用于吸入的多黏菌素的共制剂的制作方法

用于吸入的多黏菌素的共制剂
1.相关申请的交叉引用
2.本专利申请涉及并要求2021年1月1日提交的美国临时专利申请序列号63/133,257的优先权权益，其内容在此通过引用整体并入到本公开内容中。
3.政府支持条款
4.本发明是在由国立卫生研究院(national institutes of health)授予的ai132681的政府支持下完成的。政府对本发明具有某些权利。
技术领域
5.本技术一般地涉及：用于降低多黏菌素的毒性并提高其治疗效力的方法，该方法包括将多黏菌素与聚天冬氨酸共配制的步骤；以及制备用于肺部递送的包含多黏菌素和聚天冬氨酸的溶液、混悬液或干粉组合物的方法。治疗肺部感染的药物组合物和方法在本发明的范围内。


背景技术：

6.本部分介绍了可有助于促进较好地理解本公开内容的方面。因此，这些陈述应以这种角度来阅读，而不应理解为承认什么是或不是现有技术。
7.在过去几十年中，吸入多黏菌素已用于治疗由革兰氏阴性“超级细菌”(例如铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌)引起的肺部感染。
1-4
然而，给药方案是经验性的，并从未使用药代动力学/药效学原则进行优化。高剂量吸入多黏菌素可导致肺毒性，例如肺嗜酸性粒细胞增多症、过敏性肺炎和急性呼吸衰竭。
5-8
我们最近的研究表明，多黏菌素可导致肺上皮细胞凋亡，并涉及氧化应激和线粒体毒性(例如线粒体膜去极化)。9我们的成像研究还显示，多黏菌素与肺上皮细胞中的线粒体显著共定位。
10
此外，非靶向代谢组学结果显示，多黏菌素治疗显著影响肺上皮细胞中的多种途径，包括膜磷脂生物合成。
11
因此，开发新方法以将多黏菌素诱导的肺毒性最小化是必要的。
附图说明
8.当结合以下说明和附图时，本发明的上述和其他目的、特征和优点将变得更加明显，其中在可能的情况下，使用相同的附图标记来表示与附图共有的相同特征，并且其中：
9.图1a至1e.由聚天冬氨酸在24小时对多黏菌素b在a549细胞中诱导的细胞毒性的抑制。paa，聚天冬氨酸；pmb，多黏菌素b。数据表示为平均值
±
sd(n＝3)。由聚天冬氨酸在24小时对多黏菌素b在a549细胞中诱导的毒性的减弱。图1a至1b：细胞死亡的减弱；图1c：线粒体超氧化物形成的减弱；图1d：线粒体膜电位的恢复；以及图1e：胞内多黏菌素b摄取的抑制。paa，聚天冬氨酸；pga、聚谷氨酸；pmb，多黏菌素b。数据表示为平均值
±
sd(n＝3)。
10.图2a：不同治疗组中肺组织损伤程度的组织学评估。比例尺＝100μm(
×
10放大率)。图2b：多黏菌素b和聚天冬氨酸的组合显示出由多黏菌素b单独评估的sqs显著降低(p《0.01)。数据表示为平均值
±
sd(n＝3)。
11.图3a至3e.喷雾干燥的纯黏菌素(图3a)、纯聚天冬氨酸(图3b)及其不同比例：5:1(图3c)、1:1(图3d)和1:5(图3e)的组合制剂的代表性扫描电子显微镜(sem)图像。
12.图4.不同喷雾干燥制剂的x-射线衍射图
13.图5a至5c.黏菌素和聚天冬氨酸的喷雾干燥制剂的fpf(图5a)、ed(图5b)和e-fpf(图5c)值(平均值
±
sd，n＝4)。*与sd纯黏菌素显著不同，其中p《0.05，**p《0.01，以及***p《0.001。
14.图6.黏菌素和聚天冬氨酸的喷雾干燥制剂的ngi沉积谱(平均值
±
sd，n＝4)。*与sd纯黏菌素显著不同，其中p*《0.05，**p《0.01，以及***p《0.001，****p《0.0001。
具体实施方式
15.出于促进对本公开内容原理的理解的目的，现在将参考附图中所示出的一些实施方案并且将使用特定语言对其进行描述。然而，将理解，不旨在由此限制本公开内容的范围。
16.如本文中所用，以下术语和短语应具有以下所阐述的含义。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
17.在本公开内容中，术语“约”可允许值或范围内的可变程度，例如，在规定值或范围的规定界限的20％内、10％内、5％内或1％内。
18.在本公开内容中，术语“基本上”可允许值或范围内的可变程度，例如，在规定值或范围的规定界限的80％内、90％内、95％内或99％内。
19.在本文中，除非上下文另有明确规定，否则没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/更多种。除非另有说明，否则术语“或”用于表示非排他性的“或”。另外，应当理解，本文使用并且没有另外限定的措辞或术语仅用于描述的目的而不是限制的目的。任何小节标题的使用旨在帮助阅读文件而不应被理解为限制性的。此外，与小节标题相关的信息可出现在该具体节之内或之外。此外，本文件中提及的所有出版物、专利和专利文件均通过引用整体并入本文，如同通过引用单独并入一样。如果本文件与通过引用并入的那些文件之间的使用不一致，则在并入的参考文献中的用法应被考虑为对本文件的用法的补充；对于相互矛盾的不一致情形，则应以本文件中的用法为准。
