应值，进行以下试验。其中，用于hplc测定转化产物的甲醇溶液制备方法为：将吸附有丹参酚酸转化产物的大孔吸附树脂置于锥形瓶中，加入50ml甲醇，在室温下超声提取30分钟，过滤，将滤液转移至50ml容量瓶中，用甲醇定容，即可。
[0123]
(1)单因素考察
[0124]
影响酚酸类成分转化的主要因素有ph、转化时间、转化温度，固定其中的两项，考察另一变相的影响程度，结果如图5、图6、图7所示，图中sad为丹酚酸d。在ph为2、转化时间为3小时、转化温度为120℃时，对丹酚酸b转化为丹酚酸a的影响最大，将这三个参数分别确定为0水平。各因素与水平的编码如表4所示。将各因素与水平按一定的组合(见表5)进行实验，并测定转化产物中丹酚酸a和丹酚酸b的含量，结果如表5。
[0125]
表4实验因素与水平编码表
[0126][0127][0128]
表5中心组合实验设计与结果
[0129][0130]
采用design expert8.0软件进行数据处理，对上述实验结果中的丹酚酸a的数据进行回归分析，结果如表6所示，得丹酚酸a的拟合方程y1,相关系数r2＝0.9514，校正决定系数r
2adj
＝0.9076，说明该模型能较好反映各因素与丹酚酸a含量之间的真实关系，并建立其响应曲面图(图8)。
[0131]
y1＝270.35+66a+106.7b+126.25c+2.7ab+26.72ac+48.03bc-27.31a2+29.97b2+15.35c2(p＜0.001)
[0132]
采用design expert8.0软件进行数据处理，对上述实验结果中的丹酚酸b的数据进行回归分析，结果如表7所示，得丹酚酸b的拟合方程y2，相关系数r2＝0.922，校正决定系数r
2adj
＝0.8518，说明该模型能较好反映各因素与丹酚酸b含量之间的真实关系，并建立其响应曲面图(图9)。
[0133]
y2＝886.66-57.79a-141.41b-329.34c-154.25ab-39.3ac+134.42bc+2.99a2+86.55b
2-25.2c2(p＜0.001)表6丹酚酸a的回归模型的方差分析
[0134][0135]
注：
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001
[0136]
表7丹酚酸b的回归模型的方差分析
[0137][0138]
[0139]
注：
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001
[0140]
根据所需的转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比，利用拟合方程y1和拟合方程y2，应用design expert 8.0软件进行分析，预测所需的转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比对应的最佳工艺参数。应用design expert 8.0软件进行分析的方法如下：拟合方程y1所对应的数据集合中，确定丹酚酸a质量含量为39.1～701.5μg/ml范围内所对应的数据集合i；在拟合方程y2所对应的数据集合中，确定丹酚酸b质量含量为191.2～1662.5μg/ml范围内所对应的数据集合ii；根据所需的转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比，对比分析数据集合i和数据集合ii，数据集合i和数据集合ii中考察因素数值最接近所对应的两组数值即为预测的最佳工艺参数。
[0141]
根据上述预测的最佳工艺参数以确定最终的最佳工艺参数。以预测的最佳工艺参数为基点，在基点附近微调工艺参数，按现有优化实验方法，经进一步小范围的优选试验，来确定最终的最佳工艺参数。
[0142]
通过design expert 8.0软件分析结果表明：
[0143]
(1)当所需转化产物中丹酚酸b的含量：丹酚酸a的含量＝2:1时(b2a1)，根据y1可得丹酚酸a的一个转化条件为ph＝2.95，转化时间为3.96小时，转化温度为117.04℃；而根据y2可得丹酚酸b的一个转化条件为ph＝2.96，转化时间为3.99小时，转化温度为118.02℃。以上述预测的最佳工艺参数为基点，在基点附近微调工艺参数，经进一步小范围的优选试验，优化b2a1的最佳转化条件为：ph＝3，转化时间为4小时，转化温度为118.5℃。
