七妹羊肚菌的SSR微卫星分子标记及其引物组和应用

七妹羊肚菌的ssr微卫星分子标记及其引物组和应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及七妹羊肚菌的ssr微卫星分子标记及其引物组和应用。


背景技术：

2.羊肚菌是一种名贵的珍稀食用菌，不但味道鲜美、口感脆嫩，还富含多种生物活性成分，具有抗癌、抗肿瘤、抗疲劳、提高免疫力、保肝护肝等功效，深受人类的青睐。其中，七妹羊肚菌是目前大面积推行的可栽培品种之一，具有抗温差波动能力强，适应性广，产量稳定的优势，近年来在全国各地推广较多。然而，由于前端的遗传育种研究基础薄弱，品种选育工作难以推进，且市场上品种的肆意传代导致的活力退化现象也常有发生，如相同的菌株在各地表现差异明显，甚至出现一些区域高产，一些区域绝收的极端案例。分子身份标签是通过dna条形码技术，为每一个菌株构建一套独有的分子标记，以区分异己，实现菌种保护的目的。
3.ssr(simple sequence repeats)分子标记是行业内外认可度较高的分子标记技术，ssr标记基于基因组中的1～6个核苷酸的重复片段多态性设计，具有序列变异度高、稳定性高、共显性等优势，已在动物、植物和微生物中广泛使用，同时，ssr分子标记也广泛用于遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性等研究中。
4.传统的ssr标记开发借助常规的重复序列富集pcr扩增、issr(inter-simple sequence repeat)转化、est-ssr(expressed sequence tag-simple sequence repeat)序列开发、以及简单的依靠单一的基因组序列查找ssr位点进行开发检测。如刘伟等曾基于粗柄羊肚菌的转录组数据分析了其ssr分布和序列特征分析(刘伟等.粗柄羊肚菌转录组的ssr分布和序列特征分析.轻工学报,2017,32(02):33-39)。孟清等同样基于小海绵羊肚菌转录组数据进行ssr信息分析和分子标记的开发，其中随机筛选的12对ssr引物中4对引物表现稳定可重复的多态性，并对收集的19株羊肚菌进行了遗传多样性分析(孟清等.青海小海绵羊肚菌m12-10转录组ssr信息分析及其分子标记开发.青海大学学报,2019,37(06):1-10)。马杰等同样利用转录组数据对羊肚菌进行了est-ssr的开发，并筛选得到15对稳定性较好的ssr引物，对33份羊肚菌标本进行了遗传多样性分析(马杰,等.基于转录组序列的羊肚菌est-ssr标记开发与遗传多样性分析.江苏农业学报,2020,36(05):1282-1290)。du et al基于一个梯棱羊肚菌基因组数据的ssr特征分析，设计了一套适用于m.importuna，m.sextelata，m.eximia，m.exuberans，mel-13和mel-21的ssr分子标记，但该标记的多态性较低，22个ssr标记在6个种中只扩增得到了15～22个多态性位点，基于梯棱羊肚菌设计的种间通用型ssr引物多态性较低的可能原因是不同物种之间的ssr多态性存在差异，且侧重种间时遗失了种内得高多态性ssr位点(du xh et al.hybridization,characterization and transferability of ssrs in the genus morchella.fungal biology,2019,123(7):528-538)。基于此，亟需一套多态性、稳定性较好的七妹羊肚菌ssr微卫星标记。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了七妹羊肚菌的ssr微卫星分子标记及其引物组和应用。本发明提供的ssr微卫星分子标具有多态性和稳定性好的优势，利用本发明所提供的ssr微卫星分子标记设计的引物可用于七妹羊肚菌物种的鉴定、群体遗传多样性分析，具有较好的应用价值。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了七妹羊肚菌的ssr微卫星分子标记，所述ssr微卫星分子标记包括seq id no.1～40所示的核苷酸序列。
8.本发明还提供了上述技术方案所述ssr微卫星分子标记的筛选方法，包括：通过2套基因组的denovo测序与组装，与参考基因组进行比较，确定ssr位点和ssr的多态性，进而筛选得到多态性最好的40个ssr位点。
9.本发明还提供了扩增上述技术方案所述ssr微卫星分子标记的引物组，所述引物组包括40对引物对，各引物的核苷酸序列如seq id no.41～120所示。
10.本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述ssr微卫星分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组。
11.本发明还提供了一种七妹羊肚菌群体的分子指纹图谱，所述分子指纹图谱由上述技术方案所述的引物组经pcr扩增后构建得到。
12.本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在鉴定七妹羊肚菌中的应用。
13.本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在七妹羊肚菌的遗传多样性分析中的应用。
14.本发明还提供了一种七妹羊肚菌遗传多样性分析的方法，包括以下步骤：
15.以待测七妹羊肚菌的基因组dna为模板，利用上述技术方案所述的引物组进行pcr扩增，得到扩增产物；
16.将所述扩增产物进行电泳检测，得到扩增条带；
17.对所述扩增条带进行分析，待测七妹羊肚菌在每个ssr位点有相同的扩增条带分别记为“1”，无相同的扩增条带分别记为“0”，得到待测七妹羊肚菌的分子指纹图谱；
18.基于分子指纹图谱，分别计算出ssr位点的各项遗传多样性指标和获得聚类分析图。
19.优选的，所述ssr位点的各项遗传多样性指标包括等位基因、有效等位基因、私有等位基因和香农指数中的一种或多种。
20.优选的，所述pcr扩增的反应体系以20μl计，包括2
×
taq pcrmastermix 10μl、正向引物1μl、反向引物1μl、基因组dna 1μl和余量的ddh2o；所述pcr扩增的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s、60℃退火10s、72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min。
