一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法

1.本发明涉及一种对抗肿瘤药物的筛选评价方法，特别是涉及一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法。


背景技术：

2.近年来三维（3d）培养模型的开发弥补了传统的二维（2d）培养模式的不足，与2d环境相比，肿瘤细胞在3d环境中的生长状态、分化潜力、黏附形式、增殖速率等发生较大的变化。三维培养下的肿瘤细胞可以获得持续自我复制、肿瘤血管生成、抵抗免疫摧毁、基因组突变等生物学特性，在肿瘤疾病的治疗、预后、抗肿瘤药物开发和高通量筛选、耐药机制等研究方面具有广泛的应用前景。因此构建一个能够更准确模拟人体肿瘤生长环境且经济高效的3d模型，对于药物开发和评价筛选至关重要。
3.细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新型细胞程序性死亡方式，依靠炎症小体激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）家族的部分蛋白，使其切割并激活焦孔素蛋白（gasdermin, gsdm），活化的gsdm转移到细胞膜上形成孔洞，细胞肿胀出现泡状破裂，胞质外流，胞内炎性因子释放，最终导致细胞膜破裂，引起细胞死亡。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白３（nod-like receptor protein 3, nlrp3）/凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a card, asc）/caspase-1通路构成了炎症小体激活的经典通路，nlrp3/asc/caspase-1三者结合，在多种危险信号刺激下被激活而引起多种慢性退行性疾病。
4.研究发现，nlrp3炎症小体通过激活caspase-1而引发细胞焦亡，也可引起细胞代谢紊乱、组织损伤，在肺癌中起着关键性作用。故本实验以人肺癌a549细胞为研究对象，通过超低吸附培养法建立肺癌a549细胞三维培养模型，研究不同浓度丙泊酚对细胞焦亡nlrp3/asc/caspase-1通路的影响，为肺癌疾病的研究和治疗提供有力证据。
5.丙泊酚是一种烷基酸类的短效静脉麻醉药，研究发现丙泊酚在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌的发生与转移中有抑制作用，可影响肿瘤细胞的增殖、分化、转移等途径。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，本发明基于96超低吸附（ula）培养孔板，建立肺癌a549细胞三维培养模型，通过cck-8法、elisa、蛋白免疫印迹法研究细胞焦亡发生，确定了一种便捷、可靠的肿瘤细胞三维培养方式，并对肺癌细胞焦亡予以分析，为肺癌疾病的治疗和候选药物的筛选提供了理论基础。
7.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，所述方法包括以下过程：a. 构建肿瘤细胞三维模型：
培养板为96孔超低吸附培养板（ula培养板）；三维培养中，采用肺癌a549细胞细胞，制成浓度为1
×
105个ml-1
细胞悬液，每孔100 μl接种于96超低吸附培养孔板中，离心3分钟(1000 rpm) 后放置于37℃、5% co2培养箱中培养；b.做细胞焦亡分析：1）cck-8法检测丙泊酚对a549细胞增殖的影响：a549细胞以每孔1
×
104个ml-1
接种于ula 96孔板；培养24 h后，给药组每孔加入20 μl丙泊酚药物，空白组加入同等体积的培养基；继续培养24、48、72 h，吸出孔内液体，每孔加入20 μl cck-8溶液作用2 h，酶标仪520 nm记录吸光度值，计算细胞存活率；2）酶联免疫吸附法检测肺癌a549细胞上清炎症因子il-6、il-1β、il-18水平变化：将a549细胞以每孔5
×
105个ml-1
接种于ula 24孔板，培养24 h后，按上述方法分组处理细胞，培养48 h，12000 g离心30 min，收集上清，elisa试剂盒检测上清il18、il-1β、il-6水平；3）蛋白免疫印迹法检测各组肺癌a549细胞焦亡相关蛋白nlrp3、asc、caspase-1、gasdermin-n、il1-β表达水平以研究细胞焦亡通路过程：按上述方法分组处理细胞，48 h后弃废液，将细胞收集于ep管内离心3 min，预冷pbs清洗细胞3次，加入含蛋白酶抑制剂ripa裂解液，冰上裂解30 min，12000 g离心10 min，收集上清即为细胞总蛋白，bca蛋白测定试剂盒测定蛋白总浓度后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯膜后，脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il1-β、gapdh一抗（1：2000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜，pbst洗涤30 min后加入相应二抗（1：4000稀释）孵育2 h，配制ecl显影液，gapdh为内参分析目的蛋白表达水平。