[0144]
(2)当所需转化产物中丹酚酸b的含量：丹酚酸a的含量＝1:1时(b1a1)，根据y1可得丹酚酸a的一个转化条件为ph＝2.19，转化时间为3.55小时，转化温度为122.69℃；而根据y2可得丹酚酸b的一个转化条件为ph＝2.17，转化时间为3.51小时，转化温度为123.75℃。以上述预测的最佳工艺参数为基点，在基点附近微调工艺参数，经进一步小范围的优选试验，优化b1a1的最佳转化条件为：ph＝3，转化时间为3.55小时，转化温度为123℃。
[0145]
(3)当所需转化产物中丹酚酸b的含量：丹酚酸a的含量＝1:2时(b1a2)，根据y1可得丹酚酸a的一个转化条件为ph＝2.94，转化时间为3.98小时，转化温度为124.88℃；而根据y2可得丹酚酸b的一个转化条件为ph＝3，转化时间为3.99小时，转化温度为124.92℃。以上述预测的最佳工艺参数为基点，在基点附近微调工艺参数，经进一步小范围的优选试验，优化b1a2的最佳转化条件为：ph＝3，转化时间为4小时，转化温度为124℃。
[0146]
试验例3、洗脱溶剂浓度考察
[0147]
将吸附有丹参酚酸转化产物的大孔吸附树脂装柱，分别用10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％乙醇水溶液5个保留体积进行洗脱，结果如图10所示，40wt％、50wt％乙醇水溶液洗脱效果最好。为获得丹酚酸a、丹酚酸b、丹参素洗脱率更高的洗脱条件，进一步采用40wt％、50wt％乙醇水溶液和纯甲醇为洗脱溶剂再一次考察其洗脱情况，洗脱溶剂用量为5个保留体积，结果如表8所示，结果用纯甲醇洗脱5个保留体积对丹酚酸a、丹酚酸b、丹参素的洗脱效率更高。当采用甲醇洗脱时，每个保留体积收集一份洗脱液，绘制丹酚酸a的甲醇洗脱曲线，结果如附图11所示，甲醇洗脱液体积为6个保留体积，几乎将丹参酚酸转化产物全部洗脱下来。因此，采用40％～50％乙醇或甲醇的洗脱效果最好。
[0148]
表8不同洗脱溶剂的考察
[0149][0150]
试验例4、体内抗血小板聚集率的测定
[0151]
雄性wistar大鼠，体重约220～250g，动物适应性饲养一周，温度25
±
1℃。wistar大鼠随机分为10组，每组6只，分组情况如下：空白对照组：0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)；b2a1(丹酚酸b的含量：丹酚酸a的含量＝2:1)低剂量组：50mg
·
kg-1
；b2a1中剂量组：100mg
·
kg-1
；b2a1高剂量组：150mg
·
kg-1
；b1a1(丹酚酸b的含量：丹酚酸a的含量＝1:1)低剂量组：50mg
·
kg-1
；b1a1中剂量组：100mg
·
kg-1
；b1a1高剂量组：150mg
·
kg-1
；b1a2(丹酚酸b的含量：丹酚酸a的含量＝1:2)低剂量组：50mg
·
kg-1
；b1a2中剂量组：100mg
·
kg-1
；b1a2高剂量组：150mg
·
kg-1
；每天一次，连续灌胃七天，末次给药后5h取血。10％水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血至3.8％枸橼酸钠1：9抗凝的负压采血管。将大鼠血浆1000rpm离心10min制备富血小板血浆(prp)，余下血浆3000rpm离心10min制备贫血小板血浆(ppp)。
[0152]
对上述收集到的实验大鼠血浆，采用比浊法在37℃条件下测定其血小板聚集率。用ppp调零，prp孵育15min，加入诱导剂adp，测定各组血浆对adp诱导的血小板聚集的抑制作用。实验结果如表9所示。
[0153]
试验结果表明，加入不同浓度的各类化合物后，与空白组相比，均能显著抑制由adp诱导的血小板聚集。具体来说，化合物b1a2在浓度为50mg
·
kg-1
时即可显著降低adp诱导的血小板聚集率。b2a1、b1a1和b1a2组抗血小板聚集率呈现良好的量效关系，随给药剂量的增大抗血小板聚集效果逐渐增强。三组的最大抑制率分别为61％、59％和47％，其中b1a2组效果最佳。