20.如本文中所用，术语“盐”和“可药用盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸式或碱式盐而被改性。可药用盐的实例包括但不限于碱性基团(例如胺)的无机酸盐或有机酸盐；和酸性基团(例如羧酸)的碱或有机盐。可药用盐包括由例如无毒性无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒性盐或季铵盐。例如，这样的常规无毒性盐包括来源于无机酸的那些，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸；以及由有机酸制备的盐，所述有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸和羟乙基磺酸等。
21.可药用盐可通过常规化学方法由包含碱性或酸性部分的母体化合物合成。在一些情况下，这样盐可通过使这些化合物的游离酸或游离碱形式与化学计量量的适当的碱或酸在水中或有机溶剂中或在二者的混合物中反应来制备；通常地，非水性介质如醚、乙酸乙
酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适盐的列表见于remington's pharmaceutical sciences,第18版.,mack publishing company,easton,pa.,1990中，其公开内容在此通过引用并入。
22.术语“溶剂合物”意指进一步包含通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的量的溶剂的化合物或其盐。在溶剂是水的情况下，溶剂合物是水合物。
23.此外，在前述和以下实施方案的每一个中，应理解的是，所述式不仅包括和代表所述化合物的所有可药用盐，而且包括所述化合物式或其盐的任何和所有水合物和/或溶剂合物。应理解，在化合物的多种物理形式中，某些官能团，例如羟基、氨基等基团与水和/或多种溶剂形成复合物和/或配位化合物。因此，上式应理解为包含并代表那些多种水合物和/或溶剂合物。在前述和以下实施方案的每一个中，还要理解的是，式无论是单独的还是在任何和所有可能的混合物中都包括并代表每种可能的异构体，例如立体异构体和几何异构体。在前述和以下实施方案的每一个中，还应理解，式包括并代表化合物的任何和所有结晶形式、部分结晶形式和非结晶和/或无定形形式。
24.术语“可药用载体”是本领域公认的，并且是指参与携带或转运任何主题组合物或其组分的可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。在与主题组合物或其组分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可用作可药用载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格液；(19)乙醇；(20)磷酸缓冲溶液；以及(21)药物制剂中采用的其他无毒相容性物质。
25.如本文中所用，术语“施用”包括将本文中所述的化合物和组合物引入患者的所有方式，包括但不限于经口(po)、静脉内(iv)、肌内(im)、皮下(sc)、透皮、吸入、经颊、经眼、舌下、经阴道、经直肠等。本文中所述的化合物和组合物可以以单位剂型和/或含有常规非毒性可药用载体、辅料和载剂的制剂施用。
26.用于经口施用的举例说明性形式包括片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等。用于肠胃外施用的举例说明性途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、硬膜外、尿道内、胸骨内、肌内和皮下，以及任何其它本领域公认的肠胃外施用的途径。
27.肠胃外施用的举例说明性方式包括针(包括微针)注射器、无针注射器和输注技术，以及本领域公认的任何其他肠胃外施用的方式。肠胃外制剂通常是水溶液，其可包含赋形剂(例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选ph为约3至约9)，但对于一些应用，其可更适合配制为无菌非水性溶液或作为干燥形式以与合适的载剂(例如无菌无热原水)联合使用。在无菌条件下肠胃外制剂的制备(例如通过冻干)可使用本领域技术人员公知的标准制药技术容易地完成。化合物的肠胃外施用举例说明性地以盐溶液的形式或将化合物并入到脂质体中的形式进行。在溶解化合物(其本身不能充分溶解)的情况下，可以使用增溶剂(例如乙醇)。