8.所述的一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，所述肺癌a549细胞三维模型包括采用超低吸附培养法培养肺癌a549三维细胞球，显微镜下考察细胞球形态；将三维培养的肺癌a549细胞分为空白对照组、低浓度组（20 μmol
×
l-1
）、中浓度组（60 μmol
×
l-1
）、高浓度组（100 μmol
×
l-1
），cck-8法检测丙泊酚对a549细胞增殖的影响；酶联免疫吸附法检测肺癌a549细胞上清炎症因子il-6、il1-β、il18水平变化；蛋白免疫印迹法检测各组肺癌a549细胞焦亡相关蛋白nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il1-β表达水平。
9.所述的一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，所述建立肺癌a549细胞三维模型具体步骤：1） 细胞复苏：在液氮中迅速取出细胞冻存管放置于37℃水浴锅中摇晃至完全融化，离心3分钟（1000 rpm）后加入预热培养基，放置于37℃、5% co2培养箱中培养；2）三维细胞培养：倒置显微镜下观察a549细胞生长至细胞培养瓶底约90%时，加入pbs溶液清洗，胰蛋白酶消化，离心，血球计数板计数，制成浓度为1
×
105个ml-1
细胞悬液，每孔100 μl加入ula 96孔板中，离心3 min后，放置于37 ℃、5%培养箱中培养，隔天换液；3）肺癌a549细胞三维模型培养板为超低吸附培养孔板；三维培养中，细胞制成浓度为1
×
105个ml-1
细胞悬液，每孔100 μl接种于96超低吸附培养孔板中。
10.所述的一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，所述肺癌a549细胞焦亡分析方法为cck-8法检测丙泊酚对a549细胞增殖的影响；酶联免疫吸附法检测肺癌a549细胞上清炎症因子il-6、il1-β、il18水平变化；蛋白免疫印迹法检测各组肺癌a549细胞焦亡相关蛋白nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il1-β表达水平；
所述的一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，所述肺癌a549细胞焦亡分析方法具体步骤：1） cck-8法检测细胞增殖：将a549细胞以每孔1
×
104个ml-1
接种于ula 96孔板，培养24 h后，小心吸除各孔培养基，每孔加入20 μl药物，空白组加入同等体积的培养基；继续培养24、48、72 h，小心吸出孔内液体，每孔加入20 μl cck-8溶液作用2 h，酶标仪520 nm记录吸光度值，计算细胞存活率；2）elisa检测细胞上清炎症因子，将a549细胞以每孔5
×
105个ml-1
接种于ula 24孔板，培养24 h后，上述方法分组处理细胞，培养48 h，12000 g离心30 min，收集上清，elisa试剂盒检测上清il-18、il-1β、il-6水平；3）蛋白免疫印迹法检测细胞焦亡蛋白表达水平，上述方法分组处理细胞，48 h后弃废液，将细胞收集于ep管内离心3 min，预冷pbs清洗细胞3次，加入含蛋白酶抑制剂ripa裂解液，冰上裂解30 min，12000 g离心10 min，收集上清即为细胞总蛋白，bca蛋白测定试剂盒测定蛋白总浓度；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯膜后，脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il-1β、gapdh一抗（1：2000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜，pbst洗涤30 min后加入相应二抗（1：4000稀释）孵育2 h，配制ecl显影液，gapdh为内参分析目的蛋白表达水平。
11.本发明的优点与效果是：1.细胞焦亡是一种新型细胞程序性死亡方式，在病毒、细菌、炎症等病理刺激下，nlrp3炎症小体形成，进而激活caspase-1，活化的caspase-1作用于gsdm d-n端，在细胞膜上形成孔洞，细胞肿胀破裂，细胞内容物释放。细胞焦亡会释放炎症因子，激发人体免疫系统进而产生抗炎作用，细胞焦亡发生在肿瘤细胞中时，il-6、il-1β、il-18等炎症因子会作用于肿瘤细胞起到抑制肿瘤的作用。
