用于制备果糖的组合物及制备方法

dehydrogenase，mdh)生产。同时，为了充分再生甘露醇脱氢酶用作辅因子的nadh，还导入了通过氧化甲酸还原nad+的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,fdh)。阿洛酮糖转化反应后，将残留的大量果糖转化为不同功能性的糖醇甘露醇，使阿洛酮糖容易分离，使果糖的附加价值也会上升。
6.通过依次生产功能糖的生产工艺，最终生产甘油葡萄糖苷、阿洛酮糖和甘露醇。现有技术中，依次生产两种以上功能糖的工艺是之前没有研究过的首个发明事例。本发明提供了创造底物最大附加价值的，低成本、高效率的依次生产功能糖的工艺，提高高价功能性材料的商业利用潜力。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供产出率优秀的用于制备果糖的组合物及制备方法。
8.1.用于制备果糖的组合物，包括蔗糖磷酸化酶或产上述蔗糖磷酸化酶的微生物；或上述微生物的培养物或粉碎物。
9.2.在1中，上述蔗糖磷酸化酶为由序号1至4中的任一序列组成，或由序列同源性超过80％的序列组成。
10.3.在1中，上述微生物是通过内在原因或外在原因产出上述酶。
11.4.在1中，上述微生物是大肠杆菌属或棒状杆菌属微生物。
12.5.在1中，上述微生物通过诱导具有休眠细胞。
13.6.在1组合物；及以果糖为底物的糖类生产途径中的酶、产出上述酶的微生物、上述微生物的培养物或粉碎物的糖类制造用组合物。
14.7.在6中，以上述果糖为底物的糖类生产途径为阿洛酮糖生产途径、甘露醇生产途径、塔格糖生产途径及山梨醇生产途径。
15.8.在6中，产蔗糖磷酸化酶的微生物，还能产出以果糖为底物的糖类生产途径中的酶。
16.9.果糖制备方法，包括将果糖和甘油与上述1至5中任一项的组合物反应的步骤。
17.10.在9中，还包括从反应液中分离果糖的步骤。
18.11.在9中，上述组合物包括上述微生物，上述各反应是在上述微生物内进行。
19.12.在11中，在上述蔗糖和蔗糖磷酸化酶的反应前还包括在繁育培养基中培养上述微生物，使上述微生物具有休眠细胞的诱导步骤。
20.13.在9中，上述反应是在不含缓冲剂的反应液中进行。
21.14.糖类制备方法，包括将蔗糖和甘油与上述6至8中任一项的组合物反应的步骤。
22.15.在14中，上述糖类是阿洛酮糖、甘露醇、塔格糖及山梨醇，上述组合物包括上述糖类合成途径中的酶、产上述酶的微生物、上述微生物的培养物或粉碎物。
23.本发明能以高产出率制备果糖。
24.本发明可以降低果糖的制备成本。
附图说明
25.图1为表示通过酶反应从蔗糖或此后途径的糖类的制备过程。
26.图2为利用重组大肠杆菌构建的果糖生产工艺及酶的活性比较结果。
27.图2a为表示用蔗糖磷酸化酶生产果糖的结果。
28.图2b为表示生产甘油葡萄糖苷的结果。
29.图2c、2d为表示消耗蔗糖和甘油的结果。ac表示拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的蔗糖磷酸化酶,ba表示青春双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶，bp表示假假长双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶假长双歧杆菌，td表示达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)产出蔗糖磷酸化酶。
30.图3为有无缓冲剂的蔗糖磷酸化酶的生产量比较结果。
31.图3a为表示有无缓冲剂的果糖生产量。
32.图3b为表示有无缓冲剂的ph变化。ac表示拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的蔗糖磷酸化酶,ba表示青春双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶，bp表示假长双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶，td表示达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)产出蔗糖磷酸化酶，o表示利用缓冲的情况，x表示没有利用缓冲的情况。