[0154]
表9含不同比例丹酚酸b与丹酚酸a的转化产物对血小板聚集率的影响
[0155][0156]
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001与空白对照组比较。
[0157]
试验例5、体内抗凝血试验
[0158]
大鼠给药方法及其血浆制备方法同试验例4。
[0159]
将准备好的各种试剂放置于设置好的半自动凝血分析仪上预热。取上述制备的贫血小板血浆(ppp)，按仪器操作说明检测凝血酶原时间(pt)、活化部分凝血活酶时间(aptt)、纤维蛋白原(fib)和凝血酶时间(tt)，结果如表10所示。
[0160]
试验结果表明，b2a1、b1a1、b1a2三组剂量均对pt、tt无明显作用，但能显著降低aptt。其中b1a2组150mg
·
kg-1
剂量组效果最佳。
[0161]
表10含不同比例丹酚酸b与丹酚酸a的转化产物抗凝血作用
[0162][0163]
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001与空白对照组比较。
[0164]
试验例6、抑制巨噬细胞泡沫化形成的试验
[0165]
六孔板接种人急性单核细胞白血病细胞thp-1，thp-1呈悬浮状态生长，培养于含15％fbs,1％青链霉素混合液的1640培养基中，一般四天传代一次。取生长状态良好的thp-1细胞接种于培养板中，在3％fbs的1640培养基中，加入pma(100ng/ml)诱导24h，换新鲜的含3％fbs的1640培养基，再加入ox-ldl(80μg/ml)诱导48h后，弃培养基，pbs洗一遍，换新鲜3％fbs的1640培养基，加入不同浓度(10、20、30μg/ml)的丹参酚酸转化产物水溶液(丹酚酸b的含量：丹酚酸a的含量＝1:2)处理24h。吸弃培养基，pbs洗两遍，用细胞刮刀收集细胞悬液；离心弃上清(1000rpm，10min)，加入异丙醇，冰浴条件下超声破碎细胞；离心取上清，按试剂盒说明书测定细胞内tc、tg、fc含量，进一步由tc及fc得到ce＝tc-fc，实验结果如表11所示。
[0166]
采用试剂盒测定丹参酚酸转化产物对泡沫细胞内脂质含量的影响，以阿托伐他丁为阳性对照，结果如表11所示，加入ox-ldl后，细胞内的tc、tg、fc、ce的含量均显著升高，较空白组有显著差异(p＜0.001)。丹参酚酸转化产物在浓度为10、20、30μg/ml时，均对细胞内tc、tg、ce含量有显著降低作用，说明丹参酚酸转化产物具有显著的抑制thp-1巨噬细胞泡沫化形成的作用，可用于动脉粥样硬化的治疗。
[0167]
表11丹参酚酸转化产物的抗巨噬细胞泡沫化作用
[0168][0169]
注：b细胞用pma(100ng/ml)处理24小时，然后用ox-ldl(80μg/ml)孵育48小时。
[0170]
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001与ox-ldl(80μg/ml)组比较。
[0171]
###
p＜0.001与空白组比较。
[0172]
试验例7、下腔静脉血栓模型
[0173]
wistar大鼠，雄性，220～250g，随机分为5组，每组6只。分组情况如下，空白对照组：0.5％羧甲基纤维素钠水溶液；阿司匹林组(25mg/kg)；丹参酚酸转化产物(丹酚酸b的含量：丹酚酸a的含量＝1:2)低剂量组(12.5mg/kg)、中剂量组(25mg/kg)、高剂量组(50mg/kg)。所有药物口服给药，每天一次，连续给药七天。末次给药后1h后，10％水合氯醛麻醉，仰卧位固定，剖开腹壁，分离下腔静脉，于左肾静脉与下腔静脉交叉处结扎下腔静脉，缝合腹壁，6h后重新打开腹腔，在结扎处下方2cm处再次结扎血管，取出栓子，用滤纸吸去残余血液后用电子天平称重并记录数据。取下腔静脉血栓组织标本，用4％多聚甲醛固定1h后，冷冻切片，he染色，用显微镜观察，试验结果如图12、图13所示。
[0174]
图12是下腔静脉血栓模型血栓重量比较图，图13是下腔静脉血栓模型血栓面积比较图。由图可知，与模型组相比，阿司匹林组及丹参酚酸转化产物低、中、高三组中的血栓栓重均显著降低、栓面积显著减少，且随丹参酚酸转化产物给药剂量的增加，血栓栓重、栓面积逐渐变小，说明丹参酚酸转化产物能显著抑制下腔静脉血栓的形成，表现出显著的抗血栓形成作用。