28.所要求组合的每种化合物的剂量取决于数个因素，其包括：施用方法、待治疗的病症、病症的严重性、是否待治疗或预防病症，以及待治疗人的年龄、体重和健康状况。另外，关于特定患者的药物基因组学(基因型对药代动力学、药效学或治疗的效力特征的影响)信息可影响所使用的给药方案。
29.应理解，在本文中所述的方法中，可通过任何合适的方式同期、同时、顺序、分别或在单一药物制剂中施用共施用或组合的单个组分。当共施用的化合物或组合物以单独的剂型施用时，每种化合物每天施用的剂量数可以相同或不同。化合物或组合物可以通过相同或不同的施用途径来施用。化合物或组合物可根据同时或交替的方案在治疗过程期间的相同或不同时间以分开或单一的形式同时施用。
30.本文中使用的术语“治疗有效量”指在组织系统、动物或人中引发生物学或药物响应的活性化合物或药剂的量，其是研究者、兽医、医生或其他临床医师所探寻的，所述生物或药物响应包括减轻所治疗疾病或病症的症状。在一个方面中，治疗有效量为其可以以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗或减轻疾病或疾病症状。然而，应当理解的是，本文中所述化合物和组合物的总日剂量可由主治医师在合理医学判断的范围内决定。用于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括：所治疗的病症和病症的严重程度；所采用特定化合物的活性；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所采用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所采用特定化合物组合或一起使用的药物；以及研究者、兽医、医生或其他普通技术的临床医师公知的类似因素。
31.根据施用途径，本文中考虑了宽范围的容许剂量，包括落入约1μg/kg至约1g/kg范围内的剂量。剂量可以是单一的或分开的，并且可根据广泛多种方案施用，包括q.d.(一天一次)、b.i.d.(一天两次)、t.i.d.(一天三次)，或者甚至每隔一天、一周一次、一月一次、一季度一次等。在这些情况的每一种中，应当理解，本文所述的治疗有效量对应于施用的情况，或者作为替代地对应于每日、每周、每月或每季度的总剂量，如由剂量方案所确定的。
32.除了本文所述的举例说明性剂量和给药方案之外，应理解，本文中所述的任一种化合物或其混合物的有效量可由主治诊断医师或医生通过使用已知技术和/或通过观察在类似情况下获得的结果来确定。在确定有效量或剂量时，主治诊断医师或医生会考虑许多因素，包括但不限于哺乳动物(包括人)的物种、其体型、年龄和一般健康状况、所涉及的具体疾病或病症、疾病或病症的涉及程度或严重性、个体患者的响应、所施用的特定化合物、施用方式、所施用制剂的生物利用度特征、所选择的剂量方案、伴随药物的使用以及其他相关情况。
33.术语“患者”包括人和非人动物，例如伴侣动物(狗和猫等)和牲畜动物。牲畜动物是为食物生产而饲养的动物。待治疗的患者优选为哺乳动物，特别是人。
34.在一些举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，该方法包括将多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)和/或聚谷氨酸(pga)共施用的步骤。
35.在一些举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，该方法包括将多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)和/或聚谷氨酸(pga)共施用的步骤，其中所述方法还包括添加聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸以减弱由所述多黏菌素引起的肺
毒性的步骤。
36.在一些举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)和/或聚谷氨酸(pga)共施用的步骤，其中所述治疗剂用于治疗呼吸系统感染。
37.在一些举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)和/或聚谷氨酸(pga)共施用的步骤，其中所述治疗剂通过吸入来递送。