33.图4为以大肠杆菌为全细胞的蔗糖磷酸化酶活性比较结果。
34.图4a为用蔗糖磷酸化酶进行的果糖生产量比较结果。
35.图4b为用蔗糖磷酸化酶进行的甘油葡萄糖苷生产量比较结果。
36.图4c为用蔗糖磷酸化酶进行的蔗糖消耗结果。
37.图4d为用蔗糖磷酸化酶进行的甘油消耗结果。ac表示拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的蔗糖磷酸化酶,ba表示青春双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶，bp表示假长双歧杆菌，td表示达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)产出蔗糖磷酸化酶。
38.图5为依次生产功能糖过程中使用或生产的物质的高效液相色谱图。
39.图6为利用精炼糖生产功能糖的结果图。第一次工艺是果糖和甘油葡萄糖苷生产工艺结果，第二次工艺是阿洛酮糖生产工艺结果，第三次工艺是甘露醇生产工艺结果。
具体实施方式
40.下面详细说明本发明。
41.本发明提供用于制备果糖的组合物。
42.本发明的组合物包括蔗糖磷酸化酶或产该蔗糖磷酸化酶的微生物；或该微生物的培养物或粉碎物。
43.蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase，spase)是以蔗糖作底物，将该蔗糖磷酸化的酶。
44.具体地，蔗糖磷酸化酶可以将蔗糖及甘油作为底物，生产果糖及甘油葡萄糖苷。
45.由于甘油和甘油葡萄糖苷，与果糖相比，溶解度等物理性质差异大，因此很容易从其混合液中分离出高纯度果糖。
46.蔗糖磷酸化酶除了已公知的蔗糖磷酸化酶之外，考虑序列同源性等因素，可以使用具有相同功能的所有蛋白质。例如，可以使用由序号1至4中的任一序列组成的肽，或由序列同源性80％以上的序列组成的肽。
47.产蔗糖磷酸化酶的微生物可以是由于内在原因或外在原因产上述肽。
48.由于外在原因产上述肽，则上述微生物中可以导入编码上述肽的基因。基因的导入可以是在本领域公知的质粒、逆转录病毒、呼吸系统病毒等病毒性载体、非病毒性载体。
49.微生物为原核细胞或真核细胞，可以在液体培养基中培养，也可以在前述高温下培养。上述微生物可以是细菌、真菌或两者的组合。细菌可以是革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或两者的组合，从提高果糖生产量方面考虑，优选革兰氏阳性细菌。革兰氏阴性菌可以为埃希氏杆菌属(escherichia)。革兰氏阳性细菌可以是芽孢杆菌属、棒状杆菌属、液质霉素属、乳酸菌或该群中任意组合。真菌可以是酵母、克鲁维氏酵母属或两者的组合。
50.微生物是通过诱导具有休眠细胞。
51.使其具有休眠细胞的诱导是将上述微生物培养到静止期(stationary phase)来完成。培养到静止期可以在包含或不包含底物的培养基上进行。较优地，在包含底物的培养基上培养，能使微生物适应底物。
52.到静止期的培养可以在繁育培养基上培养，该繁育培养基可以包含能培养上述微生物的已公知的所有成分。
53.在本说明书中，休眠细胞(resting cell)是指不再增殖的培养细胞。在本说明书中，静止期(stationary phase)是指在培养细胞中，经过对数期(exponential phase)，细胞的分裂和增殖停止，不会增加细胞个体数量，细胞成分的合成和分解达到平衡的状态。
54.因此，本发明提供的休眠细胞是生长已结束，并且在细胞内已充分产出上述蛋白质的细胞。当微生物通过诱导具有休眠细胞时，蔗糖磷酸化酶的产量达到最大值，从而可以最大限度地提高果糖的产量。
55.微生物的培养物可以包括包含培养后微生物的培养基、分离出培养后微生物的培养基或在培养过程中微生物分泌的物质等。培养基可以是固体培养基或液体培养基。
56.微生物的粉碎物是通过超声破碎法(sonication)等方法得出的微生物的粉碎物，可以包括上述微生物内的上述蛋白质。
