用于寡核苷酸的脱三苯甲基的方法与流程

用于寡核苷酸的脱三苯甲基的方法
1.本发明涉及一种用于生产线性p连接的寡核苷酸的新颖方法，该方法包括用包含在甲苯和乙腈的溶剂混合物中的质子酸的脱三苯甲基溶液来去除5'-o寡核苷酸处的酸不稳定的5'羟基保护基团。
2.寡核苷酸合成在原理上是将核苷残基逐步添加到生长链的5'末端，直到组装出所需的序列。
3.通常，每次添加都称为合成循环，且在原理上由化学反应组成
4.a1)使固体支持物上的5'保护的羟基基团解封，
5.a2)将作为活化亚磷酰胺的第一个核苷与固体支持物上的游离羟基基团偶联，
6.a3)氧化或硫化相应的p-连接的核苷以形成相应的磷酸二酯(p＝o)或相应的硫代磷酸酯(p＝s)；
7.a4)任选地，将固体支持物上的任何未反应的羟基基团封端；
8.a5)使附着在固体支持物上的第一个核苷的5'羟基基团解封；
9.a6)将第二个核苷作为活化的亚磷酰胺偶联以形成相应的p-o连接的二聚体；
10.a7)氧化或硫化相应的p-o连接的二核苷以形成相应的磷酸二酯(p＝o)或相应的硫代磷酸酯(p＝s)；
11.a8)任选地，将任何未反应的5'羟基基团封端；
12.a9)重复前面的步骤a5到a8直到组装出所需的序列。
13.替代性地，反应顺序可以从使预加载到固体支持物上的核苷的5'保护的羟基基团解封开始。后续步骤遵循上述顺序。
14.最后，组装的寡核苷酸从固体支持物上切下，并且随后的下游处理和纯化方法提供所需的纯寡核苷酸。
15.5'保护的羟基基团的解封，即去除5'-o寡核苷酸处的酸不稳定的5'羟基保护基团是寡核苷酸合成中的关键重复方法步骤，因为在每个循环中它为迄今为止组装的寡核苷酸准备好与下一个核苷偶联。
16.解封方法原则上是标准的并且在本领域中是众所周知的。
17.美国专利6,538,128说明了标准程序，并公开了在芳烃溶剂(通常是甲苯)存在下，使用质子酸(诸如二氯乙酸或三氯乙酸)去除三苯甲基基团，该三苯甲基基团是典型的5'羟基保护基团。
18.美国专利6,538,128进一步讨论了溶剂，诸如二氯甲烷和乙腈。据描述，乙腈会减慢脱三苯甲基速率(实例2，第18行)和表1。
19.减慢效应的原因已在c.h.paul等人,3048-3052,nucleic acids research,1996,第24卷,第15期中进行了讨论。假定乙腈与质子酸形成复合物，并与寡核苷酸竞争，大大减慢了脱三苯甲基。
20.pct国际公开wo 2012/059510公开了用于降低由固体支持物在各种溶剂中溶胀引起的固体支持物柱中的压力的方法，例如在作为寡核苷酸合成的一部分的脱三苯甲基过程中使用的溶剂。建议在脱三苯甲基反应之前或之后用包含二氯甲烷或芳烃(如甲苯)的洗涤
液洗涤固体支持物，这将降低寡核苷酸合成过程中产生的压力。洗涤溶液可包含乙腈。脱三苯甲基遵循标准方法，即应用甲苯中含有dca的酸性溶液。减少不需要的副减少不是本pct公开的目的。
21.本发明的目的是进一步改进用于5'保护的羟基基团的解封的方法，特别是减少不需要的副反应，例如n-1杂质的形成，以及减少脱嘌呤。
22.发现该目的可以通过使用用于在甲苯和乙腈的溶剂混合物中的质子酸去除5'-o寡核苷酸上酸不稳定的5'羟基保护基团的方法来实现。
23.由于在乙腈存在下嘌呤碱基的糖苷键的水解减少，本发明的方法令人惊讶地产生显著更少的脱三苯甲基相关副产物，同时脱三苯甲基的动力学没有受到负面影响。
24.在此，阐述以下定义以说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。
25.术语酸不稳定的5'羟基保护基团被定义为在合适的酸的帮助下可切割并具有疏水特性的保护基团。
