一种山莨菪多倍体的高效诱导方法与流程

1.本发明涉及一种山莨菪多倍体的高效诱导方法，属于中药材生物技术和育种领域。


背景技术：

2.山莨菪（anisodus tanguticus(maxim.) pascher），是茄科山莨菪属的多年生草本植物。山莨菪性味苦、辛，温，有大毒。具有镇痛解痉、活血去瘀、止血生肌的功效。山莨菪采收地上开花期，地下部分秋末挖取，洗净晒干，或切片晒干。山莨菪一般用种子繁殖。山莨菪出苗较慢，多数要40~60天才能齐苗，幼苗生长也较缓慢。目前报道的文献主要是针对山莨菪幼苗及引种栽培，如申请号：cn202111179367.0，发明名称：一种山莨菪幼苗的栽培方法，提供了一种山莨菪幼苗的栽培方法，包括整地、按照株行距(20～60)cm
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50cm移苗定植、田间管理，所述田间管理包括施肥，所述肥施肥包括在定植的土壤中施基肥和定植后施肥的步骤。申请号：cn03134608.1，发明名称：山莨菪植物的引种栽培方法，涉及一种山莨菪植物引种栽培方法,该方法包括种子处理技术、人工育苗技术和引种栽培技术。
3.多倍体植物通常比其同种的正倍体植物具有一些独特的特征。首先，多倍体植物的细胞和组织通常比正倍体植物更大。这是因为细胞中的染色体数量增加，导致细胞体积的增加。其次，多倍体植物的生长速度和生长力通常更强，能够适应更广泛的环境条件。此外，多倍体植物的花朵和果实可能比正倍体植物更大、更鲜艳，药用成分含量更高。这些特征使得多倍体植物在园艺和农业领域具有较大的应用潜力。目前尚无诱导山莨菪植物多倍体的报道，本发明通过对植物种子进行物理和化学处理,使山莨菪植物的多倍体诱导率达70%以上，为山莨菪植物的多倍体育种工作提供优良的材料。