21.有益效果：
22.本发明提供了七妹羊肚菌的ssr微卫星分子标记，所述ssr微卫星分子标记包括seq id no.1～40所示的核苷酸序列。本发明基于高质量七妹羊肚菌基因组数据，并重新完成了2个七妹羊肚菌菌株的基因组de novo组装，通过比较基因组技术开发ssr分子标记，直接得到了物种间共有的ssr位点信息和多态性信息，进而完成ssr标记的开发，得到了一套
多态性和稳定性好的七妹羊肚菌ssr微卫星标记，利用本发明所提供的ssr微卫星分子标记设计的引物可用于七妹羊肚菌物种的鉴定、群体遗传多样性分析等，具有较好的应用价值。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
24.图1为本发明中七妹羊肚菌ssr引物的毛细管电泳结果图；
25.图2为本发明中七妹羊肚菌8个菌株的ssr指纹图谱；
26.图3为本发明中七妹羊肚菌8个菌株的ssr遗传多样性分析结果。
具体实施方式
27.本发明提供了七妹羊肚菌的ssr微卫星分子标记，所述ssr微卫星分子标记包括seq id no.1～40所示的核苷酸序列，具体信息如下所示：
28.seq id no.1：gggagtcatatcggcactcgagtgattagacgcatcagatatctagagaaa gtgagagggtgagtgagtgagtgagtgagagagtgagagtggctgctgcagtaatgacatgaagggggaagggaagaggagtagtacgtatgtttcgcggcgctcacagattaactatacgagaattcgaagcatgcacagccccgcgacgtctggatgagtacgtaatgcgagtgaggctttgcaggatgaggatgaggatgaggatgaggatgaggaggaggaggaagaggaggagaccgt；
29.seq id no.2：tggcagtaatcgtggagagctcgcccgggggtggtatgagcgcgccgtga aggagtattcttcttcttctaaccctccccctacctcttcttctaccggcaaccctcccgccgccg ccgccgccgccgccgccgccgccatcgccaccggcacaggggagccaaaacggaagcagtccc cagagactggagatagcagtgaagacgagatggtgggccctttcctac；
30.seq id no.3：ggtgaggaggtctaccccatcttgtttctaaagaccggtaaaatgggattg aggcctgtgatcagtttggtttgtggttgaatactttgtgagcgggtttgagttgttttggggag aaagaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggagtagtagtagaggaggagctctg gatcgagtgtcg；
31.seq id no.4：acgccagttcaagcactctgcgataccgcagagcggcggaggcggcctgc caaacgcaaagaagcgcccccgccccgagcagcagcacaagcactcgagctccgagagcaatgcgggcggcgccggctcgtacaagcgctccggcagcgttagcggcgagagctcctcggcgatggggagtgcgatgagggcggagcagtcgcagtcgcagtcgcagtcgcagtcgcagtcgcagtcgcagcagcccaggtcgacaatgtatgcggcgtgtc；
32.seq id no.5：cccagaggctgagaacacagagcccggggatccgtatcgaaattagccctaaatggagcactggaccgaacctgatctgaaggagccagggcggagaggaggagaaggaggcctcattagagaagaggagatcgacgaggaggaggaggaggaggaggaggaggttgcttagtcttggcgaaatgaagctgaagaaaagtctttggagagaagtgaccccgcacttcacgaactcttggtggagttgagaaggggcttgtcaaggaca；
33.seq id no.6：tcaagcacaagcacaagcacaagcccaggctcaggctcaggcccaggctcaagcccaggctcaggctcaggccgaggctcaagcacaggctcaggctcaggctcaagcacaggcccaagcccaagcccaagcccaagcccaagcccaagcccaagcccaagcccaagcccaagcccaagcccaagctcaagctcaacatcaacagcaacagcaacagc；
34.seq id no.7：tgtaagtggagagggacggacgagggaaatgattgtttgggcaggtactgcttgttactactactctaccactactactactactactactactactactactactactacgacggataaaccggcgcttaa
tcattaccaattataacttctacaacaactaaacaaaacaaaaccaacagcagcaattaacagtacccatatacctacaacctaacccaacccatgacacgctcaattaaaccccatatccacaccctcatcacacccacaaaacccctc；
35.seq id no.8：atcctcggcgatctgtatgcgcagaggagccagattgagaatacgcataatacgctcaatgatagtgagcgctacttggataggagtatcaagacgctgagggggatggcgcgtaggtgagattctatccttttgtggtggtggtggtggtggtggtggggattgcagggagaggggattggggattggggattggggggctaatagtgtgtgtgggggataggatggctacaaatcggatgattacgattgcaatcataacggtgctcgtgttgctgattatggcgg；