57.另外，本发明提供用于制备糖类的组合物。
58.用于制备糖类的组合物包括上述用于制备果糖的组合物，还包括果糖之后途径的制备糖类所需的物质。
59.使用上述用于制备果糖的组合物，可以从蔗糖中制备出果糖，如果还包括后续途径的制备糖类所需的物质，则制备果糖之后的途径可以依次进一步进行。
60.果糖之后途径的制备糖类所需的物质可以是以果糖为底物的糖类生产途径中的酶、产该酶的微生物、上述微生物的培养物或粉碎物。
61.作为制备对象的糖类可以是以果糖为底物制备的所有糖类。例如阿洛酮糖生产途径、甘露醇生产途径、塔格糖生产途径及山梨醇生产途径等。
62.上述糖类生产途径中的酶包括从果糖为底物的酶到生产最终的糖类中使用的所有酶，各种糖类生产途径已被公知，参与其生产的酶也已被公知，因此可以使用这种已被公知途径中的已被公知酶。相应的酶可以是多种微生物产生产出的酶。
63.作为具体的例子，要生产的糖类是阿洛酮糖，可以使用阿洛酮糖差向异构化酶，例如梭状芽胞杆菌(clostridium hylemonae)产出的阿洛酮糖差向异构化酶(genbank id:eeg74378.1，序号21)。要生产的糖类是甘露醇，则还可以增加甘露醇脱氢酶和甲酸脱氢酶。甘露醇脱氢酶可以使用由罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)产出的甘露醇脱氢酶(genbank id:wp_003669358，序号22)，甲酸脱氢酶可以使用由母牛分枝杆菌(mycobacterium vaccae)产出的甲酸脱氢酶(genbank id:bab69476.1,序号23,mvfdh)，但
不限于此。
64.在以果糖作为底物的糖类生产途径的酶中，如果需要增加所需的底物，则本发明的用于制备糖类的组合物可以进一步包含这种底物。例如，如果糖类是甘露醇，则可以进一步使用作为甲酸脱氢酶的底物的甲酸钠。
65.如果本发明的用于制备糖类的组合物包括微生物、其培养物或粉碎物，则该微生物可以是产蔗糖磷酸化酶的微生物，还可以是产出制备糖类的途径所需酶的其他微生物，产蔗糖磷酸化酶的微生物也可以进一步产以果糖为底物的糖类生产途径的酶。
66.产酶的微生物可以是通过内在原因或外在原因产上述肽。
67.由于外在原因产上述肽，则上述微生物中可以导入编码上述肽的基因。基因的导入可以是在本领域公知的质粒、逆转录病毒、呼吸系统病毒等病毒性载体、非病毒性载体。
68.微生物为原核细胞或真核细胞，可以在液体培养基中培养，也可以在前述高温下培养。上述微生物可以是细菌、真菌或两者的组合。细菌可以是革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或两者的组合，从提高果糖生产量方面考虑，优选革兰氏阳性细菌。革兰氏阴性菌可以为埃希氏杆菌属(escherichia)。革兰氏阳性细菌可以是芽孢杆菌属、棒状杆菌属、液质霉素属、乳酸菌或该群中任意组合。真菌可以是酵母、克鲁维酵母属或两者的组合。
69.微生物通过诱导具有休眠细胞。
70.另外，本发明提供果糖的制备方法。
71.本发明提供的果糖的制备方法包括将蔗糖及甘油与上述用于制备果糖的组合物进行反应的步骤。
72.本发明的组合物包括蔗糖磷酸化酶或产该蔗糖磷酸化酶的微生物；或上述微生物的培养物或粉碎物，因此上述反应可以在微生物内进行。
73.上述反应可以在30～90℃的温度条件下进行，但不限于此。在上述范围内，可以在30～90℃、30～80℃、30～70℃、40～80℃、40～70℃、45～70℃、50～70℃的条件下进行。
74.反应时作为底物的蔗糖与甘油的比例没有特别限制。例如摩尔比可以是1:0.1至10。在上述范围内，可以是1:0.1至10、1:0.1至8、1:0.5至8、1:1至8、1:1至5等。
75.如果本发明提供的组合物包括上述微生物、培养物或粉碎物，则本发明的方法可以进一步包括在上述反应之前，诱导上述微生物使其具有休眠细胞的步骤。此时，可以最大程度提高果糖的生产量。
76.诱导上述微生物使其具有休眠细胞，可以通过将上述微生物培养到静止期来完成。