技术实现要素：

4.本发明的技术方案是提供了一种山莨菪多倍体的高效诱导方法，为多倍体育种研究提供了优良材料，解决山莨菪植株中生物碱含量低、抗逆性差等问题。
5.本发明提供了一种山莨菪多倍体的高效诱导方法，它包括如下步骤：a、取山莨菪种子清洗，置于0.02%~0.1%的赤霉素溶液中浸泡12~36h，清洗干净；b、在温度为20~30℃条件下使用诱导剂，浸泡32~40h，清洗；所述的诱导剂是由下述重量百分含量的原料组成：二甲基亚砜0.5%~1.5%、秋水仙素0.5%~1.5%；c、置于育苗盘中培育，温度为22~28℃，光照时间8~16h/d。
6.其中，a步骤所述的赤霉素溶液的浓度为0.08%，浸泡24h。
7.其中，b步骤所述的诱导剂是由下述重量百分含量的原料组成：二甲基亚砜0.5%、秋水仙素1%。
8.其中，b步骤所述的浸泡时间为36h。
9.其中，c步骤育苗盘中培育条件为：温度为25℃，光照时间12h/d。
10.本发明通过二甲基亚砜和秋水仙素诱导山莨菪的多倍体，大幅提高药用成分莨菪
烷类生物碱的含量，改善品质，增加抗病性和逆境适应能力。
附图说明
11.图1是诱导前后幼苗的比较（左：诱导后幼苗右：正常幼苗）。
12.图2是诱导前后胚根的比较（左：正常胚根右：诱导后胚根）。
13.图3是子叶形状的比较（左：诱导前子叶右：诱导后子叶）。
14.图4是表皮细胞气孔的比较（a诱导前气孔b诱导后气孔）。
实施方式
15.实施例1本发明山莨菪多倍体的高效诱导方法将山莨菪种子用蒸馏水清洗3次，去除漂浮的种子，然后置于0.08%的赤霉素溶液中浸泡24h后，蒸馏水清洗干净。然后于30℃下，使用1%的二甲基亚砜和0.5%秋水仙素的混合溶液中浸泡36h，清洗干净。置于育苗盘中培育，温度为25℃，光照时间12h/d。
16.实施例2本发明山莨菪多倍体的高效诱导方法将山莨菪种子用蒸馏水清洗3次，去除漂浮的种子，然后置于0.02%的赤霉素溶液中浸泡12h后，蒸馏水清洗干净。然后于20℃下，使用0.5%的二甲基亚砜和0.5%秋水仙素的混合溶液中浸泡32h，清洗干净。置于育苗盘中培育，温度为22℃，光照时间8h/d。
17.实施例3本发明山莨菪多倍体的高效诱导方法将山莨菪种子用蒸馏水清洗3次，去除漂浮的种子，然后置于0.1%的赤霉素溶液中浸泡36h后，蒸馏水清洗干净。然后于30℃下，使用1.5%的二甲基亚砜和1.5%秋水仙素的混合溶液中浸泡40h，清洗干净。置于育苗盘中培育，温度为28℃，光照时间16h/d。
18.以下通过具体功效学试验证明本发明的有益效果。
19.试验例1赤霉素对山莨菪种子萌发的影响山莨菪种子用蒸馏水清洗3次，去除漂浮的种子，分别使用0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.1%的赤霉素（ga3）浸泡24h，置于育苗盘中培育，10天以后，统计山莨菪种子的萌发率如下。
20.表1赤霉素对山莨菪种子萌发的影响
21.结论：由表中结果可知，赤霉素对山莨菪种子的萌发具有显著的促进作用，未使用赤霉素浸种的对照组，种子萌发率仅为3.2%，而0.08%赤霉素浸种的山莨菪种子萌发率达到了90.0%。这说明赤霉素可以显著提高山莨菪种子的发芽能力，它的作用是必不可少的。
22.试验例2多倍体诱导剂的筛选将山莨菪种子用蒸馏水清洗3次，去除漂浮的种子，使用0.08%赤霉素浸种24h。室
温下，分别使用秋水仙素、富民隆、氨磺灵、二甲基亚砜和氟乐灵溶液浸泡24h，蒸馏水清洗掉诱导剂，置于育苗盘中培育。10天以后，统计山莨菪多倍体诱导率。
23.表2 不同诱导剂对山莨菪多倍体诱导的影响
24.结论：不同植物对于特定的诱导剂可能有不同的响应，因此选择适合目标植物的诱导剂是十分重要的。由表2可知，秋水仙素作为诱导剂诱导山莨菪多倍体的效果最好，10天后多倍体诱导率达到了41.6%；二甲基亚砜的诱导效果次之，诱导率为22.1%。清水和氟乐灵对山莨菪多倍体没有诱导作用，诱导率都为0%。
25.试验例3 本发明山莨菪多倍体诱导最佳条件筛选试验为获得山莨菪多倍体诱导的最佳条件，设计l9（34）正交实验表（表3）探究秋水仙素浓度（0.5%、1.0%、1.5%）、二甲基亚砜浓度（0.5%、1.0%、1.5%）、浸种时间（24h、36h、48h）和浸种温度（20℃、25℃、30℃）对山莨菪多倍体诱导的影响。选取颗粒饱满、大小均一的山莨菪种子，0.08%赤霉素浸种24h后，按照正交实验表进行相应的处理，置于育苗盘中萌发，培养10天后，统计多倍体诱导率。
26.表3 l9（34）正交实验因子水平表
27.表4 正交实验表结果
28.表5验证实验结果
29.结论：植物多倍体诱导剂的效果受多种因素影响，包括诱导剂种类、浓度、处理时间等，不同植物对于特定的诱导剂可能有不同的响应。一般来说，适当增加诱导剂的浓度可以增加多倍体形成的概率，然而，过高的浓度可能会对植物组织造成伤害，导致不良效果，因此选择适合目标植物的诱导条件是十分重要的。另外，处理时间也是影响多倍体诱导效果的重要因素。诱导剂处理时间过短可能导致不充分的细胞再生和多倍体形成，而过长的处理时间可能导致细胞愈伤组织的过度分化，降低多倍体形成率。
30.在以多倍体诱导率为指标时，通过极差分析四个因素的影响大小为a》c》d》b，即秋水仙素的影响最大的，浸种时间、浸种温度次之，二甲基亚砜的影响最小；根据各水平的均值大小来看，山莨菪多倍体诱导的最佳组合为a2b1c2d3，即为1%秋水仙素加0.5%二甲基亚砜在30℃下浸种36h。经过正交实验推理得出的最佳组合，经过表5试验验证，山莨菪多倍体诱导率可以达到71.0%。
31.试验例4本发明制备的多倍体植株与正常植株对比对山莨菪多倍体植株和正常植株进行形态结构、表皮气孔和生物碱含量进行比较。多倍体植株与正常植株在形态结构上存在明显的差异，秋水仙素处理过的植株生长发育较为缓慢，诱变株呈现矮化、增粗、节间缩短、叶色加深、叶片增大增厚的多倍化特征（见图1）。
32.表6正常植株与多倍体植株的形态对比
33.山莨菪多倍体植株与正常植株相比，胚根明显粗壮，生长速度较慢，根毛多，为圆锥形（见图2）。多倍体植株子叶增厚、叶片向下卷曲，叶缘形状不规则、有齿状凸起，叶颜色为深绿色（见图3）。诱导后的山莨菪植株保卫细胞更大，其中的叶绿体数量明显增多，气孔的开口更大（见图4）。
34.在山莨菪植株中，莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱和樟柳碱是植株中常见的几种生物碱，通过高效液相测定正常植株和多倍体植物中生物碱的含量，结果见表7。对比表7中的结果可以发现，山莨菪多倍体植株相较于正常植株在这几种生物碱的含量上都表现出明显的提高。
35.表7 正常植株与多倍体植株生物碱含量对比

