一种细胞因子组合物及应用

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种细胞因子组合物及应用。


背景技术：

2.嵌合抗原受体t(car-t)细胞疗法是对标准疗法无效的难治/复发血液系统恶性肿瘤的有效方法，在b细胞急性淋巴细胞白血病患者、b细胞非霍奇金淋巴瘤患者和多发性骨髓瘤患者中完全缓解率分别达83％、54％以及33％。然而，car-t细胞治疗引起的全身免疫系统激活也会导致危及生命的细胞因子释放综合征的发生。
3.细胞因子释放综合征是car-t细胞治疗最常见的副作用，在大多数接受靶向cd19、bcma、cd20、cd22、cd7、cd123和其他t细胞参与疗法的car-t细胞疗法的患者中都观察到了细胞因子释放综合征。细胞因子释放综合征表现出发烧、疲劳和厌食等体质症状，但可迅速发展为低血压、呼吸衰竭、休克和器官功能障碍。根据产品和患者的具体因素，高级别细胞因子释放综合征的发生率可能高达46％。通过早期和积极的管理，即使是严重的细胞因子释放综合征也是可逆的。因此，如何在早期预测严重细胞因子释放综合征的发生以及时干预对car-t细胞治疗至关重要。
4.目前，已报道的几个细胞因子释放综合征预测模型的建立均建立在小样本的基础上并且局限于cd19 car-t细胞产品，未能在其他靶点的car-t细胞治疗中进行验证([1]teachey d t，lacey s f，shawp a，et al.identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor t-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia[j].cancer discov，2016，6(6)：664-79.[2]hay k a，hanafi l a，li d，et al.kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after cd19 chimeric antigen receptor-modified t-cell therapy[j].blood，2017，130(21)：2295-2306.)。临床迫切需要适用于预测整个血液系统恶性肿瘤接受car-t细胞治疗发生严重细胞因子释放综合征风险的预测模型。