12.2. 肺癌a549细胞在三维培养下，可在体外高度模拟肿瘤细胞的体内微环境，肿瘤细胞与微环境的相互作用直接影响肿瘤的生长、转移、侵袭和复发。超低吸附培养法为肿瘤细胞三维培养方法，细胞培养板孔底附着与表面共价键结合的水凝胶，能最大限度地减少肿瘤细胞附着、细胞活化、蛋白质吸收和酶活化，使肿瘤细胞以三维模型成球生长，该水凝胶对肿瘤细胞无毒性作用，广泛应用于细胞非贴壁培养、类器官、圆球体等培养物。
13.3.本发明采用超低吸附培养孔板培养肺癌a549细胞，建立三维培养模型，并应用cck-8法检测丙泊酚对本模型中细胞的影响；酶联免疫吸附法检测肺癌细胞上清炎症因子变化水平；蛋白免疫印迹法检测各组肺癌a549细胞焦亡相关蛋白表达水平以研究细胞焦亡。结果证明本发明成功的采用了超低吸附培养法建立肺癌a549细胞三维培养模型，并进行细胞焦亡的研究分析。本模型的建立方法简单、准确、经济、便捷，用于抗肿瘤候选药物的筛选和细胞焦亡通路的分析方法，能够降低抗肿瘤药物研发的成本。
附图说明
14.图1是本发明在超低吸附培养孔板下细胞球形态学形态；图2是本发明cck-8法检测丙泊酚作用后肺癌a549细胞存活率；图3是本发明elisa检测细胞上清炎症因子水平；图4是本发明蛋白免疫印迹法检测细胞焦亡相关蛋白表达。
实施方式
15.下面结合附图所示实施例对本发明进行详细说明。
16.三维细胞培养，具体包括以下步骤：细胞复苏：在液氮中迅速取出细胞冻存管放置于37℃水浴锅中摇晃至完全融化，离心后加入预热培养基，放置于37℃、5%培养箱中培养。
17.三维细胞培养：倒置显微镜下观察a549细胞生长至细胞培养瓶底约90%时，加入pbs溶液清洗，胰蛋白酶消化，离心，血球计数板计数，制成浓度为1
×
105个ml-1
细胞悬液，每孔100 μl加入ula 96孔板中，离心3 min后，放置于37 ℃、5%培养箱中培养，隔天换液.本发明采用ula孔板，形成的细胞球形态较为规则完整，超低吸附培养法为肿瘤细胞三维培养方法，细胞培养板孔底附着与表面共价键结合的水凝胶，能最大限度地减少肿瘤细胞附着、细胞活化、蛋白质吸收和酶活化，使肿瘤细胞以三维模型成球生长，该水凝胶对肿瘤细胞无毒性作用，广泛应用于细胞非贴壁培养、类器官、圆球体等培养物。
18.三维培养结果表明，在光学显微镜观察3d培养下，a549细胞呈悬浮聚集式生长，细胞间有聚拢黏附趋势，在培养12 h即可清晰观察到细胞成球，且细胞球形状、大小不一。随着培养时间的增长，细胞球体积逐渐增大，且逐渐圆滑。肿瘤细胞的3d培养，会更清晰的观察出肿瘤组织的生长特征，对其新生血管形成、生理相关的信号通路轮廓、基因表达、细胞-基质和细胞-细胞相互作用等方面提供更有力的证据。证明通过超低吸附培养法成功建立了肺癌a549细胞三维培养模型，见图1。细胞焦亡研究：细胞焦亡是一种新型细胞程序性死亡方式，在病毒、细菌、炎症等病理刺激下，nlrp3炎症小体形成，进而激活caspase-1，活化的caspase-1作用于gsdm d-n端，在细胞膜上形成孔洞，细胞肿胀破裂，细胞内容物释放。细胞焦亡会释放炎症因子，激发人体免疫系统进而产生抗炎作用，细胞焦亡发生在肿瘤细胞中时，il-6、il-1β、il-18等炎症因子会作用于肿瘤细胞起到抑制肿瘤的作用。
19.肺癌a549细胞焦亡研究，具体包括以下步骤：cck-8法检测细胞增殖：将a549细胞以每孔1
×
104个ml-1
接种于ula 96孔板，培养24 h后，小心吸除各孔培养基，每孔加入20 μl药物，空白组加入同等体积的培养基。继续培养24、48、72 h，小心吸出孔内液体，每孔加入20 μl cck-8溶液作用2 h，酶标仪520 nm记录吸光度值，计算细胞存活率。
20.elisa检测细胞上清炎症因子：将a549细胞以每孔5
×
105个ml-1
接种于ula 24孔板，培养24 h后，上述方法分组处理细胞，培养48 h，12000 g离心30 min，收集上清，elisa试剂盒检测上清il18、il1-β、il-6水平。
21.蛋白免疫印迹法检测细胞焦亡蛋白表达水平：上述方法分组处理细胞，48 h后弃废液，将细胞收集于ep管内离心3 min，预冷pbs清洗细胞3次，加入含蛋白酶抑制剂ripa裂解液，冰上裂解30 min，12000 g离心10 min，收集上清即为细胞总蛋白，bca蛋白测定试剂盒测定蛋白总浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯膜后，脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il-1β、gapdh一抗（1：2000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜，pbst洗涤30 min后加入相应二抗（1：4000稀释）孵育2 h，配制ecl显影液，gapdh为内参分析目的蛋白表达水平。
