免疫细胞激活剂、抗衰老剂、免疫细胞的激活方法以及防止或预防衰老的方法与流程

1.本发明涉及免疫细胞激活剂、抗衰老剂、免疫细胞的激活方法、以及防止或预防衰老的方法。


背景技术：

2.已知随着年龄增长，在体内衰老细胞增加(非专利文献1)。已知衰老细胞通过免疫细胞(例如，nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、t细胞等)而被排除(例如，非专利文献2)，此外，也报导了通过年龄增长，排除衰老细胞的免疫细胞减少(非专利文献3)，因此可以认为在由年龄增长引起的衰老细胞的除去中，免疫细胞的激活是重要的。
3.已知作为除去衰老细胞的免疫细胞之一的nk细胞的激活标志物nkp30和nkp46通过年龄增长而其表达量减少(非专利文献3)。已知nkp46参与nk细胞与靶细胞之间的免疫突触的形成(非专利文献4)，提示nkp46的表达对于nk细胞的激活而言是非常重要的。
4.已知木槿类或其提取物的发酵物促进表皮细胞的透明质酸合成，已知包含木槿类或其提取物的发酵物并用于改善皮肤中的皱纹和松弛的皮肤外用组合物(专利文献1)。然而，如后述那样，本技术发明者们首次搞清楚了木槿类或其提取物的发酵物激活免疫细胞的效果，迄今为止并未被报导。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本特开2019-34899号公报
8.非专利文献
9.非专利文献1：van deursen jm.,nature.,2014,509:439-446
10.非专利文献2：sagiv a.,and krizhanovsky v.,biogerontology.2013dec；14(6):617-628.
11.非专利文献3：almeida-oliveira a.,et al.,hum immunol.2011apr；72(4):319-329.
12.非专利文献4：hadad u.,et al.,j immunol may 1,2014,192(1supplement)121.13


技术实现要素：

13.发明所要解决的课题
14.本发明的目的是提供将免疫细胞激活的新的免疫细胞激活剂和使用了该免疫细胞激活剂的免疫细胞的激活方法。此外，本发明的目的是提供通过将免疫细胞激活来排除衰老细胞的新的抗衰老剂、和使用了该抗衰老剂的防止或预防衰老的方法。
15.用于解决课题的方法
16.本发明者们进行了深入研究，结果首次发现，木槿类或其提取物的发酵物具有使
免疫细胞激活的作用，从而完成了本发明。即，本发明包含以下发明。
17.[1]免疫细胞激活剂，包含木槿类或其提取物的发酵物作为有效成分。
[0018]
[2]根据项目1所述的免疫细胞激活剂，免疫细胞为nk细胞。
[0019]
[3]根据项目1或2所述的免疫细胞激活剂，其特征在于，通过免疫细胞的激活来排除衰老细胞。
[0020]
[4]根据项目1～3中任一项所述的免疫细胞激活剂，上述木槿类或其提取物的发酵物是通过木槿类或其提取物的乳酸菌发酵而获得的。
[0021]
[5]一种抗衰老剂，其特征在于，包含木槿类或其提取物的发酵物作为有效成分，通过将免疫细胞激活来排除衰老细胞。
[0022]
[6]根据项目5所述的抗衰老剂，上述免疫细胞为nk细胞。
[0023]
[7]根据项目5或6所述的抗衰老剂，上述木槿类或其提取物的发酵物是通过木槿类或其提取物的乳酸菌发酵而获得的。
[0024]
[8]有需要的对象中的免疫细胞的激活方法，包括：
[0025]
向上述对象应用木槿类或其提取物的发酵物，使上述免疫细胞激活。
[0026]
[9]根据项目8所述的方法，上述免疫细胞为nk细胞。
[0027]
[10]根据项目8或9所述的方法，通过上述免疫细胞的激活来排除衰老细胞。
[0028]
[11]根据项目8～10中任一项所述的方法，上述木槿类或其提取物的发酵物是通过木槿类或其提取物的乳酸菌发酵而获得的。
[0029]
[12]防止或预防有需要的对象中的衰老的方法，包括：
[0030]
向上述对象应用木槿类或其提取物的发酵物，通过将免疫细胞激活来排除衰老细胞。