技术实现要素：

[0005]
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种细胞因子组合物及应用，用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险。
[0006]
由于细胞因子释放综合征的特征是显著的全身炎症和炎症细胞因子水平升高，外周血中细胞因子的水平是预测严重细胞因子释放综合征发生风险的有效生物标志物。我们开发了一个基于回输24-48小时间的5种细胞因子预测血液系统恶性肿瘤患者car-t细胞治疗后发生严重细胞因子释放综合征的列线图，并在来自六家医院的两个独立队列中进行了外部验证。与以前仅适用于cd19 car-t细胞治疗的模型相比，该列线图具有优异的辨别能力，并且适用于使用多种car-t细胞产品(如cd19、人源化cd19、cd19/22、bcma和人源化bcma)治疗的血液系统恶性肿瘤患者。
[0007]
一种细胞因子组合物，用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发
生细胞因子释放综合征风险，所述细胞因子组合为：cx3cl1、gzmb、il4、il6和pdgfaa。
[0008]
本发明又提供了所述细胞因子组合物作为检测标记在制备用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的试剂盒中的应用。
[0009]
本发明又提供了一种用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的试剂盒，通过联合检测样本中细胞因子cx3cl1、gzmb、il4、il6和pdgfaa的浓度来(pg/ml)确定血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的高低，所述试剂盒包括用于分别检测各细胞因子的试剂。优选的，样本为血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后的外周血。更优选的，样本为血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗、car-t细胞回输24-48小时之间的外周血。
[0010]
本发明又提供了一种用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的模型，包括car-t细胞回输后24-48小时期间外周血中cx3cl1、gzmb、il4、il6和pdgfaa这5个细胞因子浓度(浓度以pg/ml计)，分别检测样本中这5个细胞因子的浓度并使用以下公式计算风险分值：
[0011]
风险分值＝1.19
×
ln(cx3cl1)+0.91
×
ln(gzmb)+0.74
×
ln(il6)-1.53
×
ln(il4)-0.91
×
ln(pdgfaa)-6.77，
[0012]
其中，所述风险分值以0作为截断值，当患者的风险分值低于0时，即为低危患者，而风险分值大于或等于0时，该患者为高危患者。
[0013]
优选的，血液系统恶性肿瘤类型为以下至少一种：多发性骨髓瘤、b细胞急性淋巴细胞白血病、b细胞非霍奇金淋巴瘤，
[0014]
car-t细胞治疗为靶向cd19、人源化cd19、cd19/22、cd20、bcma或人源化bcma的car-t细胞疗法。
[0015]
本发明还提供了一种用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的列线图，其特征在于，包括car-t细胞回输后24-48小时期间外周血中cx3cl1、gzmb、il4、il6和pdgfaa这5个细胞因子浓度，
[0016]
列线图包括第一行的分值标尺，其中，分值范围为0～100；第二行到第六行为car-t细胞回输后24-48小时之间5个细胞因子浓度的自然对数，分别划竖线垂直向上对应第一行的一个相应的得分；第七行为患者总分值，将第二行至第六行的5个指标在第一行对应的得分相加，得到患者总分值；将总分值划竖线垂直向下对应第八行，即为患者接受car-t细胞治疗后发生严重细胞因子释放综合征的概率。
[0017]
优选的，血液系统恶性肿瘤类型为以下至少一种：多发性骨髓瘤、b细胞急性淋巴细胞白血病、b细胞非霍奇金淋巴瘤，
[0018]
car-t细胞治疗为靶向cd19、人源化cd19、cd19/22、cd20、bcma或人源化bcma的car-t细胞疗法。
[0019]
本发明首次基于car-t细胞回输24-48小时期间外周血中cx3cl1、gzmb、il4、il6以及pdgfa五种细胞因子浓度(pg/ml)，建立的一个可评估并预测血液系统恶性肿瘤患者接受不同car-t细胞治疗发生严重细胞因子释放综合征风险的模型，为临床治疗决策提供有力的参考依据。
附图说明
[0020]
图1为本发明构建预测模型的流程图。
[0021]
图2为使用lasso正则化的逻辑回归选择与严重细胞因子释放综合征相关的因素分析结果图，其中，(a)图表示通过具有最小标准的10倍交叉验证来选择lasso模型的调谐参数(k)，lasso调谐参数(k)的最佳值由垂直线指示；(b)图表示18个潜在因素的lasso系数图。
[0022]
图3为结合风险评分模型构建的列线图。
[0023]
图4为评估列线图一致性的校准曲线图，其中从上到下的图(a)、(b)和(c)分别是多发性骨髓瘤(训练集)、多发性骨髓瘤(6所医院来源的多中心验证集)以及淋巴瘤/白血病三个队列。
[0024]
图5为评估列线图临床净收益的决策曲线分析结果图，其中，从上到下的图(a)、(b)和(c)分别是多发性骨髓瘤(训练集)、多发性骨髓瘤(6所医院来源的多中心验证集)以及淋巴瘤/白血病三个队列。