26.典型的酸不稳定的5'羟基保护基团选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9-苯基-呫吨-9-基、9-(对甲苯基)-呫吨-9-基或叔丁基二甲基甲硅烷基，优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基或三苯甲基，或者甚至更优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基。
27.本文中所使用的术语寡核苷酸被定义为技术人员通常将其理解为包含两个或更多个共价连接的核苷酸的分子。为了用作具有治疗价值的寡核苷酸，寡核苷酸通常被合成为长度为10至40个核苷酸、优选地为10至25个核苷酸。
28.寡核苷酸可由任选地修饰的dna、rna或lna核苷单体或其组合组成。
29.lna核苷单体是经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖环的c2'与c4'之间包含接头基团或桥。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(bna)。
30.任选地，如本文所用的经修饰的是指与等同的dna、rna或lna核苷相比，通过引入糖部分或核碱基部分的一个或多个(一种或多种)修饰而被修饰的核苷。在优选的实施例中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分，并且可以例如包含一个或多个2'取代的核苷和/或一个或多个lna核苷。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。
31.dna、rna或lna核苷通常由将两个核苷共价偶联在一起的磷酸二酯(p＝o)和/或硫代磷酸酯(p＝s)核苷间键合连接。
32.因此，在一些寡核苷酸中，所有核苷间键合都可由磷酸二酯(p＝o)组成，在其他寡核苷酸中，所有核苷间键合都可由硫代磷酸酯(p＝s)组成，或者在又其他寡核苷酸中，核苷间键合的序列不同并且包含磷酸二酯(p＝o)和硫代磷酸酯(p＝s)核苷间两者。
33.核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如a、t、g、c或u，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例的寡核苷酸中，对于lna核苷，核碱基部分用大写字母a、t、g和
me
c(5-甲基胞嘧啶)描述，对于dna核苷，核碱基部分用小写字母a、t、g、c和
me
c描述。经修饰的核碱基包括但不限于带有保护基团的核碱基，该保护基团为诸如叔丁基苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、乙酰基、异丁酰基或二甲基甲脒基(dimethylformamidino)。
34.所描述的寡核苷酸合成原理是本领域众所周知的(参见维基百科贡献者.“oligonucleotide synthesis”wikipedia,the free encyclopedia.,2021年1月19日.网络.2021年2月16日)。
35.如今，更大规模的寡核苷酸合成是使用计算机控制的合成仪以自动化方式进行的。
36.通常，寡核苷酸合成是一种固相合成，其中正在组装的寡核苷酸通过其3'末端羟基共价结合至固体支持物材料，并在整个链组装过程中与其保持附接。合适的支持物是市售的大孔聚苯乙烯支持物，如来自ge healthcare的primer支持物5g或来自kinovate的hl支持物，或受控孔隙玻璃支持物，如来自lgc的核碱基预加载支持物。
37.如上所述，寡核苷酸合成在原理上是将核苷酸残基逐步添加到生长链的5'末端，直到组装出所需的序列，正如上文所述的那样。