[0031]
[13]根据项目12所述的方法，上述免疫细胞为nk细胞。
[0032]
[14]根据项目12或13所述的方法，上述木槿类或其提取物的发酵物是通过木槿类花提取物的乳酸菌发酵而获得的。
[0033]
发明的效果
[0034]
根据本发明，能够将免疫细胞激活，由此，能够排除衰老细胞。
附图说明
[0035]
图1是为了选择本发明的免疫细胞激活剂或抗衰老剂而使用的筛选方法的示意图。
[0036]
图2是显示由本发明的免疫细胞激活剂或抗衰老剂引起的、nk细胞的激活的图。显示将添加了各浓度的木槿类的发酵物(v/v％)的情况下的nk细胞中的nkp46的mrna的表达量用内源性对照rps9的mrna的表达量进行标准化而得的值。
具体实施方式
[0037]
以下，对用于实施本发明的方式进行说明，但本发明的技术范围不仅仅限定于下述方式。此外，对以下用于实施本发明的方式进行了说明的内容只要没有特别限定，就能够在免疫细胞激活剂、抗衰老剂、免疫细胞的激活方法、和防止或预防衰老的方法的说明中相互适用。另外，在本说明书中被引用的现有技术文献在本说明书中也被援用，其整体被引入
到本说明书中。
[0038]
＜免疫细胞激活剂和抗衰老剂＞
[0039]
在一实施方案中，本发明提供包含木槿类或其提取物的发酵物作为有效成分的免疫细胞激活剂。此外，在其它方案中，本发明提供一种抗衰老剂，其特征在于，包含木槿类或其提取物的发酵物作为有效成分，通过将免疫细胞激活来排除衰老细胞。
[0040]
在本说明书中，所谓“木槿类”，是指锦葵科(malvaceae)木槿属(hibiscus)的植物，可举出例如，玫瑰茄(hibiscus sabdariffa l.)、木槿(hibiscus syriacus)、木芙蓉(hibiscus mutabills)、红秋葵(hibiscus coccineus)、黄槿(hibiscus tiliaceus)、吊灯扶桑(hibiscus schizopetalus)等。在本发明中使用的“木槿类或其提取物”，作为使用部位，可以使用全植株、叶、花部、茎、根、子实等。另外，在使用花部的情况下，开花时期和大小等没有特别限定，能够使用花瓣、或萼、或包含它们全部的部分。
[0041]
调制在本发明中能够使用的“木槿类的提取物”的方法可以使用公知的方法，例如，能够以日本特开2019-34899号公报为参考而调制。作为例示，以下描述调制“木槿类的提取物”的步骤。
[0042]
将木槿类的提取部位根据需要预先水洗而除去了异物后，直接或干燥后，根据需要切细或粉碎，与提取溶剂接触而进行提取。提取能够按照浸渍法等常规方法通过与提取溶剂接触而进行，但也可以使用超临界提取法、水蒸气蒸馏法。
[0043]
作为提取溶剂，可举出水；甲醇、乙醇、丙醇等低级醇类、油醇、硬脂醇、辛基十二烷醇等高级醇类；乙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等多元醇类；乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯、三辛酸甘油酯等酯类；丙酮、甲基乙基酮等酮类；乙基醚、异丙醚等醚类；正己烷、甲苯、氯仿等烃系溶剂等，它们可以单独或二种以上混合使用。
[0044]
使用混合溶剂的情况下的混合比优选例如，如果为水与乙醇的混合溶剂，则以容量比(以下相同)计为1:1～25:1的范围；如果为水与甘油的混合溶剂则为1:1～15:1的范围；或如果为水与1,3-丙二醇或1,3-丁二醇的混合溶剂则为1:1～15:1的范围。
[0045]
在进行提取物的调制的情况下，ph没有特别限定，一般而言优选为ph3～9的范围。根据需要，可以在上述提取溶剂中混配氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾等碱性调节剂、或柠檬酸、盐酸、磷酸、硫酸等酸性调节剂，以成为所希望的ph的方式进行调整。
[0046]