[0175]
实施例1：丹酚酸b与丹酚酸a的含量比例为2：1的丹参酚酸转化产物的制备
[0176]
将丹参药材粉碎，使其颗粒的粒径可以通过40目筛，得丹参粉末。取丹参粉末8g，加入30倍量的蒸馏水，在73℃条件下超声提取41分钟，过滤得滤液和药渣；所得药渣重复上述超声提取步骤2次；合并滤液得丹酚酸b提取液，采用常规测定条件进行hplc含量分析，测定结果如图14所示。
[0177]
大孔吸附树脂柱的制备方法如下：大孔吸附树脂(hpd300)于95wt％的乙醇中浸泡24h，以95wt％的乙醇悬浮，进行湿法装柱，大孔吸附树脂填料的用量(干重)与提取丹酚酸b所用药材粉末的质量比为1:1；95wt％乙醇冲柱至流出液加等量水不变浑浊；蒸馏水冲柱至流出液无醇味；4倍保留体积(bv)的0.5wt％的hcl水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性；4倍保留体积(bv)的2wt％的naoh水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性，即完成大孔吸附树脂柱的制备。
[0178]
将上述丹酚酸b提取液全部上样至大孔吸附树脂柱上，流速约为每分钟1ml，待滤液流尽，用4倍保留体积的蒸馏水洗脱，流速约为每分钟1ml，上样完毕，使该大孔吸附树脂柱中的溶剂流干，即得吸附有丹酚酸b提取物的大孔吸附树脂。
[0179]
设置转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a的含量比例为2:1，利用试验例2转化工艺参数中的拟合方程y1和拟合方程y2，应用design expert 8.0软件进行分析，优选出转化工艺中丹酚酸b与丹酚酸a的含量比为2：1的最优转化工艺参数：ph＝3.0的盐酸水溶液浸润，在118.5℃条件下处理4小时。
[0180]
利用上述工艺参数进行转化工艺如下：将上述吸附有丹酚酸b提取物的大孔吸附树脂脱去大部分水分，置于蒸发皿中，以大孔吸附树脂填料(干重)等量(v/w)的ph＝3.0的盐酸水溶液润湿，再置于高压蒸汽灭菌锅中，在118.5℃条件下处理4小时，得处理后的大孔吸附树脂，其吸附有转化后的丹参酚酸转化产物。然后将该处理后的大孔吸附树脂，装入玻璃柱中，以40wt％的乙醇水洗脱5个保留体积，40～45℃下减压浓缩至无醇味，冻干，得转化后丹参酚酸转化产物。hplc色谱法测定丹酚酸b和丹酚酸a的含量，该产物中丹酚酸b和丹酚
酸a的含量约为2:1(见附图15)。该转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸d、迷迭香酸六种成分的总含量为60.69wt％，其中丹酚酸a、丹酚酸b、丹参素的含量占六种成分总量的96wt％。
[0181]
由上述，本发明转化工艺参数确定方法能够根据所需转化产物高效、准确的确定最佳工艺参数。
[0182]
实施例2：丹酚酸b与丹酚酸a的含量比例为1：1的丹参酚酸转化产物的制备
[0183]
将丹参药材粉碎，使其颗粒的粒径可以通过40目筛，得丹参粉末。取丹参粉末10g，加入30倍量的蒸馏水，在70℃条件下超声提取40分钟，过滤得滤液和药渣；所得药渣重复上述超声提取步骤2次；合并滤液得丹酚酸b提取液。
[0184]
大孔吸附树脂柱的制备方法如下：大孔吸附树脂(d101)于95wt％的乙醇中浸泡24h，以95wt％的乙醇悬浮，进行湿法装柱，大孔吸附树脂填料的用量(干重)与提取丹酚酸b所用药材粉末的质量比为5:4；95wt％乙醇冲柱至流出液加等量水不变浑浊；蒸馏水冲柱至流出液无醇味；4倍保留体积(bv)的0.5wt％的hcl水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性；4倍保留体积(bv)的2wt％的naoh水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性，即完成大孔吸附树脂柱的制备。
[0185]