具体实施方式
[0025]
本发明公开了外周血细胞因子的应用、预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗发生严重细胞因子释放综合征风险的模型及其构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0026]
本发明首次基于car-t细胞回输24-48小时期间外周血中cx3cl1、gzmb、il4、il6以及pdgfa五种细胞因子浓度(pg/ml)，建立的一个可评估并预测血液系统恶性肿瘤患者接受不同car-t细胞治疗发生严重细胞因子释放综合征风险的模型，并以列线图的形式进行应用，为临床治疗决策提供有力的参考依据。
[0027]
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028]
实施例1
[0029]
本发明中用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受不同car-t细胞治疗发生严重细胞因子释放综合征风险模型的构建方法的一种实施例，包括如下步骤：
[0030]
(1)入组人群：
[0031]
入组87例浙江大学医学院附属第一医院接受bcma car-t细胞治疗的难治/复发多发性骨髓瘤患者作为训练集(chictr.org number，chictr1800017404)，59例来自徐州医科大学、上海长征医院、中国医科大学附属第一医院、浙江大学医学院附属第二医院以及中国医学科学院血液病医院五个中心接受car-t细胞治疗的难治/复发多发性骨髓瘤患者作为外部验证集1，68例浙江大学医学院附属第一医院接受car-t细胞治疗的难治/复发b细胞急性淋巴细胞白血病患者或b细胞非霍奇金淋巴瘤患者作为外部验证2(图1)。
[0032]
(2)指标建立：
[0033]
收集患者回输car-t细胞24-48小时期间的外周血进行45种细胞因子检测，同时收集患者年龄、性别、基线白细胞计数、血红蛋白、血小板、铁蛋白、c反应蛋白以及肌酐等患者临床特征用以模型构建。根据lee标准，将步骤(1)筛选出的患者的细胞因子释放综合征分为严重的细胞因子释放综合征(＞2级)和轻微的细胞因子释放综合征(≤2级)两组。
[0034]
(3)模型构建：
[0035]
首先，采用单因素分析对影响血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗发生严重细胞因子释放综合征的指标进行筛选，筛选出回输前血红蛋白含量以及17种细胞因子进行lasso回归分析，共得到mip1α、cx3cl1、flt3l、gzmb、il4、il6以及pdgfaa七种细胞因子(图2)。
[0036]
接着，根据赤池信息准则(aic)使用逐步多因素logistics回归，筛选影响血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗发生严重细胞因子释放综合征的显著因素，包括cx3cl1(c-x3-c motif chemokine ligand 1)、gzmb(granzyme b)、il4(interleukin 4)、il6(interleukin 6)和pdgfaa(platelet-derived growth factor alpha polypeptide a)五种细胞因子的浓度(浓度以pg/ml计)。这5个细胞因子的计算公式为：风险分值＝1.19
×
ln(cx3cl1)+0.91
×
ln(gzmb)+0.74
×
ln(il6)-1.53
×
1n(il4)-0.91
×
ln(pdgfaa)-6.77。所述风险分值以0作为最佳截断值，当患者的风险分值低于0时，即为低危患者，而风险分值大于或等于0时，该患者为高危患者。
[0037]
根据上一步logistics回归分析得到的公式，通过调用“rms”包，绘制可直观反映患者发生严重细胞因子释放综合征风险的列线图(图3)。
[0038]
纵向标尺为已筛选出的独立临床危险因素，横向标尺为对应分数。列线图包括第一行的分值标尺，其中，分值范围为0～100；第二行到第六行为car-t细胞回输后24-48小时之间5个细胞因子浓度(浓度以pg/ml计)的自然对数，分别对应第一行的一个相应的得分；第七行为患者总分值，将第二行至第六行的5个指标在第一行对应的得分相加，得到患者总分值；第八行为患者接受car-t细胞治疗后发生严重细胞因子释放综合征的概率。
[0039]
实施例2
[0040]
模型评估。
[0041]
roc曲线的auc值是通过bootstrap自抽样(bootstrap自抽样是最常用的重复抽样方法之一，通过有放回地反复从原始样本群中抽取得到不同的新样本群)来实现，用于评价模型的区分能力。
[0042]
表1列线图内部验证和外部验证队列中的auc
[0043][0044][0045]
校准曲线同样通过bootstrap自抽样方法来实现，校准曲线的基本思想是以真实发生率为纵坐标，以预测发生率为横坐标，然后根据列线图模型预测出所有患者在指定时间点的生存率，按发生率由低至高将患者分为数个节点，计算模型中每个节点的平均发生率预测值和校准点，用平滑曲线将所有校准点相连即得到预测曲线，而标准曲线反映真实生存情况，预测曲线与标准曲线越吻合，就说明模型的预测准确度越高。风险评分模型在训练集和两个独立验证集均体现出较好的一致性(图4)。
[0046]
决策曲线分析法可通过计算在不同阈值下模型的净获益(net benefit，nb)，从而评估模型的临床实用性。在训练集和两个独立验证集的临床实践中应用列线图均有临床获益(图5)。