提取温度、提取时间等提取条件根据所使用的溶剂的种类、ph而不同，没有限定，例如，如果是将水或1,3-丁二醇、或水与1,3-丁二醇的混合液作为溶剂的情况，则提取温度可以为0℃～90℃的范围，此外提取时间可以为0.5小时～7天。
[0047]
可以在提取处理之前，或与提取处理同时，根据需要对提取部位实施水解处理。由此，有可能改善该提取物的皮肤刺激性、有效性或保存稳定性等而能够更有效地利用提取物。
[0048]
在本说明书中，所谓“木槿类或其提取物的发酵物”，是将“木槿类或其提取物”通过使用了微生物(例如，乳酸菌、酵母、米曲霉或枯草杆菌等)的公知的发酵处理而获得的，例如，可以以日本特开2019-34899号公报为参考而调制。本发明中能够使用的“木槿类或其提取物的发酵物”优选为通过乳酸菌发酵而获得的，例如，作为将木槿类的提取物通过使用了乳酸菌的发酵而调制出的制品而被市售的
“ハイビゼル
(注册商标)”(也称为“木槿类花发酵提取物”。)(株式会社
テクノーブル
(日本))可以应用于本发明。
[0049]
通过应用本发明，从而免疫细胞能够被激活。在本说明书中，所谓免疫细胞，是在生物体内担负“免疫系统”的作用的细胞，可举出例如，nk细胞、t细胞、b细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞等。能够应用本发明而被激活的免疫细胞优选为nk细胞。
[0050]
所谓nk细胞，是自然杀伤细胞的简称，是作为先天免疫的主要因子起作用的细胞毒性淋巴细胞的1种。nk细胞不表达t细胞抗原受体(tcr)、cd3、和表面免疫球蛋白(ig)b细胞受体，另一方面，通常在人中为cd16(fcγriii)阳性和cd56阳性的细胞。nk细胞为细胞毒性，该细胞质中的小颗粒含有穿孔素、和作为颗粒酶而已知的蛋白酶等特殊的蛋白质。如果在成为死亡的靶标的细胞的附近被释放，则穿孔素在靶细胞的细胞膜形成孔，颗粒酶和相关分子能够从这里进入，凋亡被诱导。
[0051]
nk细胞通常对干扰素或来源于巨噬细胞的细胞因子进行应答而被激活。nk细胞通过被称为“激活受体”和“抑制性受体”的2种表面受体而高度地调节了细胞损伤活性。已知nk细胞在肿瘤的抗宿主中发挥重要的作用，此外，也担负使病毒感染细胞死亡的作用。
[0052]
还已知被激活了的免疫细胞例如nk细胞、t细胞担负排除衰老细胞的作用(sagiv a.,and krizhanovsky v.,biogerontology.2013dec；14(6):617-628.)。其中，已知作为nk细胞的激活标志物而已知的nkp30和nkp46通过年龄增长而其表达量减少(almeida-oliveira a.,et al.,hum immunol.2011apr；72(4):319-329.)。基于以上那样的认识，本发明者们探索了使nk细胞的激活标志物的表达量增加的物质，结果发现上述木槿类或其提取物的发酵物发挥该效果，从而完成了本发明。
[0053]
在本说明书中，所谓“衰老细胞”，是指与正常的细胞相比显示衰老标志物的表达量的上升的细胞。作为衰老标志物，可举出衰老相关酸性β-半乳糖苷酶、p53、p16
ink4a
、p21
cip1
等。已知衰老细胞通过g1期的不可逆的增殖停止而被赋予特征，通过促进细胞周期的进行的基因的抑制、与阻碍细胞周期的p53、p16
ink4a
、p21
cip1
的表达上升参与而形成。
[0054]
衰老细胞可以是起因于复制性的细胞衰老、早熟性的细胞衰老、或通过治疗而被诱发的细胞衰老等的衰老细胞。起因于复制性的细胞衰老的衰老细胞可以是经过了多次细胞分裂例如40次以上、50次以上、60次以上、70次以上、80次以上的细胞分裂的衰老细胞。起因于早熟性的细胞衰老的衰老细胞没有限定，但可以是通过紫外线、活性氧种、环境毒素、吸烟、电离射线、染色质结构的变形、过量的促分裂原信号、致癌性突变等而被诱发的衰老细胞。此外，在其它实施方案中，早熟性的细胞衰老可以通过电离射线而被诱导。在其它特定的实施方案中，早熟性的细胞衰老可以通过使用了ras蛋白质的异位转染而被诱导。起因于通过治疗而被诱发的细胞衰老的衰老细胞可以是通过放射线疗法、化学疗法、dna损伤疗法等而被诱导的衰老细胞。