将上述丹酚酸b提取液全部上样至大孔吸附树脂柱上，流速约为每分钟0.5ml，待滤液流尽，用1个保留体积的蒸馏水洗脱，流速约为每分钟0.5ml，上样完毕，使该大孔吸附树脂柱中的溶剂流干，即得吸附有丹酚酸b提取物的大孔吸附树脂。
[0186]
设置转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a的含量比例为1:1，利用试验例2转化工艺参数中的拟合方程y1和拟合方程y2，应用design expert 8.0软件进行分析，优选出转化工艺中丹酚酸b与丹酚酸a的含量比为1：1的最优转化工艺参数：ph＝3.0的盐酸水溶液浸润，在123℃条件下处理3.55小时。
[0187]
利用上述工艺参数进行转化工艺如下：将上述吸附有丹酚酸b提取物的大孔吸附树脂脱去大部分水分，置于蒸发皿中，以大孔吸附树脂填料(干重)等量(v/w)的ph＝3.0的盐酸水溶液润湿，再置于高压蒸汽灭菌锅中，在123℃条件下处理3.55小时，得处理后的大孔吸附树脂，其吸附有转化后的丹参酚酸转化产物。然后将该处理后的大孔吸附树脂，装入玻璃柱中，以50wt％的甲醇水洗脱4个保留体积，40～45℃下减压浓缩至无醇味，冻干，得转化后丹参酚酸转化产物。hplc色谱法测定丹酚酸a和丹酚酸b的含，该产物中丹酚酸b和丹酚酸a的含量约为1:1(见附图16)。该转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸d、迷迭香酸六种成分的总含量为60.41wt％，其中丹酚酸a、丹酚酸b、丹参素的含量占六种成分总量的93wt％。
[0188]
由上述，本发明转化工艺参数确定方法能够根据所需转化产物高效、准确的确定最佳工艺参数。
[0189]
实施例3：丹酚酸b与丹酚酸a的含量比例约为1:2的丹参酚酸转化产物的制备
[0190]
将丹参药材粉碎，使其颗粒的粒径可以通过40目筛，得丹参粉末。取丹参粉末10g，加入30倍量的蒸馏水，在70℃条件下超声提取40分钟，过滤得滤液和药渣；所得药渣重复上述超声提取步骤2次；合并滤液得丹酚酸b提取液。
[0191]
大孔吸附树脂柱的制备方法如下：大孔吸附树脂(hpd450)于95wt％的乙醇中浸泡24h，以95wt％的乙醇悬浮，进行湿法装柱，大孔吸附树脂填料的用量(干重)与提取丹酚酸b
所用药材粉末的质量比为5:4；95wt％乙醇冲柱至流出液加等量水不变浑浊；蒸馏水冲柱至流出液无醇味；4倍保留体积(bv)的0.5wt％的hcl水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性；4倍保留体积(bv)的2wt％的naoh水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性，即完成大孔吸附树脂柱的制备。
[0192]
将上述丹酚酸b提取液全部上样至大孔吸附树脂柱上，流速约为每分钟0.5ml，待滤液流尽，用3倍保留体积的三蒸水洗脱，流速约为每分钟0.5ml，上样完毕，使该大孔吸附树脂柱中的溶剂流干，即得吸附有丹酚酸b提取物的大孔吸附树脂。
[0193]
设置转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a的含量比例为1:2，利用试验例2转化工艺参数中的拟合方程y1和拟合方程y2，应用design expert 8.0软件进行分析，优选出转化工艺中丹酚酸b与丹酚酸a的含量比为1：2的最优转化工艺参数：ph＝3.0的盐酸水溶液浸润，在124℃条件下处理4小时。
[0194]
利用上述工艺参数进行转化工艺如下：将上述吸附有丹酚酸b提取物的大孔吸附树脂脱去大部分水分，置于坩埚中，以大孔吸附树脂填料(干重)等量(v/w)的ph＝3.0的盐酸水溶液润湿，再将其转移至高温高压蒸汽灭菌锅内，在124℃的条件下反应4小时。反应完毕后，取出装有大孔树脂的坩埚，置于冰上冷却后，将该大孔吸附树脂装入玻璃柱中，以纯甲醇洗脱，洗脱6个保留体积，将甲醇洗脱液40～45℃下减压浓缩蒸干，得转化后丹参酚酸转化产物。hplc色谱法测定丹酚酸b和丹酚酸a的含量，该产物中丹酚酸b与丹酚酸a的含量比例约为1：2(见附图17)。该转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸d、迷迭香酸六种成分的总含量为64.85wt％，其中丹酚酸a、丹酚酸b、丹参素的含量占六种成分总量的94wt％。