77.培养到静止期可以在包含或不包含底物的培养基上进行，较优地，在包含底物的培养基上培养，能使微生物更好的适应底物。
78.到静止期的培养可以在繁育培养基上培养，这是为了可以包含培养该微生物所需的所有已公知的成分。
79.上述反应可以在不包含缓冲剂的反应液中进行。在使用酶或微生物生产目标产物时，通常需要使用缓冲剂使ph保持在一定范围内，否则酶活性会下降，导致产出率大幅下降。本发明提供的方法即使在不包含缓冲剂的反应液中进行反应，也能表现出优秀的产出率，从而减少制备果糖所需的时间、成本等。
80.将蔗糖和甘油与上述用于制备果糖的组合物进行反应，可以得到果糖和甘油葡萄
糖苷的混合物，由于果糖与甘油、甘油葡萄糖苷相比溶解度等物理性质差异大，因此很容易从甘油和甘油葡萄糖苷中分离出来。因此，本发明提供的方法还可以包括从反应后的混合液中分离出果糖的步骤。
81.另外，本发明提供糖类的制备方法。
82.本发明提供的糖类制备方法包括将蔗糖及甘油与上述用于制备糖类的组合物进行反应的步骤。
83.用于制备糖类的组合物包括上述用于制备果糖的组合物，因此，蔗糖及甘油与用于制备果糖的组合物进行反应可以制备出果糖。并且，用于制备糖类的组合物还包括果糖之后途径的制备糖类所需的物质，因此，以果糖为底物可以进一步进行，制备果糖之后的途径的制备糖类的反应。
84.上述反应可以在微生物内进行。
85.如果本发明提供的组合物包括上述微生物、培养物或粉碎物，则本发明的方法可以进一步包括在上述反应之前，诱导上述微生物使其具有休眠细胞的步骤。此时，可以最大程度提高果糖的生产量。
86.诱导上述微生物使其具有休眠细胞，可以通过将上述微生物培养到静止期来完成。
87.培养到静止期可以在包含或不包含底物的培养基上进行，较优地，在包含底物的培养基上培养，能使微生物更好的适应底物。
88.到静止期的培养可以在繁育培养基上培养，这是为了可以包含培养该微生物所需的所有已公知的成分。
89.上述反应可以在不包含缓冲剂的反应液中进行。在使用酶或微生物生产目标产物时，通常需要使用缓冲剂使ph保持在一定范围内，否则酶活性会下降，导致产出率大幅下降。本发明提供的方法即使在不包含缓冲剂的反应液中进行反应，也能表现出优秀的产量，从而减少制备糖类所需的时间、成本等。下面通过实施例更加具体地说明本发明。
90.实施例
91.1.利用重组大肠杆菌构建果糖生产工艺及酶活性比较
92.以现有使用的高温高活性的青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)产出的蔗糖磷酸化酶(genbank id:aao33821.序号1，baspase)的氨基酸序列为主链，利用ncbi的blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)获得同源的多样菌群产出的氨基酸的排序结果。其中，选定与青春双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶具有83.8％同源性的假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)产出的蔗糖磷酸化酶(genbank id:wp_026643821.1,序号2,bpspase)，具有76.2％同源性的拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的蔗糖磷酸化酶(genbank id:wp_018142968.1,序号3,acspase),具有55.1％同源性的达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)产出的蔗糖磷酸化酶。其中，拟南芥菌株(alloscardovia criceti)和青春双歧杆菌是从韩国典型菌种保藏中心(korean collection for type cultures，缩写为kctc)领取并使用kctc 5819和kctc 3234，达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)是从德国微生物菌种保藏中心(german collection of microorganisms and cell cultures gmbh，缩写为dsmz)领取并使用dsm 23592。