36.seq id no.9：agttcattgctcagcgtcgaatgtttctttccttcctcttcttcctcttcttcctcctcctcttcctcctcctcctccttctcctcgtcccatcattctccctcatcactcttatcgttcgttatccctcatcgtcaatttctttatctctacactgattttcataacctcgaaagtgcctaaaatggagatgcatacttatgaagtccttgcgtactttctacccgcattccctcc；
37.seq id no.10：ggtgccgtcatcactgaagatggccatctcgtattcggtgatgtgaacccagccaccgggcttagtgtgtctgcacccaccgctatcagagctgtgtttgaaaggggaggaggaggaggaggaggaggaggaggattctcactcataacactgatcaatgacattccgccagttgcaaacgccacccatgagattgcggatgtggatcaagtcgaagtgattcttgctgaacgtccaatcctgctcc；
38.seq id no.11：tttcgggttcggtgtctacggcggggacggggacggggacggggacggggacggggacgggtgcaggctcaggctcaaggtcaggatcagggccttctgcagcgtcaccaccgacaatatcatgggggcctgctggcgacacgcggaggaacactgttgctggccctcctccgcccggacaggatgcggcgccggcgagcacgaggcgcaagttggtggtgtcgtcgtc；
39.seq id no.12：tgggacggacgctcaattacgtttttgcagatgtcactcctctctctctctctctctctctctctctctttggttgtgaaatatgggtggatagacagacgggccccaaagagataaaaatgtttccttcatgaacggaccgg；
40.seq id no.13：gaaccggccaagtaatcccacgatcccttccacagaaaacagaacaaagaaaggaagaacgaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaataagggaagccacgagctcttaagagccattctcatacccgagaaactcccgcggaattcccaatatgttcatacgataactaacactcgcaccacgt；
41.seq id no.14：cgggcatgtgattgtggttgtggctgtgtgtagggggctcaggcgtagtagccgtcagatcaatcatcgcgctagccgggatcggcaccggagcgtgtgcgggagcgggagcaggtggctttttaacctttagcttgatgatgagctttccttttcccttttcctgtgcctgggcaggggctggtggtgcagatgcaggtgcaggtgcaggtgcaggtgcaggtgcagcgtcgatcatctcaacatcctgcttgagatcaacgaccatcctcgg；
42.seq id no.15：aaatacaccgccctcacctctccgtagaattcaagcacaaaaaaatacatcttgaaggtgccatagtatggacggtggtggtggtggtggtggtggtggcttgaaagctatggctggttcgggggagtctacttagagctctggttgctgcgagaatccat；
43.seq id no.16：gggcggtggagatgttaacattacggcagacgaggtttttaacaatgatgatgatgatgatgatgatgatgatggttttattagagattagaagcacacctttattgtcactccatttgatatcacttgcatcgtgaagagaaaacaccccgacagc；
44.seq id no.17：cacgagtgccataccgtacatatagatggccacaaatagtagaaaagaataggagtgggttatgcataatctgttttctctcttccgagaggaggtgagaatgcatgtgtagatacgggtagtataggaatgagaagagatggggggaagaagaagaagaaagagtatgatgctcttgctattcactacaataggtatcactctagctctttgacatgcacttacttacatcaaagaacccttgagactgcacca；
45.seq id no.18：tgtccccgactgcaactaactgcaatggaaccctgggggactgggggagagaagtgtcagctacctagctagtctggccgttataacgttcgttcctagacaggcagacagacagacagacagacagacagagagtcacgtaccggtggtagttatgtaggaagttggtaccaggtgatggtaggtgtcagcttaacctaaaaactgagctgtactggactgaaaggcgaattgaggcgaatcaaagataacggtctgtagctggtagctggtagagtagccggaa；
46.seq id no.19：ggaggtatctctcggcaagctttcgacgtgagcaaggggtgtgggtgtggaggggagggggttggttggttggttggttgattggtggatccacagggggttgttgagtcgagaagagagaaagagggaatgggagggagag；
47.seq id no.20：ggttgcggtgtgtgtgttactgtgatttcacccaaaggagtgagctatagcagtcagtttaaacatggtcgatccctcttgcgagggatgtgaaacggtttccgcttacgtgcatgggcaaaagccttattgcccatgttccaccctggctggctggctggctggctggctggctggtggctggctggcatccggtttagccatca；
48.seq id no.21：tagaagggcaaggggacaacgcagtgcaggctggtgtcgaagcactcaaaggtgccgtatattcgtgtacgtactgctactactactgctactactactgctactactactactactactacatactgctattactgtggtgcaattgaggaatgtctttgatctaatttctgtgttcgcaatgtatgtagtgtttcgactggtcgcccacgcaggaaggtatatatatctacatccatctacctacctacacacaccctagc；