38.在一些举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)和/或聚谷氨酸(pga)共施用的步骤，其中所述治疗剂是多黏菌素b、多黏菌素e(黏菌素)、多黏菌素样脂肽、或其盐。
39.在一些举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)和/或聚谷氨酸(pga)共施用的步骤，其中所述聚天冬氨酸或聚谷氨酸来自由聚天冬氨酸、聚谷氨酸或它们的盐组成的组。
40.在一些举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)和/或聚谷氨酸(pga)共施用的步骤，其中一种或更多种另外的活性成分被添加至多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)和/或聚谷氨酸(pga)的共施用中。
41.在一些举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)和/或聚谷氨酸(pga)共施用的步骤，其中多黏菌素:聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的摩尔比为约1:1至约1:20。
42.在一些举例说明性实施方案中，本公开内容涉及将聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸与多黏菌素共配制的方法。
43.在一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及如本文中所公开的将聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸与多黏菌素共配制的方法，其中多黏菌素:聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的摩尔比为约1:1至约1:20。
44.在又一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及制备用于雾化多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的溶液或混悬液的方法，该方法包括将多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸溶解或混悬在水性或有机介质中以提供所述药物溶液或混悬液的步骤。
45.在一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及制备用于雾化多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的溶液或混悬液的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸溶解或混悬在水性或有机介质中以提供所述药物溶液或混悬液的步骤，其中所述溶液或混悬液用于吸入。
46.在一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及制备用于雾化多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的溶液或混悬液的方法，该方法包括如本文所公开的将多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸溶解或混悬在水性或有机介质中以提供所述药物溶液或混悬液的步骤，其中所述溶液或混悬液用于通过吸入来治疗呼吸系统感染。
47.在一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及制备用于雾化多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的溶液或混悬液的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸溶解或混悬在水性或有机介质中以提供所述药物溶液或混悬液的步骤，其中所述混合溶液或混悬液包含为约1:1至约1:20的多黏菌素:聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的摩尔比。