93.纯化领取的菌株的基因组，进行pcr使其包括各自的蔗糖磷酸化酶编码基因序列。
进行序号5的假长双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶编码基因序列的pcr，使用序号6和7的引物对，进行序号8的拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的蔗糖磷酸化酶编码基因序列的pcr，使用序号9和10的引物对，进行序号11的达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)产出的蔗糖磷酸化酶编码基因序列的pcr，使用序号12和13的引物对。引物委托了bioneer(韩国生物科技企业)，并且使用赛默飞世尔科技(thermofisher scientific，美国)的高保真dna聚合酶(phusion dna polymerase)作为复合酶，根据建议条件使用宝日(takara，日本)的梯度pcr扩增仪(pcr thermal cycler dice)进行了rcr。
94.得到的pcr产物使用纽英伦生物技术(new england biolabs，neb，英国)的核酸内切酶(kpni)和限制性内切酶(xbai)的限制性酶，导入到包含trc启动子的大肠杆菌的表达载体ptrc99a中，其结果获得重组载体pt-acspase、pt-bpspase和pt-tdspase。在甘油磷酸化酶(glucose kinase，glpk)缺失的大肠杆菌bw 25113
△
glpk菌株中，采用参考sambrook等molecular cloning 3rd(2001)的化学方法导入重组载体。转基因重组大肠杆菌保存在-80℃下使用。
95.通过烧瓶大量繁育重组大肠杆菌，确保细胞浓度为od 40用于全细胞转化反应的生物催化剂，含有200g/l蔗糖和200g/l甘油的250mmol/l菲普斯(fipes)(ph 7.0)作为转化溶液，在60℃的转化温度下以180rpm的搅拌速度进行6个小时的转化反应，比较每种酶的活性。糖是使用shimadzu(日本)的高效液相色谱(high performance liquid chromatography,hplc)进行分析，85％的乙醛作为在移动图像，使用了kromasil(瑞典)的kr100-5nh2(250х4.6mmol/l,5μm)色谱柱和示差折光检测器(reflective index detector,rid)。结果显示在图2中。
96.参考图2a的果糖生产结果，导入拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌在2小时内达到反应平衡，不仅生产速度最快，最终生产出105.8g/l的果糖，产量也最多。导入假长双歧杆菌产出蔗糖磷酸化酶和达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)产出蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌，与现有使用的青春双歧杆菌产出的果糖磷酸化酶相比，实现类似的果糖生产量，都是在3小时内达到反应平衡。
97.参考图2b的甘油葡萄糖苷结果，显示出与果糖生产结果相似的情况，导入拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌表现出了最佳的生产量，最终生产了107.3g/l的甘油葡萄糖苷。
98.从图2c和2d的蔗糖和甘油消耗结果来看，200g/l的蔗糖全部消耗，而200g/l的甘油消耗量与200g/l的蔗糖摩尔比例相同，消耗了约50g/l，残留了约150g/l。由于甘油与果糖的物理性质差异明显，因此认为不会对果糖的高纯度分离产生任何影响。
