过氧白蜡酮及其制备方法和其应用

1.本发明涉及一种化合物及其制备方法和该化合物的用途。


背景技术：

2.癌症是一种细胞发生改变并无限增殖并最终发展成影响人体正常生理功能的恶性肿瘤。临床上治疗癌症常规的方法是化学治疗、放射治疗及手术等，中医药在治疗癌症中发挥重要作用，从中药中寻找抗癌活性成分一直是该领域的研究热点。
3.炎症是机体对有害刺激如病原体等的复杂生物反应。炎症反应导致疼痛、发热、瘙痒、红胀，甚至诱发过敏、哮喘及肿瘤等。抗炎药物是最常用的药物之一，中药抗炎药物研究具有重要意义。
4.白鲜皮为芸香科植物白鲜(dictamnus dasycarpus turcz.)的干燥根皮。化学成分主要包括柠檬苦素类成分、生物碱类等成分，同时具有抗炎、抗菌及抗肿瘤等活性，但具体抗炎及抗癌药效成分并不清楚。对于白鲜皮还存在很多未知化合物有待开发，需要发现并确定更多活性的化合物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了提供一种具有体外抗肿瘤、抗炎活性的新化合物过氧白蜡酮。
6.本发明的第二个目的是提供了过氧白蜡酮的制备方法。
7.本发明的第三个目的是提供了过氧白蜡酮在抗肿瘤及抗炎中的应用。过氧白蜡酮(peroxyfraxinone)的分子式为c
14h16
o4，分子量为248.1049，分子结构式为：
[0008][0009]
所述过氧白蜡酮的制备方法如下：
[0010]
(1)将白鲜皮粉碎，置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中用体积浓度为95％的乙醇进行提取；
[0011]
(2)将步骤(1)得到的乙醇提取液进行浓缩后用水进行分散，得到混悬液，然后依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取；
[0012]
(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:0、100:1、100:2、100:5和100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，取二氯甲烷和甲醇
体积比为100:10的洗脱物进行反相硅胶柱色谱分离，用体积比为10:90、20:80、30:70的甲醇和水的混合溶剂依次洗脱，取甲醇与水体积比为30:70的洗脱物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:10、100:20、100:30的二氯甲烷与甲醇混合溶剂进行洗脱，收集二氯甲烷与甲醇体积比为100:30的洗脱物进行制备型高效液相色谱分离，收集洗脱时间为第26.7分钟出现的吸收峰，即得到过氧白蜡酮；
[0013]
步骤(3)制备型高效液相色谱以体积比为30:70的甲醇与水为流动相，流速为3ml/min。
[0014]
步骤(1)所述索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，提取温度设定85～90℃。
[0015]
步骤(2)浓缩的条件为-0.05～-0.08mpa。
[0016]
步骤(2)中混悬液密度为1.25g/ml。
[0017]
所述过氧白蜡酮(peroxyfraxinone)用于制备抗炎或抗肿瘤药物。
[0018]
所述抗炎或抗肿瘤药物的剂型包括注射剂、冻干粉针剂或口服制剂。
[0019]
所述口服制剂包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液或缓控释制剂。
[0020]
所述过氧白蜡酮作为抗炎药物的活性成分，该抗炎药物用于抑制lps诱导的小鼠巨噬细胞no释放量。
[0021]
所述过氧白蜡酮作为抗肿瘤药物的活性成分，该抗肿瘤药物用于抑制肺腺癌细胞及肝癌组织细胞。
[0022]
所述过氧白蜡酮用于抑制lps诱导的小鼠巨噬细胞no释放量。作为优选，所述lps诱导的炎症小鼠巨噬细胞包括但不仅限于raw264.7细胞。
[0023]
所述过氧白蜡酮用于抑制肺腺癌细胞及肝癌组织细胞。作为优选，所述肿瘤细胞包括但不仅限于肝癌细胞hepg2细胞。
[0024]
本发明过氧白蜡酮提取自白鲜皮，化学名为1-(furan-3-yl)-5,8a
–
dimethyl-1,7,8,8a
–
tetrahydrobenzo[d][1,2]dioxin
–
6(4h)-one。
[0025]
过氧白蜡酮为白色粉末。比旋光度为红外光谱显示过氧白蜡酮的羰基吸收峰为(1737.7cm-1