49.seq id no.22：aagcatgggaagacgctgaagggttgatggtgatggtgatggtgatggtgatggtgatggtgatggtttggttggaggtattgttattgttattattttctgtgcggaaatgatgattggattctgtatgcttcttgtttttttctttctgtaggatgtttttaggtatcataatgaggtagcatttttttcttcttgtacaaatcaaaaagtcattcttgtattaaagtagattatgcggtttagctgtgcct；
50.seq id no.23：tgctgatgttgttgctgctggtgatatatctgttgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgttgctgttgcgcacgaacagcagggttccatggacatcgtggcacactatattggtttgggagtggggtctgtgctggattatctggcgtaatattcgttgttacggaggaatatcctgaggaaggaagccctgagggagaaacaccgtacatgccgatcatcgactctggggtg；
51.seq id no.24：tggtggtattggtggtggtggggtgggatacttttttacctagctgggccgactgtaaatgatgaaccctacatatttgcgcaaacttaaccacccaccaccaccaccaccaccaccaccaccacccaatccaaatccatacctgcatttgcatctgcatctggcgggggtggtgggcgttagagtatttgtatttcctttctctacttcggagattcaacgatcacagatgtccgcctcgtattctattgcagagatctagagtaagtagaaagctcaagaggggcgaacgatt；
52.seq id no.25：cgtgatgggcgttgttgtttgtgatggtgcagatcgatgcttgggctgtcgtgaggatgtttgtggtggtgcttcattgtcttgtctctctgtctgcctgtctgatactctcatgtatctgtaaatatctacccatcactgctacatgaattcgttaacatttaagcttatccctccccggccccccttcactacaactacatatatgcgacgatcatgttagctgctgctgctgctgctgctgctgctaccaactacacgtgctgttgc；
53.seq id no.26：acgtgtagcactggacctcttttttctctctctctttcttgcctttttgttaggacttgatatttggacattagtgtgttgttttattccatttttattctttatattttttttatttttatcttcaaggacaaggtttcggtttcttcttcttcttcttcttttcgtttcttctacgggaatgggtaatgggtcagttctttgccgtt；
54.seq id no.27：ccccggttgaaacgagacaaacaatctacaatctacataaataaatgtcgtacatgaacaaccaaaaaaaaccccgatctacgcactatagagtacagtactttgcataggcaatgcaaggccggcaggccggtaatctatctgctgctgctgctgctgctgctgctcccggttaagttagcatgcacacacattccgtgcaggagg
ggaggcccggcgccggacataaccttcatggcagtttgtagatcgcagcc；
55.seq id no.28：ggggagttggagggatttggattgtatgtatgtatgtatgtatgtacgtagcagatccactatccaaagagaagaagggaaatgggaagggaaagggaaaataaaagggaagacagagagagtaggggagagtgggggggaggaagagggagagggagagggagagaaagagagagaaacggaggaataaaaagggaaataagggaggaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagtgtactagcacacacttacttgggca；
56.seq id no.29：cgtttgttgtgtggcggtttaatgacgcaggaaggattcgtgagtgcgatt gtgattgtgattgtgactgtgattgtgattgcgattgtgattgtgattgtgattgtgattgtggga ggagttggtgtggttgtgg；
57.seq id no.30：gccgtagctctcctgatcacgagcgtagacgcacccgatcgccaccaaat ggccgtcgtaatggatcgagctcacatcagcgtccaccttcccgttcccctcgccggcgctccccagtccctccaccacgcgatagcggggactatagatcaaggccccaacgacagccttacgtaaatcgttctaatgggaatgggaatgagaacagaaaccgaaatggaaatggaaatggaaatggaaatggaaatggaaatggaaatggaaatgccgaagaagaaagggcaagaaaattggcagcca；
58.seq id no.31：ggagcggagataacgggaagagagatgcgggtgtggggcagggatgaga ggggaggggatgggtgcggggggaggtggaagtgaagctaagggcacagagtgaggcgggagtgcggtatgggtgtggcgtggggtttggtgcttgtgcttgtgcttgtgcttgtgcttgtgcttgtgctggtggtggtgcatggtggggttagtgggtgggcaatatggagatagtgcttgtgctcatacgtaccgcggagagggagagtctgggtgacatctggctgggtttgaggttggtgctt；