[0055]
通过使用本发明而能够排除的衰老细胞一般可以是真核细胞。作为衰老细胞的例子，可举出例如，乳腺上皮细胞、角质形成细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞(大血管)、内皮细胞(微小血管)、上皮细胞、成纤维细胞、毛乳头细胞、肝细胞、黑素细胞、成骨细胞、脂肪前体细胞、免疫系统的细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、神经元、神经胶质细胞、收缩性细胞、外分泌性上皮细胞、细胞外基质细胞、激素分泌细胞、角化上皮细胞、胰岛细胞、晶状体细胞、间充质干细胞、胰脏的腺癌细胞、小肠的帕内特细胞、造血系统的细胞、神经系统的细胞、支持感觉器官和外周神经细胞的细胞、以及湿润复层屏障上皮细胞等，但不限定于此。
[0056]
各种器官、组织中的衰老细胞的数通常随着年龄而增加。衰老细胞的蓄积能够进一步推进衰老和衰老相关疾病下的劣化。例如，衰老了的组织中的衰老细胞的蓄积能够造成年龄相关组织功能损伤、再生能力的减少、和疾病。在一实施方案中，衰老细胞蓄积了的衰老组织缺乏对需要增殖的胁迫进行应答的能力，由此，发生随着衰老而出现的健康性的减少。因此，在一实施方案中，通过应用本发明，从而衰老细胞通过免疫细胞而被排除，能够防止或预防衰老。
[0057]
在一实施方案中，本发明可以作为包含上述免疫细胞激活剂或抗衰老剂的组合物而被提供。本发明的组合物可以是粉末状、液状、固体状、颗粒状、糊状、凝胶状、乳液状、霜状、片状、喷射状、泡状等各种形态。
[0058]
关于本发明的组合物中的免疫细胞激活剂或抗衰老剂的含量，只要包含对于免疫细胞激活而言有效的量即可，没有特别限定。
[0059]
进一步，本发明的组合物可以根据需要任意选择而并用添加剂。作为添加剂，可以包含赋形剂等。
[0060]
作为赋形剂，只要是在制成所希望的形态时通常使用的任意皆可，可举出例如，小麦淀粉、稻淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、糊精、环糊精等淀粉类、结晶纤维素类、乳糖、葡萄糖、砂糖、还原麦芽糖、糖浆、低聚果糖、低聚乳果糖等糖类、山梨糖醇、赤糖藓醇、木糖醇、乳糖醇、甘露糖醇等糖醇类。这些赋形剂可以单独或二种以上组合使用。
[0061]
此外，本发明的组合物根据需要可以适当选择而使用其它成分，例如着色剂、保存剂、增稠剂、粘合剂、崩解剂、分散剂、稳定剂、胶凝剂、抗氧化剂、表面活性剂、保存剂、ph调节剂、油分、粉末、色料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、有机硅类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、香料、各种药效成分、防腐剂、ph调节剂、中和剂等公知物质。
[0062]
＜免疫细胞的激活方法、和防止或预防衰老的方法＞
[0063]
在一实施方案中，本发明提供有需要的对象中的免疫细胞的激活方法，包括：
[0064]
向上述对象应用木槿类或其提取物的发酵物，使上述免疫细胞激活。
[0065]
此外，在其它实施方案中，本发明提供防止或预防有需要的对象中的衰老的方法，包括：
[0066]
向上述对象应用木槿类或其提取物的发酵物，通过将免疫细胞激活来排除衰老细胞。
[0067]
在本说明书中，所谓“对象”，是包含人的哺乳动物，优选为人对象。关于应用木槿类或其提取物的发酵物的方法，可举出例如，局部施与(皮肤上、吸入、灌肠、滴眼、滴耳、经鼻、阴道内等)、经肠施与(经口、经管、经注射等)、非经口施与(经静脉、经动脉、经皮、肌内注射等)。
[0068]
实施例
[0069]
以下，基于实施例进一步详细地说明本发明，但它们丝毫不限定本发明。
[0070]
1.材料
[0071]
在本实施例中使用了以下材料。
[0072]
·
原代培养人nk细胞(promocell社)
[0073]
·
培养基：20％的胎牛血清和必需氨基酸/非必需氨基酸添加rpmi1640培养基(