)。uv谱中过氧白蜡酮在239nm有最大吸收峰。hr-esi-ms给出分子离子峰：[m-h]-为247.0972，提示分子式为c
14h16
o4。
[0026]
本发明方法获得的过氧白蜡酮的纯度高，达98.5％以上。
[0027]
本发明过氧白蜡酮具有较强的抗炎活性，对lps诱导的小鼠巨噬细胞(raw264.7)no释放量抑制作用的ic50为7.94μm/l。；对肺腺癌细胞(a549)、肝癌组织细胞(hepg2)抑制作用的ic50分别为16.38μm/l、14.43μm/l；具有较好的体外抗肿瘤活性。可将本发明的过氧白蜡酮制成注射剂、冻干粉针、输液剂或口服制剂(包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液和缓控释制剂)等抗炎或抗肿瘤药物。
[0028]
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
[0029]
1、本发明首次获得了新化合物白蜡酮酯，而且该制备方法获得的白蜡酮酯的纯度高，达98.5％以上。
[0030]
2、本发明过氧白蜡酮具有较强的体外抗炎及抗肿瘤活性，对lps诱导的炎症小鼠巨噬细胞(raw264.7)的no释放率的ic50为7.94μm/l；对肺腺癌细胞(a549)、肝癌组织细胞(hepg2)抑制作用的ic50分别为16.38μm/l、14.43μm/l，具有较好的体外抗肿瘤活性。具体
实施方式
[0031]
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0032]
具体实施方式一：本实施方式过氧白蜡酮的分子式为c
14h16
o4，分子量为248.1049，分子结构式为：
[0033][0034]
具体实施方式二：本实施方式过氧白蜡酮的制备方法如下：
[0035]
(1)将白鲜皮100公斤粉碎，置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中用体积浓度为95％的乙醇进行提取；
[0036]
(2)将步骤(1)得到的乙醇提取液进行浓缩后用水进行分散，得到混悬液，然后依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取；
[0037]
(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:0、100:1、100:2、100:5和100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，取二氯甲烷和甲醇体积比为100:10的洗脱物进行反相硅胶(ods，50μm，g1p 4s6 canada)柱色谱分离，用体积比为10:90、20:80、30:70的甲醇和水的混合溶剂依次洗脱，取甲醇与水体积比为30:70的洗脱物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:10、100:20、100:30的二氯甲烷与甲醇混合溶剂进行洗脱，收集二氯甲烷与甲醇体积比为100:30的洗脱物进行制备型高效液相色谱分离，收集洗脱时间为第26.7分钟出现的吸收峰，即得到过氧白蜡酮；
[0038]
步骤(3)制备型高效液相色谱以体积比为30:70的甲醇与水为流动相，流速为3ml/min。
[0039]
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤(1)所述索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，提取温度设定85～90℃。其他与具体实施方式二相同。
[0040]
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二至三之一不同的是步骤(2)浓缩的条件为-0.05～-0.08mpa。其他与具体实施方式二至三之一相同。
[0041]
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是步骤(2)中混悬液密度为1.25g/ml。其他与具体实施方式二至四之一相同。
[0042]
具体实施方式六：具体实施方式一至五所述过氧白蜡酮的应用，所述过氧白蜡酮用于制备抗炎或抗肿瘤药物。
[0043]