48.在一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及制备用于雾化多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的溶液或混悬液的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸溶解或混悬在水性或有机介质中以提供所述药物溶液或混悬液的步骤，其中所述溶液或混悬液包含每毫升约5至300mg摩尔比为约1:1至约1:20的所述多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸。
49.在一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及制备用于雾化多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的溶液或混悬液的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸溶解或混悬在水性或有机介质中以提供所述药物溶液或混悬液的步骤，其中所述溶液或混悬液组合物包含摩尔比约为约1:1至约1:20的多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸。
50.在一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及制备用于雾化多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的溶液或混悬液的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸溶解或混悬在水性或有机介质中以提供所述药物溶液或混悬液的步骤，其中所述多黏菌素选自多黏菌素b、黏菌素或多黏菌素样脂肽。
51.在一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及制备用于雾化多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的溶液或混悬液的方法，该方法包括如本文中所公开的将多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸溶解或混悬在水性或有机介质中以提供所述药物溶液或混悬液的步骤，其中所述聚天冬氨酸或聚谷氨酸来自由聚天冬氨酸、聚谷氨酸、或其盐组成的组。
52.在又一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于制备多黏菌素与聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的干粉组合物的方法。
53.在又一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及如本文中所公开的用于制备多黏菌素与聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的干粉组合物的方法，其中所述干粉用于吸入。
54.在又一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及如本文中所公开的用于制备多黏菌素与聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的干粉组合物的方法，其中所述干粉用于通过吸入来治疗呼吸系统感染。
55.在又一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及如本文中所公开的用于制备多黏菌素与聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的干粉组合物的方法，其中多黏菌素与聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的摩尔比约为约1:1至约1:20。
56.在又一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于制备多黏菌素与聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的干粉组合物的方法，其中所述多黏菌素选自多黏菌素b、黏菌素、多黏菌素样脂肽、或其盐。
57.在又一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于制备多黏菌素与聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的干粉组合物的方法，其中所述聚天冬氨酸或聚谷氨酸来自由聚
天冬氨酸、聚谷氨酸、或其盐组成的组。