99.所有酶都具有固有的最佳活性ph，但为了保持ph而使用的缓冲剂的价格昂贵，因此提高最终生产成本，降低反应液的纯度，使产品的高纯度分离变得困难。这些问题阻碍工业生产发展，因此需要发现ph依赖性低的酶。在本发明中，为了应用上述方法，比较了新发现的蔗糖磷酸化酶的ph值下的活性。在上述转化反应中，为了维持公知的蔗糖磷酸化酶最佳活性ph值的ph 7.0，使用了250mmol/l的菲普斯(fipes)缓冲剂，并且在相同条件下使用未添加缓冲剂的反应液，比较了蔗糖磷酸化酶的生产量。在与前实验相同的菌株和生产条件下，分为包括和不包括菲普斯(fipes)缓冲剂，比较了前面筛选的所有蔗糖磷酸化酶的ph依赖度。结果显示在图3中。
100.图3a为根据有无缓冲剂的果糖生产量的变化图。假长双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶在没有使用缓冲剂时，与使用缓冲剂时相比，反而提升了生产量。拟南芥菌株(alloscardovia criceti)及达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)产出的蔗糖磷酸化酶在没有使用缓冲剂时，与使用缓冲剂时相比，显示出相似的生产量。然而，假长双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶在没有使用缓冲剂时，与使用缓冲剂时相比，生产量下降了32％，显示出随ph的不同，活性差异最大。
101.图3b为根据有无缓冲剂的ph变化图。在使用250mmol/l菲普斯(fipes)(ph 7.0)时，与蔗糖磷酸化酶的出处无关，在转化反应期间保持在ph 6.6-6.8之间。但在没有使用缓冲剂的情况下，经过1小时的转化反应后下降到ph 5.4-5.8之间，在以后的转化反应期间保持不变。结果表明，青春双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶随ph的变化导致大幅度的活性下降，不能作为高效的生产酶使用，然而新发现的拟南芥菌株(alloscardovia criceti)、假长双歧杆菌及达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)产出的蔗糖磷酸化酶不依赖于ph，具有日后用于工业生产的高效、经济的生产酶的价值。
102.2.利用重组棒状杆菌构建果糖生产工艺及酶活性比较
103.为了建立有利于高温的工艺，利用具有细胞壁厚而耐热的革兰氏阳性菌，作为gras菌株用较安全的棒状杆菌进行了新旧蔗糖磷酸化酶活性比较。以纯化的各菌株的基因组作为主链，进行pcr，使其包括蔗糖磷酸化酶编码基因序列。为了将bamhi和noti用作限制性酶，利用序号15和16的引物对，进行pcr，使其包含拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的磷酸化酶基因编码内置换bamhi和noti位置基因序列的序号14序列。利用序号17和18的引物对，进行pcr，使其包含序号5的假长双歧杆菌产出的蔗糖磷酸化酶，，利用序号19和20的引物对，进行pcr，使其包含序号11的达氏嗜热菌(thermanaerothrix daxensis)产出蔗糖磷酸化酶编码基因。
104.将得到的pcr产物利用bamhi和noti的限制性酶，导入至包含棒状杆菌用强力合成驱动h30的大肠杆菌-棒状杆菌双载体pces-h30(yim ss,et al.,2013.isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in corynebacterium glutamicum)，获得重组载体pces-h30-acspase、pces-h30-bpspase及pces-h30-tdspase。在野生型谷氨酸棒状杆菌atcc 1302上，采用参考了eggeling等handbook of corynebacterium glutamicum(2005)的电学方法导入了重组载体。转化后的重组棒状杆菌保存在-80℃下使用。导入了pces-h30-acspase、pces-h30-baspase、pces-h30-bpspase及pces-h30-tdspase的重组野生型科里菌谷氨酰胺atcc13032菌株，确保od40的细胞浓度，用作全细胞转化反应的生物催化剂，以利用大肠杆菌的全细胞转化反应同等条件下，进行果糖生产转化反应。结果显示在图4中。