59.seq id no.32：tatccccagtgcaggaaggaacaacgaaggccaagaggtcaaagaagaa atatctgatgtcttcccaccctcatggtccaagggagtgagattatttgcacttggttctttttct tacataactagttgcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctctgtcagtgctcgaacttactc ctcctccccttcgaat；
60.seq id no.33：ctgcactttcaggaggagcacagcgaggagtagaggaggaggaggagg aggaggaggagttctgaatactcgtgtaaaatacggtatataaagaaagccaattggcattatta gactactgcagttcacttccagcaatagccagtattttaattagtgtagcaatgtacaaaccaaa caattatctccaattcctcccgtgtgtg；
61.seq id no.34：cccggccctaattgctacattgggcccttgaaggaaggggtgctggcgaa gggggggtaggagaggaggaggaggagggggaggaggagggggagggggttaagttacagt aaaccagtaggtaaaccgccttcactttccccttcccatgtttcgaccttccctttaattcgactt ccaggcggg；
62.seq id no.35：gggacaggttggacagtacgtagctaggtctgtattgagcgttaatgtgga tagcggtatatgtagtgacttcttccttttaaactcacctttcttttgtctggggtatggcatcttccttagggataaataaatatttctttcttttctttcttctttctttctcctttacctgggcattcgtttttctcttgttgttatatatatatatatatatatatatatatacccttgaattccttttgttttcctcttatcggtgatgggttttgggctgggaggatt；
63.seq id no.36：tgtactccaggctgggaacagtaatttaaccttcccgtcaactgcaagaa cccacccaccacccacccacccacccacccacctgctccatcaacgccttgccaagag；
64.seq id no.37：cgcacgcagtatttcagagctcaacgtccgagacataagctcctagagct acctacctacctacctacctacctacttacctacctactctccccaatccaccacctcccaatatc accgtacccccaagtccgaaaaaaaaacaaaaaagtgaactctcggcacccactcggctgttc caccaccaccatgatccgacacctgcatatctccgaaccctggcc；
65.seq id no.38：cagagttgaatgcggcgatggcggcggcgcgggcgatgtcgtctcgattg ttgttgtttttgtttgtgttttcggcggcggcggcggcggcggcggagggcagcagcgcggggt cgtagtgcagtatctgcccgacagcgccgtgccagtcgccgcgcagcagcttgacgccaacctc ccacgtcccgacggtgtagctgccaaagcgctgcaggccaaaatagttgacaaagccgccctc；
66.seq id no.39：acgccagttcaagcactctgcgataccgcagagcggcggaggcggcctgc caaacgcaaagaagcgcccccgccccgagcagcagcacaagcactcgagctccgagagcaat gcgggcggcgccggctcgtacaagcgctccggcagcgttagcggcgagagctcctcggcgatg gggagtgcg；
67.seq id no.40：cgtggcacaactttgctgttgagactgactgggacgagaagtatttctcc accccaaccggccctggaagaagaagaagaagaagaagaagaaagccatgctgacggaccgg ggtggtggttgttagcacgattgcggtgtactactctgccgactatgcgcctctcaggaagg。
68.本发明还提供了上述技术方案所述ssr微卫星分子标记的筛选方法，包括：通过2套基因组的de novo测序与组装，与参考基因组进行比较，确定ssr位点和ssr的多态性，进而筛选得到多态性最好的40个ssr位点。
69.本发明通过比较基因组技术开发ssr分子标记，直接得到了七妹羊肚菌物种间共有的ssr位点信息和多态性信息，进而完成ssr标记的开发，具有专一性、稳定性和可转移性更高的优势，具体包括：
70.以2015-9号七妹羊肚菌基因组为参考(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/jamgzg000000000.1/)，使用二代基因组组装软件spade分别对两个七妹羊肚菌菌株(20d15a和20d18a)的基因组组装；使用candissr软件，整合20d15a和20d18a两套新的基因组和2015-9参考基因组，进行七妹羊肚菌全基因组水平的通用型ssr分子标记的开发；结合pcr产物长度、多态性大小差异、引物的匹配度和候选位点多态性的标准差，引物在三个基因组中缺失率和物种间的可转移性，对开发得到的ssr位点和引物进行筛选，最终选择多态性最高、可转移性最好的40对引物作为七妹羊肚菌通用型ssr引物，得到了一套多态性和稳定性好的七妹羊肚菌ssr微卫星标记。
71.本发明还提供了扩增上述技术方案所述ssr微卫星分子标记的引物组，所述引物组包括40对引物对，各引物的核苷酸序列如seq id no.41～120所示，引物组对应的ssr位点特征及引物信息如表1所示：
72.表1七妹羊肚菌通用型ssr位点特征及引物信息
[0073][0074]
注：表1中的重复序列次数是以2015-9号七妹羊肚菌基因组为参考基因组，结合20d15a和20d18a两套基因组分析得到的。