58.在又一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及药物组合物，其包含根据如本文中所公开的方法制备的产品连同一种或更多种可药用赋形剂。
59.在又一些另外的举例说明性实施方案中，本公开内容涉及用于治疗患有感染的对象的方法，该方法包括如本文中所公开的施用治疗有效量的药物组合物的步骤。
60.多黏菌素是一组抗生素，并且最常见的是多黏菌素b和多黏菌素e(也称为黏菌素)。黏菌素是抗生素药物，其用作治疗多重药物抗性革兰氏阴性感染(包括肺炎)的最后手段。这些可涉及细菌，例如铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)或鲍氏不动杆菌(acinetobacter baumannii)。该黏菌素以下形式出现：可注射到静脉中或注射到肌肉中或者吸入的形式，称为黏菌素钠，以及施加于皮肤或经口摄取的形式称为硫酸黏菌素。截至2017年，对黏菌素的抗性开始出现。
61.聚天冬氨酸和聚谷氨酸是可生物降解的水溶性聚合物，由于其形成亲水网络的能力而被用于药物的控制释放。
12,13
聚天冬氨酸与dna酶和黏菌素组合可有效降低铜绿假单胞菌感染的生物被膜形成和细菌负荷。
14,15
聚天冬氨酸还可抑制斑马鱼的氧化应激和重金属诱导的毒性。
16
除了由于无毒、生物相容性和非免疫原性特性而在临床试验中表现为用于递送细胞毒性药物的有前途的生物材料之外，最近还报道了聚谷氨酸的浓度和时间依赖性抗微生物作用。
13,17
在此我们已经证明聚天冬氨酸和聚谷氨酸二者都是有效的添加剂，其可以显著降低多黏菌素诱导的肺部毒性。我们还使用喷雾干燥技术开发了用于肺部递送的多黏菌素与聚天冬氨酸的干粉共制剂(co-formulation)，并检测了其理化特性。
62.实验例
63.材料
64.硫酸黏菌素(mw 1407.67)和硫酸多黏菌素b(mw 1441.69)购自betapharma co.ltd(中国江苏省吴江市)。聚天冬氨酸(mw2000至11000)和聚谷氨酸(≥750000)购自sigma aldrich(stlouis，mo，usa)。
65.体外毒性
66.人肺上皮细胞(a549细胞)从美国典型培养物保藏中心(ccl-185
tm
，manassas，va，usa)获得，在补充有10％胎牛血清(fbs)的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中生长和传代培养。将a549细胞(1
×
105个细胞/ml，12孔板)接种于在37℃下在包含5％ co2的湿润气氛中的补充dmem中，直至70％汇合。所有实验以三个重复进行。在存在和不存在聚天冬氨酸(0.25、1.0和5.0mm)的情况下，用1.0mm多黏菌素b处理细胞；并且在用碘化丙锭染色之后在24小时用流式细胞术检测细胞生存力。不同制剂的药物浓度是根据我们之前对人肺上皮细胞中多黏菌素毒性的结果选择的。
18
为了评估聚谷氨酸的保护作用，将a549细胞(0.5
×
105个细胞/ml，200μl/孔)接种在96孔板(#353072，corning，usa)上在37℃下过夜。在存在和不存在聚谷氨酸(2.5、5.0和10.0pm)的情况下，用1.0mm多黏菌素b处理细胞。使用fl自动成像系统(invitrogen；近似荧光激发/发射最大值：535/617nm)在24小时使用碘化丙啶染色来测定细胞生存力。用hoechst 33342(invitrogen；激发和发射波长分别为405和410至551nm)对细胞核进行染色，以允许细胞计数。分析了每种处理条件下包含至少50个细胞的三个随机区域。
67.测定了由多黏菌素b引起的线粒体超氧化物形成的减弱和线粒体膜电位的损失。
18
将a549细胞(0.5
×
105个细胞/ml)在8孔室载玻片(170
±
5μm聚合物盖玻片，ibidi，germany)上于37℃下生长过夜。在存在和不存在聚天冬氨酸(0.25、1.0和5.0mm)的情况下，用1.0mm多黏菌素b处理细胞。为了评估线粒体超氧化物的形成和线粒体膜电位的损失，分别使用mitosox红染料(invitrogen；激发和发射波长分别为514和531至622nm)和tmre(invitrogen；激发和辐射波长分别为561和568至690nm)。用hoechst 33342(invitrogen；激发和发射波长分别为405和410至551nm)对细胞核进行染色，以允许细胞计数。荧光强度通过共聚焦激光扫描显微镜(配备有63
×
油浸物镜的leica sp8倒置显微镜)来定量。使用imagej(45，46)计算每次处理的每个细胞的平均荧光强度。分析每种处理条件下包含至少50个细胞的三个随机区域，并将未处理的对照细胞中的tmre荧光设定为100％。