105.参考图4a中果糖生产量结果，与大肠杆菌中的结果相同，导入了拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出蔗糖磷酸化酶的棒状杆菌中的生产量最佳，在经过6小时的转化反应后产生了101.6g/l果糖，与在大肠杆菌相比，在棒状杆菌中生产的甘油葡萄糖苷的生产速度显著减少。
106.参考图4b的甘油葡萄糖苷生产结果，显示与果糖生产结果类似的情况，导入了拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的蔗糖磷酸化酶的重组棒状杆菌呈现出最佳的生产量，在最后6个小时的转化反应后，产生85.9g/l的甘油葡萄糖苷。
107.参考图4c和图4d的蔗糖和甘油消耗结果，可以确认蔗糖和甘油消耗与各自蔗糖磷酸化酶的果糖产量成反比。
108.棒状杆菌作为果糖生产菌株时，与大肠杆菌相比，生产量低下。然而，加大在棒状杆菌中的蔗糖磷酸化酶的产量，则与大肠杆菌具有相似的生产量，并且建有高温下稳定的菌株，可以实现最大化果糖生产工艺的生产量和生产成本性价比的高温果糖生产工艺。
109.3.从蔗糖依次生产阿洛酮糖和甘露醇的生产工艺研发
110.确认从蔗糖生产果糖的工艺成功构建后，依次应用了之前研究开发的阿洛酮糖和甘露醇的生产工艺。
111.将上述酶比较中显示出最佳生产量的，导入有拟南芥菌株(alloscardovia criceti)产出的蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌，以od 40的细胞浓度，使用以200g/l蔗糖和200g/l甘油作为底物的250mmol/l菲普斯(pipes)(ph 7.0)转化溶液，在60℃的转化温度下，以180rpm的搅拌速度进行2小时全细胞转化反应。然后，在3500rpm，通过15分钟的离心分离，分离出细胞和反应液，并将分离出的反应液用作第二次工艺，即阿洛酮糖生产工艺的底物和反应溶液。
112.将导入有对梭状芽胞杆菌(clostridium hylemonae)产出的阿洛酮糖差向异构化酶(genbank id:eeg74378.1,序号21,chdpe)编码的基因的重组谷氨酸棒状杆菌，确保od40的细胞浓度作为生物催化剂使用，添加了酶活性辅助因子锰。全细胞转化反应是在60℃的转化温度、180rpm的搅拌速度下进行了1个小时。反应后，用相同方法分离出的反应液用作第三次甘露醇生产工艺的底物及反应溶液。
113.将导入有对罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)产出的甘露醇脱氢酶(genbank id:wp_003669358，序号22，lrmdh)编码的基因，及导入有对母牛分枝杆菌产出的甲酸脱氢酶(genbank id:bab69476.1,序号23,mvfdh)编码的基因的重组谷氨酸棒状杆菌，确保od40的细胞浓度，用作生物催化剂，并将作为加酸脱氢酶底物的钠甲酸，与预测的残存果糖浓度相同的摩尔浓度予以添加。另外，甘露醇转化反应在早期ph 6.0时表现出良好的活性，因此使用50％的甲酸对ph进行了校正，在45℃的转化温度，180rpm的搅拌速度下进行了12小时的转化反应。
114.迄今为止研究开发的各转化反应的转化率为，果糖生产工艺中的转化率是，与蔗糖浓度相比为100％，在阿洛酮糖生产工艺中的转化率是，与果糖相比为30％，在甘露醇生产工艺中的转化率是，与果糖相比为60％。各物质的高效液相色谱高效液相色谱图显示在图5中，转化反应结果显示在图6中。
115.如图6所示，第一次工艺的果糖转化反应结果是，使用全部蔗糖依据粉碎物生产了100g/l的果糖，作为反应副产物，附加生产了101g/l的甘油葡萄糖苷，并残留了155g/l甘油。然后，通过离心分离分离细胞和反应液的过程中，用作全细胞的大肠杆菌长时间暴露在高温，导致细胞膜消退，混入反应液，糖浓度被稀释，使得果糖的浓度变为93g/l，甘油葡萄糖苷的浓度变为84g/l，甘油的浓度变为134g/l。在第二次转化工艺的阿洛酮糖转化反应后，残留有与理论收率相似的62g/l果糖，似乎使用了与理论相同量的果糖，但是生产出了低于预期浓度28g/l的19g/l的阿洛酮糖。阿洛酮糖的产量减少，据推测使用了比阿洛酮糖生产工艺中使用的400g/l较低的93g/l，导致了转化速度减小。在第三次转化工艺的甘露醇转化反应中，根据增加的底物甲酸的添加和ph校正，初始糖浓度稀释为果糖44g/l、甘油葡
