一种具有改善阴道炎症的罗伊氏乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有改善阴道炎症的罗伊氏乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.阴道炎(vaginitis)即阴道炎症，是导致外阴阴道症状如瘙痒、灼痛、刺激和异常流液的一组病症。正常健康妇女阴道由于解剖组织的特点对病原体的侵入有自然防御功能。临床上常见有：细菌性阴道病、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、老年性阴道炎、幼女性阴道炎。
3.细菌性阴道炎(bv)是一种由阴道加特纳菌和一些厌氧菌的混合感染，导致阴道内微生态平衡失调，引起的阴道分泌物增多，白带有鱼腥臭味及外阴瘙痒灼热的综合征。细菌性阴道炎可分为嗜血杆菌性阴道炎、棒状杆菌阴道炎、厌氧菌性阴道病炎、加特纳菌性阴道炎等。
4.目前，根据感染的原因，用抗生素、抗真菌剂或组合的经口施用或直接施用尝试对患处进行处理。在感染性阴道炎中，阴道加德纳菌、白色念珠菌是引起阴道炎的主要微生物，这些致病菌感染后导致过量的抗生素、应激、由内在因素引起的原发性阴道炎等，阴道中能够产生过氧化氢的乳杆菌的量减少，导致过氧化氢直接杀菌效果减弱以及产乳酸量减少，从而提高了ph值，使得各种细菌易生长。因此，提供一种能够抑制致病菌生长并具有高产过氧化氢的乳酸菌能够为改善女性生殖健康起到重要作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种具有改善阴道炎症的罗伊氏乳杆菌及其应用，所述罗伊氏乳杆菌对阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌均具有一定抑菌作用，同时能够高产过氧化氢，进而本技术罗伊氏乳杆菌能够改善微生物感染导致的阴道炎。
6.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
7.本发明第一方面提供了一种具有改善阴道炎症的罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌具体为罗伊氏乳杆菌(limosilactobacillus reuteri)hr7，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63350，保藏时间为2023年04月14日。
8.本发明第二方面提供了一种含有所述罗伊氏乳杆菌的微生物制剂。
9.本发明第三方面提供了一种上述罗伊氏乳杆菌的后生元。
10.本发明第四方面提供了一种所述罗伊氏乳杆菌、所述微生物制剂和所述后生元中的至少一种在制备阴道护理用品中的应用。
11.本发明第四方面提供了一种所述罗伊氏乳杆菌、所述微生物制剂和所述后生元中至少一种在制备防治阴道炎药物或食品中的应用。
12.优选地，所述阴道炎为白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和阴道加德纳菌中至少一种引发的阴道炎。
13.优选地，所述药物剂型包括洗剂、凝胶剂和软膏剂。
14.本发明第五方面提供了一种用于防治阴道炎的药物，所述药物包括所述罗伊氏乳杆菌、所述微生物制剂和所述后生元中至少一种，以及药学上可接受的辅料。
15.优选地，所述药物剂型包括洗剂、凝胶剂和软膏剂。
16.优选地，所述药物中所述罗伊氏乳杆菌的含量为106～10
10
cfu/ml，后生元的含量为10～100mg/g。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
18.本发明罗伊氏乳杆菌对阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌均具有一定抑菌作用，同时能够高产过氧化氢，进而本技术罗伊氏乳杆菌能够改善微生物感染导致的阴道炎；因此，本技术罗伊氏乳杆菌能够用于制备阴道护理用品以及防治阴道炎的药物，同时能够建立阴道微生态屏障并延缓生殖道衰老，为女性生殖健康提供有力保障。
具体实施方式
19.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
20.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
21.本发明实施例提供了一种具有改善阴道炎症的罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌具体为罗伊氏乳杆菌(limosilactobacillus reuteri)hr7，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63350，保藏时间为2023年04月14日。
22.本发明又一实施例提供了一种含有所述罗伊氏乳杆菌的微生物制剂。
23.本发明再一实施例提供了一种上述罗伊氏乳杆菌的后生元。
24.本发明罗伊氏乳杆菌对阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌均具有一定抑菌作用，同时能够高产过氧化氢，进而本技术罗伊氏乳杆菌能够改善微生物感染导致的阴道炎。
25.本发明又一实施例提供了一种所述罗伊氏乳杆菌、所述微生物制剂和所述后生元中的至少一种在制备阴道护理用品中的应用。
26.本发明另一实施例提供了一种所述罗伊氏乳杆菌、所述微生物制剂和所述后生元中的至少一种在制备防治阴道炎药物或食品中的应用。
27.进一步地，所述阴道炎为白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和阴道加德纳菌中至少一种引发的阴道炎。