68.在24小时检测在a549中聚天冬氨酸(0.25、1.0和5.0mm)对多黏菌素b(1.0mm)的细胞摄取的抑制。
19
对于免疫染色，使用小鼠抗多黏菌素b igm mab(在封闭缓冲液中1:500)和与alexa fluor 647缀合的山羊抗小鼠igm(在封闭缓冲液中1:500)。用hoechst 33342(2μg/ml)对细胞核进行染色。使用leica sp8倒置共焦显微镜(leica，wetzlar，germany)用63
×
油浸物镜(数值孔径[na]1.4)进行荧光成像。
[0069]
体内毒性
[0070]
动物研究经莫纳什动物伦理委员会，莫纳什大学(victoria，australia)的批准。所有实验都是根据澳大利亚出于科学目的爱护和使用动物的行为准则进行的。瑞士白化小鼠(雌性；年龄，6周；体重，20至25g)从莫纳什动物研究平台(clayton，victoria，australia)获得。动物设施具有12小时光照和12小时黑暗周期，并且温度和湿度是受控的。动物被单独关在代谢笼中并自由获取食物和水。给小鼠每天三次气管内施用10mg/kg多黏菌素b、120mg/kg聚天冬氨酸以及聚天冬氨酸与多黏菌素b的组合。
[0071]
对肺部进行组织病理学检查以评估多黏菌素b的肺部毒性。在肺部施用后24小时，将小鼠人道处死，并收获肺部并立即固定在福尔马林中。为了避免对肺上皮的任何潜在的人为损伤，没有进行支气管肺泡灌洗和心脏穿刺。采用半定量评分(sqs)系统来量化肺损伤的程度。
20
简言之，我们对肺中组织病理学变化的严重程度和性质使用了以下等级：第0级，无变化或认为是无关紧要的轻微变化；第1级，影响1％至25％面积的微小病变；第2级，影响25％至50％面积的多灶性病变；以及第3级，影响》50％面积的严重组织变化。该等级被赋予以下评分：第0级，0.1；第1级，1；第2级，4；以及第3级，10。对不同水平肺的损伤百分比赋予以下评分：《1％，0；1％至《5％，1；5％至《10％，2；10％至《20％，3；20％至《30％，4；30％至《40％，5；≥40％，6。整个肺组织学评分被确定为等级和损伤百分比评分的乘积。sqs被分配以下评分：sqs 0，无显著变化；sqs+1，轻度损伤；sqs+2，轻度至中度损伤；sqs+3，中度损伤；sqs+4，中度至重度损伤；以及sqs+5，重度损伤。
[0072]
喷雾干燥
[0073]
使用具有标准双流体喷嘴的buchi b-290小型喷雾干燥器(buchi labortechnik ag，flawil，switzerland)通过喷雾干燥(spray drying，sd)聚天冬氨酸(paa)和黏菌素(col)的单一纯组分制剂或组合制剂的水溶液(20mg/ml总固体)来制备喷雾干燥制剂(表1)。喷雾干燥以2ml/分钟的进料速率进行，其中入口空气温度(tin)为120
±
5℃，吸气器为40kg/小时(100％)，以及雾化空气压力为60mm hg。含有聚天冬氨酸的喷雾干燥产品储存在-20℃的冰箱中，而喷雾干燥的纯黏菌素储存在含有硅胶的干燥器中以在20
±
2℃下维持
20
±
2％rh。
[0074]
表1喷雾干燥制剂的组合物
[0075][0076]
颗粒尺寸分布(particle size distribution，psd)
[0077]
新鲜制剂的psd使用配备有aero-s用于干粉分散的mastersizer 3000(malvern instruments，worcestershire，uk)测定。该仪器基于激光衍射技术，并因此提供颗粒尺寸的体积分布。将粉末样品送入到分散系统进行分析。使用三个独立的重复测量每个制剂。获得平均百分位数直径d10、d50和d90，并用于表征颗粒尺寸分布。使用“跨度”来确定分布的宽度，该跨度计算为(d90至d10)与d50的比率。较小的跨度值代表较窄的颗粒尺寸分布。
[0078]
扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，sem)
[0079]
通过sem(nova nanosem，fei company，hillsboro，oregon，usa)检查样品的颗粒形态。粉末样品分散在安装有黏性碳带的样品台上。使用加压空气除去重叠的颗粒，并随后使用溅射涂布机(208hr，cressington sputter coater，england，uk)用薄铂膜涂覆。然后将涂覆的样品安装在sem镜台上并观察。
[0080]
粉末x射线衍射(powder x-ray diffraction，pxrd)
[0081]
具有cu-kα辐射源的rigaku smartlab