ナカライテスク
社)
[0074]
·
木槿类花发酵提取物(
ハイビゼル
(注册商标)，目录号：05694，株式会社
テクノーブル
(日本))
[0075]
2.实验方法
[0076]
将市售(promocell社)的原代培养人nk细胞用20％的胎牛血清和必需氨基酸/非必需氨基酸添加rpmi1640培养基(
ナカライテスク
社)进行了培养(37℃，湿度100％，5％co2)。
[0077]
将悬浮于1ml的培养基的4
×
10＾5个nk细胞接种于24孔的板，将用pbs稀释了的木槿类花发酵提取物(05694)以图2所记载的浓度添加了。在24小时培养后，从回收了的细胞使用rneasyplus(qiagen社)提取rna，使用goscripttranscriptse(promega社)合成了cdna。基于该cdna，使用gotaqqpcr试剂(promega社)进行了nkp46基因和核糖体s9基因的半定量pcr(lightcycler480；roche社)。所使用的引物为作为持家因子的核糖体s9基因：5
’‑
tgctgacgcttgatgagaag-3’、5
’‑
cgcagagaagtcgatgtg-3’、nkp46基因：5
’‑
ccaccgagggacataccgat-3’、5
’‑
gtgcaaggctggtgttctca-3’，将nkp46基因的表达量除以核糖体s9基因的表达量而进行了标准化。所得的结果用统计软件spss上的多重比较检验(tukey)而检验了显著性。
[0078]
3.结果
[0079]
木槿类花发酵提取物以0.01(v/v)％以上的浓度，促进了原代培养人nk细胞的激活标志物(nkp46)的表达(n＝4，＊p＜0.001)(图2)。

技术特征：
1.免疫细胞激活剂，包含木槿类或其提取物的发酵物作为有效成分。2.根据权利要求1所述的免疫细胞激活剂，免疫细胞为nk细胞。3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞激活剂，其特征在于，通过免疫细胞的激活来排除衰老细胞。4.根据权利要求1～3中任一项所述的免疫细胞激活剂，所述木槿类或其提取物的发酵物是通过木槿类或其提取物的乳酸菌发酵而获得的。5.一种抗衰老剂，其特征在于，包含木槿类或其提取物的发酵物作为有效成分，通过将免疫细胞激活来排除衰老细胞。6.根据权利要求5所述的抗衰老剂，所述免疫细胞为nk细胞。7.根据权利要求5或6所述的抗衰老剂，所述木槿类或其提取物的发酵物是通过木槿类或其提取物的乳酸菌发酵而获得的。8.有需要的对象中的免疫细胞的激活方法，包括：向所述对象应用木槿类或其提取物的发酵物，使所述免疫细胞激活。9.根据权利要求8所述的方法，所述免疫细胞为nk细胞。10.根据权利要求8或9所述的方法，通过所述免疫细胞的激活来排除衰老细胞。11.根据权利要求8～10中任一项所述的方法，所述木槿类或其提取物的发酵物是通过木槿类或其提取物的乳酸菌发酵而获得的。12.防止或预防有需要的对象中的衰老的方法，包括：向所述对象应用木槿类或其提取物的发酵物，通过将免疫细胞激活来排除衰老细胞。13.根据权利要求12所述的方法，所述免疫细胞为nk细胞。14.根据权利要求12或13所述的方法，所述木槿类或其提取物的发酵物是通过木槿类或其提取物的乳酸菌发酵而获得的。

技术总结
本发明提供免疫细胞激活剂，包含木槿类或其提取物的发酵物作为有效成分。此外，本发明提供一种抗衰老剂，其特征在于，包含木槿类或其提取物的发酵物作为有效成分，通过将免疫细胞激活来排除衰老细胞。此外，本发明提供有需要的对象中的免疫细胞的激活方法，包括向上述对象应用木槿类或其提取物的发酵物，使上述免疫细胞激活。此外，本发明提供一种防止或预防有需要的对象中的衰老的方法，包括通过向上述对象应用木槿类或其提取物的发酵物，将免疫细胞激活，从而排除衰老细胞。从而排除衰老细胞。从而排除衰老细胞。


技术研发人员：细井纯一 长谷川达也
受保护的技术使用者：株式会社资生堂
技术研发日：2021.02.19
技术公布日：2023/9/13