[0075]
本发明所提供的引物组具有多态性高和通用性强的优势，可用于七妹羊肚菌物种的鉴定、群体遗传多样性分析等，具有较好的应用价值。
[0076]
本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述ssr微卫星分子标记的的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组。
[0077]
在本发明中，所述试剂盒优选还包括用于pcr扩增的反应试剂，优选包括2
×
taq pcrmastermix。
[0078]
本发明还提供了一种七妹羊肚菌群体的分子指纹图谱，所述分子指纹图谱由上述技术方案所述的引物组经pcr扩增后构建得到。本发明对所述分子指纹图谱的构建方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的构建方法即可。
[0079]
本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在鉴定七妹羊肚菌中的应用。本发明提供的引物组可以对待测菌株的基因组dna进行pcr扩增，获得多态性数据，构建聚类树，从而用于菌株身份识别的鉴定。
[0080]
本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在七
妹羊肚菌的遗传多样性分析中的应用。
[0081]
本发明还提供了一种七妹羊肚菌遗传多样性分析的方法，包括以下步骤：
[0082]
以待测七妹羊肚菌的基因组dna为模板，利用上述技术方案所述的引物组进行pcr扩增，得到扩增产物；
[0083]
将所述扩增产物进行电泳检测，得到扩增条带；
[0084]
对所述扩增条带进行分析，待测七妹羊肚菌在每个ssr位点有相同的扩增条带分别记为“1”，无相同的扩增条带分别记为“0”，得到待测七妹羊肚菌的分子指纹图谱；
[0085]
基于分子指纹图谱，采用分析软件分别计算出ssr位点的各项遗传多样性指标，再利用相关软件获得聚类分析图。
[0086]
在本发明中，所述pcr扩增的反应体系优选为20μl，优选包括2
×
taq pcrmastermix 10μl、正向引物1μl、反向引物1μl、基因组dna 1μl和余量的ddh2o；所述正向引物和反向引物的浓度均优选为10μm；所述基因组dna的浓度优选为25～50ng/μl；所述pcr扩增的反应程序优选为：98℃预变性2min；98℃变性10s、60℃退火10s、72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min。
[0087]
在本发明中，所述分析软件优选包括genalex version 6.501和popgen32；所述相关软件优选包括ntsys软件；所述ssr位点的各项遗传多样性指标优选包括等位基因、有效等位基因、私有等位基因和香农指数中的一种或多种。
[0088]
本发明提供的七妹羊肚菌遗传多样性分析的方法，可以对七妹羊肚菌进行聚类分析，为七妹羊肚菌品种鉴定以及遗传多样性分析建立了新的方法。
[0089]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的七妹羊肚菌的ssr微卫星分子标记及其引物组和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0090]
实施例1七妹羊肚菌全基因组水平ssr分子标记的检测及特征
[0091]
七妹羊肚菌参考基因组的ssr序列特征分析
[0092]
本发明以2015-9号七妹羊肚菌(刘伟.梯棱羊肚菌生长发育过程及羊肚菌属的组学研究[d].华中农业大学,2020.doi:10.27158/d.cnki.ghznu.2020.000544.)基因组为参考(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/jamgzg000000000.1/)，其基因组大小50.83mb，contig数量26条，gc％为47.18％，基因组的完整性98.6％，表明是一套高质量的七妹羊肚菌基因组。
[0093]
基于repeatmasker(v.4.1.2-p1)和repeatmodeler(v.2.0.2a)对2015-9号菌株基因组重复序列进行分析，结果显示七妹羊肚菌2015-9号菌株中重复序列约8.09mb，占基因组总长度的15.92％。其中非散在重复序列(non-interspersed repeats)28489个，总长度1.26mb，占基因组的2.48％；散在重复(non-interspersed repeats)14869个，总长度6.92mb，占基因组总长度的13.61％。非散在重复序列中以简单重复序列为主，共计24385个位点，用于基因组微卫星标记的开发。
[0094]
两个七妹羊肚菌20d15a和20d18a基因组草图的构建
[0095]
以二代illumina hiseq 4000双末端pe500的测序方案，分别对两个七妹羊肚菌：20d15a(http s://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/srr16686503)和20d18a(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/srr16686500)进行测序，每个菌株分别测序4g的rawdata，使
用二代基因组组装软件spade(v.3.15.3)分别对两个菌株进行基因组组装，spade具体参数：spades.py
‑‑
isolate
‑‑
pe-111.fastq
‑‑
pe-212.fastq-t 80-k 91
‑‑
cov-cutoff auto-m 1000-o./k91。
[0096]
组装结果显示，20d15a组装得到10236个contig序列，基因组大小48.51mb，gc％含量47.15％，contig n50长度47kb；20d18a组装得到24437个contig序列，基因组大小50.42mb，gc％含量47.25％，contig n50长度35kb；与参考基因组相比，完整性分别为95.43％和99.19％，可以满足对七妹羊肚菌全基因组水平的ssr特征分析和多态性位点标记的开发。
[0097]
七妹羊肚菌基因组范围内通用型ssr位点检测
[0098]