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是所述抗炎或抗肿瘤药物的剂型包括注射剂、冻干粉针剂、口服制剂。其他与具体实施方式六相同。
[0044]
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六不同的是所述口服制剂包括片
剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液、缓控释制剂。其他与具体实施方式六一相同。
[0045]
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六不同的是所述过氧白蜡酮作为抗炎药物的活性成分，该抗炎药物用于抑制lps诱导的小鼠巨噬细胞no释放量。其他与具体实施方式六相同。
[0046]
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六不同的是所述过氧白蜡酮作为抗肿瘤药物的活性成分，该抗肿瘤药物用于抑制肺腺癌细胞及肝癌组织细胞。其他与具体实施方式六相同。
[0047]
采用下述实验验证本发明效果：
[0048]
实验一：
[0049]
过氧白蜡酮的制备方法如下：
[0050]
(1)将白鲜皮100公斤粉碎，置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中用体积浓度为95％的乙醇进行提取；
[0051]
(2)将步骤(1)得到的乙醇提取液进行浓缩后用水进行分散，得到混悬液，然后依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取；
[0052]
(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:0、100:1、100:2、100:5和100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，取二氯甲烷和甲醇体积比为100:10的洗脱物进行反相硅胶(ods，50μm，g1p 4s6 canada)柱色谱分离，用体积比为10:90、20:80、30:70的甲醇和水的混合溶剂依次洗脱，取甲醇与水体积比为30:70的洗脱物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:10、100:20、100:30的二氯甲烷与甲醇混合溶剂进行洗脱，收集二氯甲烷与甲醇体积比为100:30的洗脱物进行制备型高效液相色谱分离，收集洗脱时间为第26.7分钟出现的吸收峰，即得到过氧白蜡酮；
[0053]
步骤(3)制备型高效液相色谱以体积比为30:70的甲醇与水为流动相，流速为3ml/min。
[0054]
本实验采用waters2545制备型高效液相色谱，检测器为waters2489型紫外检测器，检测波长为210nm及254nm。色谱柱的填料为c-18反相硅胶。
[0055]
本实验用100kg白鲜皮粉碎、提取，最终获得过氧白蜡酮为7.0mg，纯度达98.5％，过氧白蜡酮的核磁共振数据如表1所示。
[0056]
表1过氧白蜡酮的1h-nmr(600mhz,cdcl3)及
13
c-nmr(150mhz,cdcl3)
[0057][0058]
实验二：
[0059]
将实验一制备的过氧白蜡酮对lps诱导的小鼠巨噬细胞(raw264.7)no释放量抑制作用进行检测：
[0060]
一、将已达到对数生长期的raw264.7细胞以1
×
105/孔接种于96孔板中，于5％co2、37℃的培养箱中培养24h，用含有25ng/ml lps的dmem高糖完全培养基诱导处理24h设置模型组。
[0061]
二、将实验一制备的过氧白蜡酮配制为600mmol
·
l-1
的dmso溶液，用上述培养基进行梯度稀释，设置样品组浓度为60μm/l、30μm/l、15μm/l、7.5μm/l、3.75μm/l。
[0062]
三、向经过步骤一处理的raw264.7细胞中加入步骤二的药物处理24h，加入裂解液裂解细胞，取上清液，检测no生成量。计算no生成抑制率(％)。no生成抑制率(％)＝(no模型组od
540nm
–
no样品组od
540nm
)/no模型组od
540nm
*100％。
[0063]
四、连续重复步骤三3次，采取logit法计算ic50值。测得实验一制备的过氧白蜡酮对lps诱导的炎症小鼠巨噬细胞(raw264.7)的no释放率的ic50为7.94μm/l，具有较好抗炎活性。
[0064]
实验三：
[0065]