萄糖苷66g/l、甘油110g/l和阿洛酮糖15g/l。在甘露醇转化反应后，产生了与理论转化率相同的27g/l的甘露醇，残留有14g/l的果糖，甘油、甘油葡萄糖苷即阿洛酮糖均与反应前保持相同量。综上所述，从200g/l的蔗糖和200g/l的甘油，最终生产出3种功能糖，即甘油葡萄糖苷68g/l、阿洛酮糖15g/l和甘露醇27g/l。但是，在每次转化反应中，由于比添加所需物质更多是被其他因素导致浓度被稀释，所以乘以稀释倍数，计算出了根据原反应浓度的产量。稀释倍数是通过比较第一次反应后的甘油和甘油葡萄糖苷量与最后反应后剩下的量计算得出。乘上稀释倍数后的结果，确认最终生产出甘油葡萄糖苷、阿洛酮糖及甘露醇的产量为分别99g/l、22g/l、39g/l。
116.由此，通过依次应用功能糖的生产工艺，证实了从蔗糖依次生产三种功能糖的糖提炼法的理念实际可行，并成功构建。这是从低廉的蔗糖中创造出极大的附加价值的高效的糖提炼法。

技术特征：
1.用于制备果糖的组合物，其特征在于，包括蔗糖磷酸化酶或产所述蔗糖磷酸化酶的微生物；或所述微生物的培养物或粉碎物。2.如权利要求1所述的用于制备果糖的组合物，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶为由序号1至4中的任一序列组成，或由序列同源性超过80％的序列组成。3.如权利要求1所述的用于制备果糖的组合物，其特征在于，所述微生物是通过内在原因或外在原因产出所述酶。4.如权利要求1所述的用于制备果糖的组合物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌属或棒状杆菌属微生物。5.如权利要求1所述的用于制备果糖的组合物，其特征在于，所述微生物通过诱导具有休眠细胞。6.用于制备糖类的组合物，其特征在于，如权利要求1所述的用于制备果糖的组合物；及以果糖为底物的糖类生产途径中的酶、产出所述酶的微生物、所述微生物的培养物或粉碎物的糖类制造用组合物。7.如权利要求6所述的用于制备糖类的组合物，其特征在于，以所述果糖为底物的糖类生产途径为阿洛酮糖生产途径、甘露醇生产途径、塔格糖生产途径及山梨醇生产途径。8.如权利要求6所述的用于制备糖类的组合物，其特征在于，产蔗糖磷酸化酶的微生物，还能产出以果糖为底物的糖类生产途径中的酶。9.果糖制备方法，其特征在于，包括将果糖和甘油与如权利要求1至5中任一项所述的组合物反应的步骤。10.如权利要求9所述的果糖制备方法，其特征在于，还包括从反应液中分离果糖的步骤。11.如权利要求9所述的果糖制备方法，其特征在于，所述组合物包括所述微生物，所述各反应是在所述微生物内进行。12.如权利要求11所述的果糖制备方法，其特征在于，在所述蔗糖和蔗糖磷酸化酶的反应前还包括在繁育培养基中培养所述微生物，使所述微生物具有休眠细胞的诱导步骤。13.如权利要求9所述的果糖制备方法，其特征在于，所述反应是在不含缓冲剂的反应液中进行。14.糖类制备方法，其特征在于，包括将蔗糖和甘油与如权利要求6至8中任一项所述的组合物反应的步骤。15.如权利要求14所述的糖类制备方法，其特征在于，所述糖类是阿洛酮糖、甘露醇、塔格糖及山梨醇，所述组合物包括所述糖类合成途径中的酶、产所述酶的微生物、所述微生物的培养物或粉碎物。

技术总结
本发明公开了用于制备果糖的组合物及制备方法。该用于制备果糖的组合物包括：蔗糖磷酸化酶或表达它的微生物；该微生物的培养物或者粉碎物。本发明提供的用于制备果糖的组合物及制备方法可以降低成本，提高果糖的产出率。提高果糖的产出率。提高果糖的产出率。


技术研发人员：金善原 郑圣憙 朴志瑸 权文赫
受保护的技术使用者：庆尚国立大学校产学协力团
技术研发日：2022.02.28
技术公布日：2023/9/14