38.随后的从树脂上的切割可以用浓氨水进行。磷酸根和核碱基上的保护基团也在此切割过程中被去除。
39.如上所述，本发明的方法涉及一种用于生产线性p连接的寡核苷酸的方法，该方法包括用在甲苯和乙腈的溶剂混合物中的质子酸去除5'-o寡核苷酸处的酸不稳定的5'羟基保护基团。
40.质子酸通常选自乙酸、氯乙酸、二氯乙酸或三氯乙酸。优选的质子酸为二氯乙酸。
41.典型的酸不稳定的5'羟基保护基团可以选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9-苯基-呫吨-9-基、9-(对甲苯基)-呫吨-9-基或叔丁基二甲基甲硅烷基，优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基或三苯甲基，或者更优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基。
42.与甲苯中的质子酸的溶剂混合物中的乙腈浓度通常在0.1％(v)至70％(v)，优选10％(v)至25％(v)的范围内。
43.甲苯中的质子酸浓度通常选择在3％(v)至20％(v)，优选7％(v)至17％(v)的范围内。
44.因此，在一个优选的实施例中，在甲苯中的二氯乙酸浓度选择在3％(v)至20％(v)，优选7％(v)至17％(v)的范围内。
45.乙腈与在甲苯中的质子酸混合后的最终脱三苯甲基溶液的流速通常在0.1cv/min至2.0cv/min，优选0.3cv/min至1.7cv/min的范围内。
46.作为一个典型的例子，使用标准的寡核苷酸合成仪器，通过根据最终流速的相应比率设置泵速率(例如对于总流速为在85％甲苯中的质子酸溶液和15％乙腈的比例下的1.0cv/min，0.85cv/min甲苯中的质子酸溶液和0.15cv/min乙腈)，将甲苯中的质子酸溶液与乙腈在线混合。
47.在本发明方法的条件下，可以达到低于8％、低于7.0％、低于6.0％、更优选低于5.0％的脱嘌呤水平(表示为“脱嘌呤相关杂质的总和”)。
48.此外，在本发明方法的条件下，可以达到低于3.0％、低于2.5％、低于2.0％、更优选低于1.5％的n-1杂质水平(表示为“n-1杂质的总和”)。
49.该水平可以在粗寡核苷酸阶段实现和测量，即对于在切割和脱保护后且在应用任何下游处理(如纯化或超滤)之前获得的寡核苷酸。
50.在一些实施例中，树脂结合的寡核苷酸中间体或在脱三苯甲基步骤之前用乙腈和
甲苯的混合物来洗涤。
51.在其他实施例中，树脂结合的寡核苷酸中间体在脱三苯甲基步骤后用乙腈和甲苯的混合物来洗涤。
52.在优选的实施例中，树脂结合的寡核苷酸中间体在脱三苯甲基步骤之前和之后用乙腈和甲苯的混合物来洗涤。
53.用于洗涤的具有甲苯的溶剂混合物中的乙腈浓度通常在0.1％(v)至70％(v)，优选10％(v)至25％(v)的范围内。
54.通过举例说明，寡核苷酸可以选自：
55.t*t*a*c*a*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*t*
me
c*
mec56.其中*代表硫代磷酸酯桥；a、t和
me
c(5-甲基胞嘧啶)是lna核苷单体，并且a、t、c是dna核苷单体。
57.本文公开的化合物具有以下核碱基序列
58.seq id no.1：ttacacttaattatacttcc
59.实例
60.缩写：
61.ac2o＝乙酸酐
62.btt＝5-苄基硫代四唑
63.bz＝苄基
64.dca＝二氯乙酸
65.dea＝二乙胺
66.dna＝2'-脱氧核糖核苷酸
67.dmt＝4,4'-二甲氧基三苯甲基
68.cv＝柱体积
69.lna＝2'-o-ch
2-4'-桥接核糖核苷酸
70.mecn＝乙腈
71.na＝不适用
72.nmi＝n-甲基咪唑
73.phme＝甲苯
74.实例1.