28.本发明对上述药物的剂型不作严格限制，本领域技术人员可以采用本领域的常规剂型，例如，在一实施方式中，所述药物剂型为洗剂，另一实施方式中，所述药物剂型为凝胶剂，在其他实施例中，所述药物剂型为软膏剂。
29.本发明再一实施例提供了一种用于防治阴道炎的药物，所述药物包括所述罗伊氏乳杆菌、所述微生物制剂和所述后生元中的至少一种，以及药学上可接受的辅料。
30.进一步地，药物剂型包括洗剂、凝胶剂和软膏剂。
31.为了个更好的提高药物对阴道炎的防治效果，在一实施方式中，所述药物中所述
罗伊氏乳杆菌的含量为106～10
10
cfu/ml，后生元的含量为10～100mg/g。
32.为了更好的说明本技术技术方案，以下通过具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。
33.实施例1
34.本实施例为罗伊氏乳杆菌hr7的筛选过程：
35.使用一次性无菌采样器采集江苏如皋市健康女性阴道样品若干份，梯度稀释后涂于mrs培养基，于厌氧培养箱内进行富集培养48h；培养后根据菌落的颜色、大小、边缘形状等，用接种环挑取菌落划线纯；所得菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶分析，保留革兰氏染色阳性杆菌和过氧化氢酶阴性菌，选择效果最好的菌株，得到菌株hr7。
36.实施例2
37.本实施例为上述筛选的菌株的鉴定；
38.采用16s rdna基因测序法对菌株hr7进行分类鉴定，并对菌株hr7进行培养观察形态特征；
39.提取罗伊氏乳杆菌hr7的基因组，进行16s rdna系列扩增和测序，测序结果如下：aggctcaggatgaacgccggcggtgtgcctaatacatgcaagtcgtacgcactggcccaactgattgatggtgcttgcacctgattgacgatggatcaccagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacctgccccggagcgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcataacaacaaaagccacatggcttttgtttgaaagatggctttggctatcactctgggatggacctgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatggaactgagacacggtccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttggagaagaacgtgcgtgagagtaactgttcacgcagtgacggtatccaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttgcttaggtctgatgtgaaagccttcggcttaaccgaagaagtgcatcggaaaccgggcaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccggagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttgcgctaaccttagagataaggcgttcccttcggggacgcaatgacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttactagttgccagcattaagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcagatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaacgagtcgcaagctcgcgagagtaagctaatctcttaaagccgttctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgtaacgcccaaagtcggtggcctaacctttatggagggagccgcctaaggcgggacagatgactggggtgaagtcgtaa；
40.菌株hr7的形态鉴定特征如下：为革兰氏染色阳性的无芽孢杆菌，mrs培养基上划线培养48h后形成明显的菌落，直径在0.2-2.5mm之间，圆形微白，凸面，不透明。
41.经上16s rrna比对以及形态特征，确定上述筛选菌株hr7为罗伊氏乳杆菌hr7。
42.实施例3
43.本实施例为上述罗伊氏乳杆菌hr7对阴道加德纳菌(kctc5096)、白色念珠菌
(kctc7678)、金黄色葡萄球菌(atcc 25923)的抑制作用：
44.将罗伊氏乳杆菌hr7活化后接种到mrs液体培养基中进行培养，得到浓度为1
×
108cfu/ml的培养液；
45.将阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌分别活化后接种到mrs培养基中进行培养，分别得到浓度为1
×
108cfu/ml的培养液；
46.将1
×
108cfu/ml的罗伊氏乳杆菌hr7培养液取3份，每份3ml；
47.浓度为1
×
108cfu/ml的阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌培养液分别取2份，其中，1份体积为3ml，另一份为6ml；
48.将3份罗伊氏乳杆菌hr7培养液分别与3ml的阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌培养液进行混合，依次分别记为实验1组、实验2组和实验3组，而剩余的3份阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌培养液依次作为对照组，依次记为对照1组、对照2组和对照3组；