技术特征：
1.一种细胞因子组合物，用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险，其特征在于，所述细胞因子组合为：cx3cl1、gzmb、il4、il6和pdgfaa。2.权利要求1所述细胞因子组合物作为检测标记在制备用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的试剂盒中的应用。3.一种用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的试剂盒，其特征在于，通过联合检测样本中细胞因子cx3cl1、gzmb、il4、il6和pdgfaa的水平来确定血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的高低，所述试剂盒包括用于分别检测各细胞因子的试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，样本为血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后的外周血。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，样本为血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗、car-t细胞回输24-48小时之间的外周血。6.一种用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的模型，其特征在于，包括car-t细胞回输后24-48小时期间外周血中cx3cl1、gzmb、il4、il6和pdgfaa这5个细胞因子浓度，分别检测样本中这5个细胞因子的浓度并使用以下公式计算风险分值：风险分值＝1.19
×
ln(cx3cl1)+0.91
×
ln(gzmb)+0.74
×
ln(il6)-1.53
×
ln(il4)-0.91
×
ln(pdgfaa)-6.77，其中，所述风险分值以0作为截断值，当患者的风险分值低于0时，即为低危患者，而风险分值大于或等于0时，该患者为高危患者。7.根据权利要求6所述的模型，其特征在于，血液系统恶性肿瘤类型为以下至少一种：多发性骨髓瘤、b细胞急性淋巴细胞白血病、b细胞非霍奇金淋巴瘤，car-t细胞治疗为靶向cd19、人源化cd19、cd19/22、cd20、bcma或人源化bcma的car-t细胞疗法。8.一种用于预测血液系统恶性肿瘤患者接受car-t细胞治疗后发生细胞因子释放综合征风险的列线图，其特征在于，包括car-t细胞回输后24-48小时期间外周血中cx3cl1、gzmb、il4、il6和pdgfaa这5个细胞因子浓度，列线图包括第一行的分值标尺，其中，分值范围为0～100；第二行到第六行为car-t细胞回输后24-48小时之间5个细胞因子浓度的自然对数，分别划竖线垂直向上对应第一行的一个相应的得分；第七行为患者总分值，将第二行至第六行的5个指标在第一行对应的得分相加，得到患者总分值；将总分值划竖线垂直向下对应第八行，即为患者接受car-t细胞治疗后发生严重细胞因子释放综合征的概率。9.根据权利要求6和7所述的列线图，其特征在于，血液系统恶性肿瘤类型为以下至少一种：多发性骨髓瘤、b细胞急性淋巴细胞白血病、b细胞非霍奇金淋巴瘤，car-t细胞治疗为靶向cd19、人源化cd19、cd19/22、cd20、bcma或人源化bcma的car-t细胞疗法。

技术总结
本发明公开了一种用于评估血液系统恶性肿瘤患者接受CAR-T细胞治疗后发生严重细胞因子释放综合征风险的预测模型，包括用来评估患者回输CAR-T细胞后发生严重细胞因子释放综合征风险的列线图和预后风险评分公式。其所述标志物为CAR-T细胞回输后24-48小时期间外周血的细胞因子浓度，包括CX3CL1、GZMB、IL4、IL6和PDGFAA五种细胞因子。本发明中的列线图是首次建立的适用于白血病、淋巴瘤以及多发性骨髓瘤三大血液系统恶性肿瘤患者接受CAR-T细胞治疗发生严重细胞因子释放综合征风险评估的预测模型。本发明的模型简单、直观，易于推广，能有效地帮助临床医生评估CAR-T细胞治疗发生严重细胞因子释放综合征的风险，从而为患者的监测和治疗提供理论指导。和治疗提供理论指导。和治疗提供理论指导。


技术研发人员：黄河 周凌辉 胡永仙
受保护的技术使用者：浙江大学医学院附属第一医院
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/9/14