22.实验结果：cck-8法检测丙泊酚作用a549细胞24h、48h、72h细胞存活率，结果显示，与空白对照组相比，低、中、高浓度丙泊酚组a549细胞存活率随着时间和剂量的增加依次降低；elisa实验结果显示，与空白对照组相比，低、中、高浓度丙泊酚组a549细胞上清炎症因子il-6、il-1β、il-18水平随着药物剂量的增加而增加；蛋白免疫印迹法实验结果显示，与空白对照组相比，低、中、高浓度丙泊酚组a549细胞nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il-1β蛋白表达水平依次增加。
23.因此，超低吸附培养法可快捷、简便的建立肺癌细胞三维培养模型，肿瘤细胞三维培养模型可用于研究nlrp3/asc/caspase-1细胞焦亡通路。
24.综上所述，本发明通过超低吸附培养法成功建立肺癌细胞三维培养模型，在三维模型下，丙泊酚可能通过激活nlrp3/asc/caspase-1细胞焦亡通路促进肺癌a549细胞焦亡而抑制a549细胞增殖。

技术特征：
1.一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，其特征在于，所述方法包括以下过程：a. 构建肿瘤细胞三维模型：培养板为96孔超低吸附培养板（ula培养板）；三维培养中，采用肺癌a549细胞细胞，制成浓度为1
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105个ml-1
细胞悬液，每孔100 μl接种于96超低吸附培养孔板中，离心3分钟(1000 rpm) 后放置于37℃、5% co2培养箱中培养；b.做细胞焦亡分析：1）cck-8法检测丙泊酚对a549细胞增殖的影响：a549细胞以每孔1
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104个ml-1
接种于ula 96孔板；培养24 h后，给药组每孔加入20 μl丙泊酚药物，空白组加入同等体积的培养基；继续培养24、48、72 h，吸出孔内液体，每孔加入20 μl cck-8溶液作用2 h，酶标仪520 nm记录吸光度值，计算细胞存活率；2）酶联免疫吸附法检测肺癌a549细胞上清炎症因子il-6、il-1β、il-18水平变化：将a549细胞以每孔5
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105个ml-1
接种于ula 24孔板，培养24 h后，按上述方法分组处理细胞，培养48 h，12000 g离心30 min，收集上清，elisa试剂盒检测上清il18、il-1β、il-6水平；3）蛋白免疫印迹法检测各组肺癌a549细胞焦亡相关蛋白nlrp3、asc、caspase-1、gasdermin-n、il1-β表达水平以研究细胞焦亡通路过程：按上述方法分组处理细胞，48 h后弃废液，将细胞收集于ep管内离心3 min，预冷pbs清洗细胞3次，加入含蛋白酶抑制剂ripa裂解液，冰上裂解30 min，12000 g离心10 min，收集上清即为细胞总蛋白，bca蛋白测定试剂盒测定蛋白总浓度后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯膜后，脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il1-β、gapdh一抗（1：2000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜，pbst洗涤30 min后加入相应二抗（1：4000稀释）孵育2 h，配制ecl显影液，gapdh为内参分析目的蛋白表达水平。2.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，其特征在于，所述肺癌a549细胞三维模型包括采用超低吸附培养法培养肺癌a549三维细胞球，显微镜下考察细胞球形态；将三维培养的肺癌a549细胞分为空白对照组、低浓度组（20 μmol
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）、中浓度组（60 μmol
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）、高浓度组（100 μmol