49.将实验1组、实验2组、实验3组、对照1组、对照2组和对照3组分别接种到mrs液体培养基中进行培养20h，分别得到培养液；
50.将上述不同培养基100μl分别接种到阴道加德纳菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的选择性培养基20ml中，随后，对阴道加德纳菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌进行计数，计数结果如表1所示；
51.表1
[0052][0053][0054]
由表1可知，本技术罗伊氏乳杆菌hr7对阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌均具有优异的抑制作用。
[0055]
实施例4
[0056]
本实施例为上述罗伊氏乳杆菌hr7产过氧化氢性能的实验研究：
[0057]
采用100mmol/l哌嗪-n,n
’‑
二-乙磺酸(pipes)将质量分数为30％的h2o2稀释成1mol/l，再用100mmol/l pipes将1mol/l h2o2分别稀释成0μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、60μmol/l、80μmol/l、100μmol/l溶液；然后分别取100μl上述h2o2溶液与100μl 20mmol/l tmb混合，最后向混合溶液中加入2μl辣根过氧化物酶(1mg/ml)并混匀，16℃孵育10min，测量od600并绘制标准曲线；
[0058]
将本技术罗伊氏乳杆菌hr7活化后接种于mrs培养基中进行培养过夜，接种浓度为108cfu/ml，然后，离心取上清液；
[0059]
吸取100μl上述上清液与100μl 20mmol/l tmb混合，最后向混合溶液中加入2μl辣根过氧化物酶(1mg/ml)并混匀，16℃孵育10min，测量od600，根据标准曲线计算上清液中过氧化氢浓度。
[0060]
计算结果为h2o2浓度为28.62μmol/l，可见，本技术罗伊氏乳杆菌hr7具有一定的产双氧水能力。
[0061]
综上，本发明罗伊氏乳杆菌对阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌均具有一定抑菌作用，同时能够高产过氧化氢，进而本技术罗伊氏乳杆菌能够改善微生物感染导致的阴道炎；因此，本技术罗伊氏乳杆菌能够用于制备阴道护理用品以及防治阴道炎的药物，为女性生殖健康提供有力保障。
[0062]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

技术特征：
1.一种具有改善阴道炎症的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌具体为罗伊氏乳杆菌(limosilactobacillus reuteri)hr7，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63350。2.含有权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌的微生物制剂。3.权利要求1所述罗伊氏乳杆菌的后生元。4.权利要求1所述罗伊氏乳杆菌、权利要求2所述微生物制剂和权利要求3所述的后生元中的至少一种在制备阴道护理用品中的应用。5.权利要求1所述罗伊氏乳杆菌和/或权利要求2所述微生物制剂和权利要求3所述的后生元中的至少一种在制备防治阴道炎药物或食品中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述阴道炎为白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和阴道加德纳菌中至少一种引发的阴道炎。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物剂型包括洗剂、凝胶剂和软膏剂。8.一种用于防治阴道炎的药物，其特征在于，包括权利要求1所述罗伊氏乳杆菌、权利要求2所述微生物制剂和权利要求3所述的后生元中的至少一种，以及药学上可接受的辅料。9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物剂型包括洗剂、凝胶剂和软膏剂。10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物中所述罗伊氏乳杆菌的含量为106～10
10
cfu/ml，后生元的含量为10～100mg/g。

技术总结
本发明公开了一种具有改善阴道炎症的罗伊氏乳杆菌及其应用，所述罗伊氏乳杆菌具体为罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HR7，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63350；本发明罗伊氏乳杆菌对阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌均具有一定抑菌作用，同时能够高产过氧化氢，进而本申请罗伊氏乳杆菌能够改善微生物感染导致的阴道炎；因此，本申请罗伊氏乳杆菌能够用于制备阴道护理用品以及防治阴道炎的药物或食品，同时能够建立阴道微生态屏障并延缓生殖道衰老，为女性生殖健康提供有力保障。为女性生殖健康提供有力保障。


技术研发人员：姜甜
受保护的技术使用者：上海华朴生命健康科技有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/9/14