[0195]
由上述，本发明转化工艺参数确定方法能够根据所需转化产物高效、准确的确定最佳工艺参数。
[0196]
实施例4：丹酚酸b与丹酚酸a的含量比例约为1:3.5的丹参酚酸转化产物的制备
[0197]
将丹参药材粉碎，使其颗粒的粒径可以通过40目筛，得丹参粉末。取丹参粉末10g，加入30倍量的蒸馏水，在70℃条件下超声提取40分钟，过滤得滤液和药渣；所得药渣重复上述超声提取步骤2次；合并滤液得丹酚酸b提取液。
[0198]
大孔吸附树脂柱的制备方法如下：大孔吸附树脂(hpd600)于95wt％的乙醇中浸泡24h，以95wt％的乙醇悬浮，进行湿法装柱，大孔吸附树脂填料的用量(干重)与提取丹酚酸b所用药材粉末的质量比为1:1；95wt％乙醇冲柱至流出液加等量水不变浑浊；蒸馏水冲柱至流出液无醇味；4倍保留体积(bv)的0.5wt％的hcl水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性；4倍保留体积(bv)的2wt％的naoh水溶液冲柱，浸泡3h，蒸馏水冲至流出液ph呈中性，即完成大孔吸附树脂柱的制备。
[0199]
将上述丹酚酸b提取液全部上样至大孔吸附树脂柱上，流速约为每分钟1ml，待滤液流尽，用2个保留体积的蒸馏水洗脱，流速约为每分钟0.5ml，上样完毕，使该大孔吸附树脂柱中的溶剂流干，即得吸附有丹酚酸b提取物的大孔吸附树脂。
[0200]
设置转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a的含量比例为1:3.5，利用试验例2转化工艺参数中的拟合方程y1和拟合方程y2，应用design expert 8.0软件进行分析，优选出转化工艺中丹酚酸b与丹酚酸a的含量比为1：3.5的最优转化工艺参数：ph＝3.5的盐酸水溶液浸润，在125℃条件下处理4小时。
[0201]
利用上述工艺参数进行转化工艺如下：将上述吸附有丹酚酸b提取物的大孔吸附树脂脱去大部分水分，置于蒸发皿中，以大孔吸附树脂填料(干重)等量(v/w)的ph＝3.5的盐酸水溶液润湿，再将该蒸发皿转移至高温高压蒸汽灭菌锅内，在125℃的条件下反应4小时。反应完毕后，取出装有大孔树脂的蒸发皿，将该树脂转移至锥形瓶中，然后置于冰上冷却后，再加入纯甲醇在常温下超声提取30分钟，过滤后，再重复超声2次。将甲醇提取液40～45℃下减压浓缩蒸干，得转化后丹参酚酸转化产物。hplc色谱法测定丹酚酸b和丹酚酸a的含量，该产物中丹酚酸b与丹酚酸a的含量比例约为1：3.5(见附图18)。该转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸d、迷迭香酸六种成分的总含量为63.62wt％，其中丹酚酸a、丹酚酸b、丹参素的含量占六种成分总量的88wt％。
[0202]
由上述，本发明转化工艺参数确定方法能够根据所需转化产物高效、准确的确定最佳工艺参数。

技术特征：
1.一种按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物，其特征在于，所述丹参酚酸转化产物中包括：丹酚酸b、丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸d、迷迭香酸，且丹参酚酸转化产物中六种成分的总含量不低于60wt％；其中，丹酚酸b、丹酚酸a、丹参素为主要成分，占六种成分总量的80wt％以上；丹酚酸b和丹酚酸a的含量比可根据需要设定为任意比例；所述丹参酚酸转化产物是以鼠尾草属植物药材为原料，经提取丹酚酸b、将丹酚酸b吸附在大孔吸附树脂上、根据需要按比例将丹酚酸b转化成丹酚酸a、然后分离得到丹参酚酸转化产物。2.