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），cck-8法检测丙泊酚对a549细胞增殖的影响；酶联免疫吸附法检测肺癌a549细胞上清炎症因子il-6、il1-β、il18水平变化；蛋白免疫印迹法检测各组肺癌a549细胞焦亡相关蛋白nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il1-β表达水平。3.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，其特征在于，所述建立肺癌a549细胞三维模型具体步骤：1） 细胞复苏：在液氮中迅速取出细胞冻存管放置于37℃水浴锅中摇晃至完全融化，离心3分钟（1000 rpm）后加入预热培养基，放置于37℃、5% co2培养箱中培养；2）三维细胞培养：倒置显微镜下观察a549细胞生长至细胞培养瓶底约90%时，加入pbs溶液清洗，胰蛋白酶消化，离心，血球计数板计数，制成浓度为1
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细胞悬液，每孔100 μl加入ula 96孔板中，离心3 min后，放置于37 ℃、5%培养箱中培养，隔天换液；3）肺癌a549细胞三维模型培养板为超低吸附培养孔板；三维培养中，细胞制成浓度为1
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细胞悬液，每孔100 μl接种于96超低吸附培养孔板中。4.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，其
特征在于，所述肺癌a549细胞焦亡分析方法为cck-8法检测丙泊酚对a549细胞增殖的影响；酶联免疫吸附法检测肺癌a549细胞上清炎症因子il-6、il1-β、il18水平变化；蛋白免疫印迹法检测各组肺癌a549细胞焦亡相关蛋白nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il1-β表达水平。5.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，其特征在于，所述肺癌a549细胞焦亡分析方法具体步骤：1） cck-8法检测细胞增殖：将a549细胞以每孔1
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接种于ula 96孔板，培养24 h后，小心吸除各孔培养基，每孔加入20 μl药物，空白组加入同等体积的培养基；继续培养24、48、72 h，小心吸出孔内液体，每孔加入20 μl cck-8溶液作用2 h，酶标仪520 nm记录吸光度值，计算细胞存活率；2）elisa检测细胞上清炎症因子，将a549细胞以每孔5
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105个ml-1
接种于ula 24孔板，培养24 h后，上述方法分组处理细胞，培养48 h，12000 g离心30 min，收集上清，elisa试剂盒检测上清il-18、il-1β、il-6水平；3）蛋白免疫印迹法检测细胞焦亡蛋白表达水平，上述方法分组处理细胞，48 h后弃废液，将细胞收集于ep管内离心3 min，预冷pbs清洗细胞3次，加入含蛋白酶抑制剂ripa裂解液，冰上裂解30 min，12000 g离心10 min，收集上清即为细胞总蛋白，bca蛋白测定试剂盒测定蛋白总浓度；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯膜后，脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人nlrp3、asc、caspase-1、gsdmd-n、il-1β、gapdh一抗（1：2000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜，pbst洗涤30 min后加入相应二抗（1：4000稀释）孵育2 h，配制ecl显影液，gapdh为内参分析目的蛋白表达水平。

技术总结
本发明一种肿瘤细胞三维模型对抗肿瘤药物的筛选与评价方法，涉及一种抗肿瘤药物的筛选评价方法。本发明采用超低吸附培养孔板培养肺癌A549细胞，建立三维培养模型，并应用CCK-8法检测丙泊酚对本模型中细胞的影响；酶联免疫吸附法检测肺癌细胞上清炎症因子变化水平；蛋白免疫印迹法检测各组肺癌A549细胞焦亡相关蛋白表达水平以研究细胞焦亡。结果证明本发明成功的采用了超低吸附培养法建立肺癌A549细胞三维培养模型，并进行细胞焦亡的研究。本模型的建立方法简单、准确、经济、便捷，用于抗肿瘤候选药物的筛选和细胞焦亡通路的分析，能够降低抗肿瘤药物研发的成本。降低抗肿瘤药物研发的成本。


技术研发人员：汪海峰 关冀弛 陈艳阁 杨金雨
受保护的技术使用者：沈阳化工大学
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/9/14