技术特征：
1.一种山莨菪多倍体的高效诱导方法，其特征在于：它包括如下步骤：a、取山莨菪种子清洗，置于0.02%~0.1%的赤霉素溶液中浸泡12~36h，清洗干净；b、在温度为20~30℃条件下使用诱导剂，浸泡32~40h，清洗；所述的诱导剂是由下述重量百分含量的原料组成：二甲基亚砜0.5%~1.5%、秋水仙素0.5%~1.5%；c、置于育苗盘中培育，温度为22~28℃，光照时间8~16h/d。2.根据权利要求1所述的山莨菪多倍体的高效诱导方法，其特征在于：a步骤所述的赤霉素溶液的浓度为0.08%，浸泡24h。3.根据权利要求1所述的山莨菪多倍体的高效诱导方法，其特征在于：b步骤所述的诱导剂是由下述重量百分含量的原料组成：二甲基亚砜0.5%、秋水仙素1%。4.根据权利要求1所述的山莨菪多倍体的高效诱导方法，其特征在于：b步骤所述的浸泡时间为36h。5.根据权利要求1所述的山莨菪多倍体的高效诱导方法，其特征在于：c步骤育苗盘中培育条件为：温度为25℃，光照时间12h/d。

技术总结
本发明提供了一种山莨菪多倍体的高效诱导方法，属于中药材育种领域，它包括如下步骤：a、取山莨菪种子清洗，置于0.02%~0.1%的赤霉素溶液中浸泡12~36h，清洗干净；b、在温度为20~30℃条件下使用诱导剂，浸泡32~40h，清洗；所述的诱导剂是由下述重量百分含量的原料组成：二甲基亚砜0.5%~1.5%、秋水仙素0.5%~1.5%；c、置于育苗盘中培育，温度为22~28℃，光照时间8~16h/d。本发明通过二甲基亚砜和秋水仙素诱导山莨菪的多倍体，大幅提高药用成分莨菪烷类生物碱的含量，改善品质，增加抗病性和逆境适应能力。增加抗病性和逆境适应能力。增加抗病性和逆境适应能力。


技术研发人员：覃顺旺 宋艳艳 熊城 岳琴 罗斌 马贞 刘昭华
受保护的技术使用者：成都第一制药有限公司
技术研发日：2023.08.15
技术公布日：2023/9/13