如权利要求1所述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的制备方法，包括步骤：(1)丹酚酸b的提取以水为溶剂，采用超声提取法：将鼠尾草属植物药材粉碎，过40目筛；加入蒸馏水，在40～80℃条件下超声提取20～60分钟，过滤得滤液和药渣；所得药渣重复上述超声提取步骤1～5次；合并滤液得丹酚酸b提取液；(2)吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂的制备将丹酚酸b提取液全部上样至大孔吸附树脂柱上，流速为每分钟0.5～1ml，待滤液流尽，用1～5倍保留体积的蒸馏水洗脱，流速为每分钟0.5～2ml，获得吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂为d101、hpd100、hpd300、hpd450、hpd600或hpd700；(3)丹参酚酸转化产物的转化将吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂用ph＝1.0～5.0的酸性溶液湿润，置入高温高压蒸汽灭菌锅中，在105～125℃条件下处理1～5小时，得吸附有丹参酚酸转化产物的大孔吸附树脂；所述酸为盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、甲酸或乙酸；(4)丹参酚酸转化产物的分离将吸附有丹参酚酸转化产物的大孔吸附树脂装柱进行洗脱，或，将吸附有丹参酚酸转化产物的大孔吸附树脂进行超声提取；然后经减压浓缩，或经减压浓缩、冻干，得丹参酚酸转化产物。3.根据权利要求2所述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，包括以下条件中的一项或多项：i、鼠尾草属植物为丹参、白花丹参、云南丹参、南丹参、甘肃丹参、褐毛丹参、土丹参、白背丹参、三对叶丹参或小丹参；ii、蒸馏水的质量为药材粉末质量的5～40倍；优选的，蒸馏水的质量为药材粉末质量的20～40倍；更优选为30倍；iii、提取温度为60～80℃，优选为73℃；iv、提取时间为30～50分钟，优选为41分钟；v、重复超声提取步骤2～4次，优选为2次；vi、通过星点设计-效应面法对液料比、提取时间及提取温度进行细致的考察，得出最佳丹酚酸b提取工艺的液料比、提取时间和提取温度工艺参数。4.根据权利要求2所述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，包括以下条件中的一项或多项：i、大孔吸附树脂柱的预处理方法如下：大孔吸附树脂于90-100wt％的乙醇中浸泡20-30h，以90-100wt％的乙醇悬浮，进行湿法装柱；以90-100wt％的乙醇冲至流出液加等量水
不变浑浊；以蒸馏水冲柱至流出液无醇味；3～4倍保留体积(bv)的0.5wt％的hcl水溶液冲柱，浸泡2～4h；蒸馏水冲至流出液ph呈中性；3～4倍保留体积(bv)的2wt％的naoh水溶液冲柱，浸泡2～4h；蒸馏水冲至流出液ph呈中性，即完成大孔吸附树脂柱的预处理；ii、所述大孔吸附树脂为hpd450；iii、大孔吸附树脂柱中大孔吸附树脂填料的用量(干重)与提取丹酚酸b所用药材粉末的质量比为1:(0.5～3)；iv、蒸馏水洗脱的保留体积为1～4倍，优选为4倍。5.根据权利要求2所述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，包括以下条件中的一项或多项：i、所述酸为盐酸或硫酸，优选的为盐酸；ii、酸性溶液：吸附有丹酚酸b的大孔吸附树脂干重为(1～2):1(v/w，ml/g),优选为1:1(v/w，ml/g)；iii、酸性溶液的ph为2.0～5.0，优选ph为3.0；iv、反应温度为115～125℃，优选为118.5～125℃；v、反应时间为2～5小时，优选为2～4小时。6.根据权利要求2所述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，酸性溶液的ph、转化时间、转化温度工艺参数可根据所需丹参酚酸转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比，按本发明转化工艺参数确定方法来确定。7.