以2015-9号高质量基因组为参考，使用candissr软件(xia e-h et al.(2016)candissr：an efficient pipeline used for identifying candidate polymorphic ssrs based on multiple assembled sequences.front.plant sci.6：1171.doi：10.3389/fpls.2015.01171)，整合20d15a和20d18a两套基因组，进行七妹羊肚菌通用型ssr分子标记的开发，脚本使用参数如下：candissr.pl-i morexi.ctl-omorexi out-l 200-t 100。
[0099]
分析结果显示，七妹羊肚菌基因组中共计检测到2406个ssr位点至少在其中的两个七妹羊肚菌候选菌株之间具有多态性，其中1974个位点在三套基因组中具有多态性，作为ssr标记开发的候选位点。
[0100]
实施例2七妹羊肚菌基因组范围内通用型ssr标记的开发
[0101]
提取候选ssr位点上下游250bp序列，使用primer3.0软件进行ssr引物的开发，设定候选引物退火温度60℃
±
3℃，pcr产物125bp～300bp，引物长度20bp
±
3bp，候选引物数量5条。结果显示，所有的候选ssr位点均可以成功设计得到相应的ssr引物。
[0102]
结合pcr产物长度、多态性大小差异、引物的匹配度、候选位点多态性的标准差，引物在三个基因组中缺失率、物种间的可转移性，对前述1974个的ssr位点进行筛选，最终选择多态性最高、可转移性最好的40对引物作为七妹羊肚菌通用型ssr引物，其中40个ssr位点为seq id no.1～40所示的核苷酸序列；40对引物的核苷酸序列如seq id no.41～120所示(见表1)。
[0103]
实施例3七妹羊肚菌群体的ssr遗传多样性分析
[0104]
以收集自全国各地的7个遗传背景清晰的七妹羊肚菌菌株作为待测样本，菌株信息如表2所示：
[0105]
表2七妹羊肚菌群体信息
[0106]
菌株编号采集地采集时间系统发育学名称19-32-2四川成都2019morchella eximiaq-no.9四川德阳2014morchella eximiah-g5四川绵阳2021morchella eximiah-m733四川绵阳2021morchella eximiah-m328-1四川绵阳2021morchella eximiah-m328-2四川绵阳2021morchella eximiah-7416四川绵阳2021morchella eximia
h-7418四川绵阳2021morchella eximia
[0107]
其中h-m328菌株进行一次重复，菌株编号分别记为h-m328-1和h-m328-2，以确定实施例2筛选得到的40对ssr引物的稳定性。
[0108]
以表2中的8株七妹羊肚菌菌株作为待测样本，进行本发明实施例2开发的ssr标记(40对引物)适应性检测和遗传多样性分析，具体方法如下：
[0109]
以待测七妹羊肚菌的基因组dna为模板，利用实施例2获得的引物组进行pcr扩增，得到扩增产物；
[0110]
菌株的纯培养、dna提取和质检为常规的分子生物学方法，具体参考(刘伟等.梯棱羊肚菌单孢及杂交群体的栽培出菇试验和极性分析.菌物研究，2019，17(01)：43-49.doi：10.13341/j.jfr.2018.1238)；
[0111]
实施例2筛选得到的40对引物由北京擎科生物科技有限公司完成引物合成及添加fam荧光信号；
[0112]
pcr产物通过3730xl测序仪进行检测，得到的数据进行genemapper软件分析，根据分析结果，判断不同引物是否具有片段多态性；
[0113]
pcr扩增体系：2
×
taq pcr mastermix(green)10μl、10μm的正向引物1μl、10μm的反向引物1μl、ddh2o 7μl和基因组dna 1μl；
[0114]
pcr反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s、60℃退火10s、72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min；
[0115]
位点检测：pcr产物通过3730测序仪进行毛细管电泳，部分检测实例如图1所示，目的条带峰图锐利清晰，表明引物的专一性较高；
[0116]
位点分析：用软件gene mapper 4.1进行数据准确位点的分析，根据分析出来的位点信息来判断检测引物的多态性，样品在位点有片段则标记为1，没有则标记为0；
[0117]
8个七妹羊肚菌菌株的ssr指纹图谱如图2所示：包含40对ssr多态性引物，121个多态性条带，其中图2中第一行从左至右对应的菌株编号分别为h-7418、h-7416、h-m328-2、h-m328-1、h-m7_33、h-g5、q-no.9和19-32-2；
[0118]
遗传多样性分析：在genalex version 6.501和popgen32软件中，分别计算ssr位点的各项遗传多样性指标，包括观测等位基因(na)、有效等位基因(ne)、私有等位基因(np)、香农指数(i)。结果如表3所示，其中40对引物中，38对引物在8个七妹羊肚菌群体中的扩增多态性大于等于2条，最多的为5个多态性；多态性比例在12.5％～50％之间。有效等位基因在1.28到2.00之间，平均为1.531；香农指数在0.3768-0.6931之间，平均0.5004。
[0119]
表3七妹羊肚菌通用型ssr多态性特征
[0120]
引物总位点数多态性位点数appp(％)nanehimexi-18468450.00％2.00001.43060.28130.4480mexi-8568337.50％2.00001.58750.35420.5336mexi-14008337.50％2.00001.48080.30210.4717mexi-15208225.00％2.00001.74120.42190.6120mexi-14588337.50％2.00001.48080.30210.4717mexi-15348225.00％2.00001.28000.21880.3768mexi-1688337.50％2.00001.58750.35420.5336