将实验一制备的过氧白蜡酮对肺腺癌细胞(a549)、肝癌组织细胞(hepg2)抑制作用进行检测：
[0066]
一、将对数生长期的a549细胞和hepg2细胞以1
×
105/孔接种于96孔板中，于5％co2、37℃的培养箱中培养24h。
[0067]
二、将实验一制备的过氧白蜡酮配制为600mmol
·
l-1
的dmso溶液，再用dmem高糖完全培养基进行梯度稀释，设置样品组浓度为60μm/l、30μm/l、15μm/l、7.5μm/l、3.75μm/l；设置空白组为不含过氧白蜡酮的空白培养基。
[0068]
三、向经过步骤一处理的a549细胞和hepg2细胞中加入步骤二的药物处理24h，弃去上清液，加入mtt溶液，检测细胞抑制率。细胞抑制率(％)＝(mtt空白组od
570nm-mtt样品组od
570nm
)/mtt空白组od
570nm
。
[0069]
四、连续重复步骤三3次，采取logit法计算ic50值。测得实验一制备的过氧白蜡酮对a549细胞和hepg2细胞抑制的ic50分别为16.38μm/l、14.43μm/l。说明其具有较好的体外抗肿瘤活性。

技术特征：
1.过氧白蜡酮，其特征在于所述过氧白蜡酮的分子式为c
14
h
16
o4，分子量为248.1049，分子结构式为：2.权利要求1所述过氧白蜡酮的制备方法，其特征在于所述过氧白蜡酮的制备方法如下：(1)将白鲜皮粉碎，置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中用体积浓度为95％的乙醇进行提取；(2)将步骤(1)得到的乙醇提取液进行浓缩后用水进行分散，得到混悬液，然后依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取；(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:0、100:1、100:2、100:5和100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，取二氯甲烷和甲醇体积比为100:10的洗脱物进行反相硅胶柱色谱分离，用体积比为10:90、20:80、30:70的甲醇和水的混合溶剂依次洗脱，取甲醇与水体积比为30:70的洗脱物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:10、100:20、100:30的二氯甲烷与甲醇混合溶剂进行洗脱，收集二氯甲烷与甲醇体积比为100:30的洗脱物进行制备型高效液相色谱分离，收集洗脱时间为第26.7分钟出现的吸收峰，即得到过氧白蜡酮；步骤(3)制备型高效液相色谱以体积比为30:70的甲醇与水为流动相，流速为3ml/min。3.根据权利要求2所述过氧白蜡酮的制备方法，其特征在于步骤(1)所述索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，提取温度设定85～90℃。4.根据权利要求2所述的过氧白蜡酮的制备方法，其特征在于步骤(2)浓缩的条件为-0.05～-0.08mpa。5.根据权利要求2所述的过氧白蜡酮的制备方法，其特征在于步骤(2)中混悬液密度为1.25g/ml。6.权利要求1所述过氧白蜡酮的应用，其特征在于所述过氧白蜡酮用于制备抗炎或抗肿瘤药物。7.根据权利要求6所述过氧白蜡酮的应用，其特征在于所述抗炎或抗肿瘤药物的剂型包括注射剂、冻干粉针剂、口服制剂。8.根据权利要求7所述过氧白蜡酮的应用，其特征在于所述口服制剂包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液、缓控释制剂。9.权利要求6所述过氧白蜡酮的应用，其特征在于所述过氧白蜡酮作为抗炎药物的活性成分，该抗炎药物用于抑制lps诱导的小鼠巨噬细胞no释放量。
10.权利要求6所述过氧白蜡酮的应用，其特征在于所述过氧白蜡酮作为抗肿瘤药物的活性成分，该抗肿瘤药物用于抑制肺腺癌细胞及肝癌组织细胞。

技术总结
过氧白蜡酮(peroxyfraxinone)及其制备方法和其应用，涉及一种新化合物及其制备方法和该化合物的用途。本发明的目的是为了提供一种过氧白蜡酮、制备方法及其应用。过氧白蜡酮的化学名为1-(furan-3-yl)-5,8a


技术研发人员：郭丽娜 卢宜然
受保护的技术使用者：齐齐哈尔医学院
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/9/14