75.t*t*a*c*a*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*t*
me
c*
me
c的合成其中*代表硫代磷酸酯桥；a、t和
me
c(5-甲基胞嘧啶)是lna核苷单体，并且a、t、c是dna核苷单体。
76.通过标准亚磷酰胺化学法，使用akta oligopilot 100和primer support unylinker(nittophase lh unylinker 330)以2.65mmol的规模在固相上生产标题化合物。
77.每个循环中都已使用了以下亚磷酰胺：
78.[0079][0080]
通常使用1.5当量的亚磷酰胺。所有试剂均按购自市售来源的原样使用，并制备了适当浓度的试剂溶液(详见下文)。使用氢氧化铵实现切割和脱保护得到粗制寡核苷酸。
[0081]
标准试剂溶液
[0082]
解封查看实例亚磷酰胺0.2m乙腈溶液活化剂乙腈中的0.3m btt硫醇化吡啶/乙腈中的0.1m黄原酐(3/7v/v)封端anmi/乙腈20/80(v/v)封端b乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/乙腈20/30/50(v/v/v)胺洗液20％乙腈中的二乙胺(v/v)切割和脱保护55℃下的28％
–
32％氢氧化铵水溶液
[0083]
将来自切割和脱保护步骤的粗溶液在真空中浓缩以去除过量的氨。将浓缩溶液冻干以提供呈固体的粗寡核苷酸。对淡黄色固体取样并进行lc-uv-ms分析。将杂质根据其指定的结构进行分组。所有n-1杂质的总和以及所有脱嘌呤相关杂质的总和用于工艺参数的分析。
[0084]
实例2
[0085]
脱三苯甲基实例
[0086]
如下表所列，使用二氯乙酸在甲苯和乙腈中的多种溶液进行脱三苯甲基。通过按表中提供的比例将甲苯中的二氯乙酸与乙腈在线混合，将混合物输送至柱。
[0087][0088]
认为实例2b)、2c)、2d)、2h、2i)、2j)和2k)是优选的。最优选实例2b)和2k)。实例2m)至2o)是比较例。

技术特征：
1.一种用于生产线性p连接的寡核苷酸的方法，其包括用包含在甲苯和乙腈的溶剂混合物中的质子酸的脱三苯甲基溶液来去除5'-o寡核苷酸处的酸不稳定的5'羟基保护基团。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述质子酸选自乙酸、氯乙酸、二氯乙酸或三氯乙酸。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述质子酸为二氯乙酸。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述酸不稳定的5'羟基保护基团选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9-苯基-呫吨-9-基、9-(对甲苯基)-呫吨-9-基或叔丁基二甲基甲硅烷基。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述酸不稳定的5'羟基保护基团选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基或三苯甲基。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述的具有甲苯的溶剂混合物中的乙腈浓度在0.1％(v)至70％(v)，优选10％(v)至25％(v)的范围内。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中甲苯中的质子酸浓度在3％(v)至20％(v)，优选7％(v)至17％(v)的范围内。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中去除所述酸不稳定的5'羟基保护基团是通过应用0.1cv/min至2.0cv/min的流速的脱三苯甲基溶液进行的。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在去除所述5'-o寡核苷酸处的所述酸不稳定的5'羟基保护基团之前或之后用乙腈和甲苯的混合物来洗涤5'-o寡核苷酸中间体。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法在脱嘌呤水平低于8.0％的条件下进行，所述脱嘌呤水平表示为“脱嘌呤相关杂质的总和。11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法在n-1杂质水平低于3.0％的条件下进行，所述n-1杂质水平表示为“n-1杂质的总和”。12.根据权利要求10或11所述的方法，其中针对在切割和脱保护之后且在应用任何下游处理之前获得的粗寡核苷酸来测量所述脱嘌呤水平和所述n-1杂质水平。

技术总结
本发明涉及一种用于生产线性P连接的寡核苷酸的新颖方法，所述方法包括用包含乙腈的脱三苯甲基溶液来去除5'-O寡核苷酸处的酸不稳定的5'羟基保护基团。所述方法允许生产脱嘌呤和N-1杂质含量低的寡核苷酸。1杂质含量低的寡核苷酸。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：豪夫迈
技术研发日：2022.02.15
技术公布日：2023/9/14