mexi-18388337.50％2.00001.48080.30210.4717mexi-21068337.50％2.00001.48080.30210.4717mexi-15728337.50％2.00001.58750.35420.5336mexi-10348225.00％2.00001.74120.42190.6120mexi-10628337.50％2.00001.5875035420.5336mexi-13768337.50％2.00001.62670.36460.5441mexi-22988337.50％2.00001.48080.30210.4717mexi-16998337.50％2.00001.73330.41670.6059mexi-5108337.50％200001.62670.36460.5441mexi-13588225.00％2.00001.74120.42190.6120mexi-7228337.50％2.00001.73330.41670.6059mexi-17108225.00％2.00001.28000.21880.3768mexi-12288225.00％2.00001.28000.21880.3768mexi-11338112.50％2.00001.2800021880.3768mexi-22568450.00％2.00001.51060.32040.4944mexi-1 1928337.50％2.00001.48080.30210.4717mexi-7548562.50％2.00001.46450.30000.4709mexi-15648562.50％2.00001.42400.27500.4401mexi-23688562.50％2.00001.54000.32820.5023mexi-12158337.50％2.00001.62670.36460.5441
[0121]
在ntsys中计算得到相似性矩阵文件之后，基于相似性矩阵采用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，upgma)分别建立个体的聚类树。具体方法：在ntsys软件的在similarity模块中得到相似性矩阵或距离矩阵，再在clustering模块中得到聚类树。结果如图3所示，8个菌株中的h-m238-1和h-m238-2是同一个供试样品，结果也显示在40对ssr引物的检测中未有差异，也表明本发明设计的ssr的稳定性较高；其他6个菌株均被聚类在了不同的分支，整体在0.5的遗传距离上分为两大类，表明它们之间具有明显的遗传多样性，具有不同的遗传背景。
[0122]
综上所述，本发明提供的ssr微卫星分子标具有多态性和稳定性好的优势，利用本发明所提供的ssr微卫星分子标记设计的引物可用于七妹羊肚菌物种的鉴定、群体遗传多样性分析等，具有较好的应用价值。
[0123]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.七妹羊肚菌的ssr微卫星分子标记，其特征在于，所述ssr微卫星分子标记包括seq id no.1～40所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述ssr微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于，包括：通过2套基因组的de novo测序与组装，与参考基因组进行比较，确定ssr位点和ssr的多态性，进而筛选得到多态性最好的40个ssr位点。3.扩增权利要求1所述ssr微卫星分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括40对引物对，各引物的核苷酸序列如seq id no.41～120所示。4.一种扩增权利要求1所述ssr微卫星分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的引物组。5.一种七妹羊肚菌群体的分子指纹图谱，其特征在于，所述分子指纹图谱由权利要求3所述的引物组经pcr扩增后构建得到。6.权利要求3所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在鉴定七妹羊肚菌中的应用。7.权利要求3所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在七妹羊肚菌的遗传多样性分析中的应用。8.一种七妹羊肚菌遗传多样性分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测七妹羊肚菌的基因组dna为模板，利用权利要求3所述的引物组进行pcr扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物进行电泳检测，得到扩增条带；对所述扩增条带进行分析，待测七妹羊肚菌在每个ssr位点有相同的扩增条带分别记为“1”，无相同的扩增条带分别记为“0”，得到待测七妹羊肚菌的分子指纹图谱；基于分子指纹图谱，分别计算出ssr位点的各项遗传多样性指标和获得聚类分析图。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ssr位点的各项遗传多样性指标包括等位基因、有效等位基因、私有等位基因和香农指数中的一种或多种。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系以20μl计，包括2
×
taq pcrmastermix10μl、正向引物1μl、反向引物1μl、基因组dna1μl和余量的ddh2o；所述pcr扩增的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s、60℃退火10s、72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及七妹羊肚菌的SSR微卫星分子标记及其引物组和应用。本发明所述SSR微卫星分子标记包括SEQ ID NO.1～40所示的核苷酸序列。本发明基于高质量七妹羊肚菌基因组数据，并重新完成了2个七妹羊肚菌菌株的基因组denovo组装，通过比较基因组技术开发SSR分子标记，可以直接得到物种间共有的SSR位点信息和多态性信息，进而完成SSR标记的开发，得到了一套多态性和稳定性好的七妹羊肚菌SSR微卫星标记，利用本发明所提供的SSR微卫星分子标记设计的引物可用于七妹羊肚菌物种的鉴定、群体遗传多样性分析等，具有较好的应用价值。具有较好的应用价值。具有较好的应用价值。


技术研发人员：刘伟 时晓菲 杨振艳 于富强
受保护的技术使用者：中国科学院昆明植物研究所
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/9/14