根据权利要求2所述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，包括以下条件中的一项或多项：i、洗脱溶剂或提取溶剂为水、10wt％～90wt％乙醇水溶液、纯甲醇或任意比例的甲醇-水混合溶液；优选的，洗脱溶剂或提取溶剂为30wt％～60wt％乙醇水溶液或纯甲醇；更优选的，洗脱溶剂或提取溶剂为40wt％～50wt％乙醇水溶液或纯甲醇；ii、洗脱溶剂体积为2～8个保留体积；优选的，洗脱溶剂体积为2～6个保留体积；更优选的，洗脱溶剂体积为5～6个保留体积；iii、减压浓缩温度均为40～60℃；优选的，减压浓缩温度均为40～50℃；更有选的，减压浓缩温度均为40～45℃；iv、洗脱溶剂或提取溶剂为纯甲醇时，所得洗脱液或提取液减压浓缩至无溶剂得丹参酚酸转化产物；或，洗脱溶剂或提取溶剂为乙醇水溶液或甲醇-水混合溶液时，洗脱液或提取液经减压浓缩至小体积、冻干得丹参酚酸转化产物。8.如权利要求1所述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的转化工艺参数确定方法，包括步骤：(1)以酸性溶液的ph、转化时间、转化温度为考察因素，采用三因素五水平的星点设计-效应曲面法，测定各组转化产物中丹酚酸a、丹酚酸b的质量含量，并以丹酚酸a、丹酚酸b的质量含量为响应值，通过design expert8.0软件进行数据处理，分别建立丹酚酸a(y1)、丹酚酸b(y2)的质量含量与考察因素的拟合方程如下：拟合方程y1：y1＝270.35+66a+106.7b+126.25c+2.7ab+26.72ac+48.03bc-27.31a2+29.97b2+15.35c2(r2＝0.9514，p＜0.001)
拟合方程y2：y2＝886.66-57.79a-141.41b-329.34c-154.25ab-39.3ac+134.42bc+2.99a2+86.55b
2-25.2c2(r2＝0.9220，p＜0.001)其中：a为酸性溶液的ph，b为转化时间(小时)，c为转化温度(℃)；(2)根据所需的转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比，利用拟合方程y1和拟合方程y2，应用design expert 8.0软件进行分析，预测所需的转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比对应的最佳工艺参数；(3)根据步骤(2)预测的最佳工艺参数以确定最终的最佳工艺参数。9.根据权利要求8所述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的转化工艺参数确定方法，其特征在于，包括以下条件中的一项或多项：i、步骤(2)中，应用design expert 8.0软件进行分析的方法如下：拟合方程y1所对应的数据集合中，确定丹酚酸a质量含量为37.1～701.5μg/ml范围内所对应的数据集合i；在拟合方程y2所对应的数据集合中，确定丹酚酸b质量含量为191.2～1662.5μg/ml范围内所对应的数据集合ii；根据所需的转化产物中丹酚酸b、丹酚酸a质量含量比，对比分析数据集合i和数据集合ii，数据集合i和数据集合ii中考察因素数值最接近所对应的两组数值即为预测的最佳工艺参数；ii、步骤(3)中，以步骤(2)预测的最佳工艺参数为基点，经进一步优化实验，得到最终的最佳工艺参数。10.如权利要求1所述按比例转化成丹酚酸a的丹参酚酸转化产物的用途，其特征在于，可用于制备抗血栓的药物，特别是用于制备预防动脉粥样硬化病治疗中的血栓形成的药物；优选的，丹参酚酸转化产物中，丹酚酸b和丹酚酸a质量含量比为1:2。

技术总结
本发明提供一种按比例转化成丹酚酸A的丹参酚酸转化产物、制备方法、工艺参数确定方法及其用途。本发明通过将丹参或其它作丹参使用的鼠尾草属药材中的丹酚酸B提取出来，使其被吸附在大孔吸附树脂上，然后在大孔吸附树脂上使丹酚酸B转化成丹酚酸A，制备得到含有丹酚酸A和丹酚酸B的丹参酚酸转化产物；方法简单，成本低，产物稳定性好，损失小，适合工业化生产。本发明可以根据丹酚酸A和丹酚酸B具体比例需求，按照本发明工艺参数确定方法高效、准确地优化出所需转化产物工艺参数，方法简便，试验次数少，结果准确度高，可行性强。本发明的丹参酚酸转化产物可用于抗血栓药、抗动脉粥样硬化药物的制备。药物的制备。


技术研发人员：孙隆儒 尹立敏 郑娴静 纪建波 王雨 刘园园
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2022.03.04
技术公布日：2023/9/13