tm
衍射仪(rigaku americas，the woodlands，tx)用于评价粉末结晶度。在2θ4至40
°
和4
°
/分钟的扫描速度下记录衍射图案。辐射源在40kv电压和44ma电流下工作。
[0082]
体外气溶胶化性能
[0083]
下一代冲击器(next-generation impactor，ngi)用于测定黏菌素-聚天冬氨酸制剂的体外气溶胶化性能(ngi，copley，nottingham，uk)。将粉末样品(10
±
1mg)装入3号hpmc
胶囊(qualicaps，whitsett，nc)。将填充的胶囊装入低电阻rs01 dpi装置(plastiape s.p.a.，osnago，italy)中并穿孔。在将装置与ngi组件连接之后，通过以100l/分钟运行2.4秒的真空泵吸入四升空气通过吸入器。这对应于rs01 dpi装置的压力下降约4kpa。对于每个重复，通过装载四个10mg胶囊来分散四个胶囊。对每种制剂进行四次重复分析。通过用水洗涤从胶囊、装置、ngi喉部和不同的ngi阶段来收集分散的粉末。使用hplc分析药物含量以确定从每个位置收集的黏菌素的量。发射剂量(ed)测量为从装置中释放的药物的百分比。细颗粒级分(fine particle fraction，fpf)计算为空气动力学直径《5μm的颗粒中存在的药物百分比。最后，空气动力学尺寸低于5μm的排放颗粒百分比(也称为排放fpf(e-fpf))由ed和fpf计算得出。
[0084]
黏菌素的分析方法
[0085]
黏菌素的浓度通过已建立的高效液相色谱(hplc)方法进行测量，该方法在此简要描述。使用agilent 1260hplc系统(agilent technologies，santa clara，ca)和eclipse plus c18柱(5μm，150
×
4.6mm，agilent，waldbronn，germany)。以1.0ml/分钟的等度流速泵送由76％(v/v)30mm硫酸钠溶液(用h3po4调节至ph 2.5)和24％(v/v)乙腈构成的流动相。进样体积为30μl，并且色谱柱在室温(约21℃)下运行。在214nm波长处检测黏菌素。
[0086]
统计学分析
[0087]
结果表示为平均值
±
标准偏差(sd)，并进行方差分析(anova)测试用于多种制剂的统计学比较。
[0088]
结果
[0089]
在体外和体内多黏菌素诱导的肺毒性的减弱
[0090]
在a549细胞中聚天冬氨酸和聚谷氨酸二者均以浓度依赖性方式显著减弱多黏菌素b诱导的毒性(图1a至e)。在用1.0mm多黏菌素b处理24小时的情况下，细胞生存力降低至36.7
±
5.1％，当分别用1.0mm和5.0mm的聚天冬氨酸预处理细胞45分钟时，细胞生存力显著提高至65.2
±
4.5％(p《0.0001)和75.7
±
4.7％(p《0.0001)(图1a)。类似地，在1.0mm多黏菌素b处理之后，在24小时细胞生存力为51.7
±
5.2％，在用2.5pm、5.0pm和10.0pm的多聚谷氨酸分别预处理45分钟后，细胞生存力提高至83.87
±
3.1％(p《0.0001)、95.33
±
1.5％(p《0.0001)和95.77
±
1.5％(p《0.0001)(图1b)。
[0091]
在24小时，单独用1.0mm多黏菌素b处理的a549细胞中的mitosox荧光强度与对照相比为》200倍高(p《0.0001)(图1c)。当用1.0mm和5.0mm聚天冬氨酸同时处理时，与对照组相比，由1.0mm多黏菌素b诱导的氧化应激分别降低了37倍(p《0.0001)和3.7倍(p《0.0001)。聚天冬氨酸(0.25mm)也在一定程度上降低了多黏菌素诱导的氧化应激，但没有统计学意义(p》0.05)。与对照组相比，在用1.0mm多黏菌素b处理之后，a549细胞中的线粒体膜电位降低至《50％(49.5
±
7.2％)，但当同时用1.0mm和5.0mm聚天冬氨酸分别处理时，线粒体膜电位显著提高至83.3
±
4.8％(p《0.05)和103.5
±
22.6％(p《0.001)(图1d)。
[0092]
此外，a549细胞中多黏菌素b的免疫荧光强度表明，在存在1.0和5.0mm聚天冬氨酸的情况下，多黏菌素b的胞内摄取分别抑制了》2倍(p《0.001)和》9倍(p《0.0001)(图1e)。
[0093]
组织学数据证实，聚天冬氨酸显著降低了在体内多黏菌素b诱导的肺毒性(p****《0.0001)(图2a和2b)。对照组(0.9％盐水)未显示出宏观和微观的病变(sqs：0)；10mg/kg多黏菌素b未显示出宏观的病变，但显示出影响25％至50％面积的严重组织损伤(sqs：+2至+
5)；120mg/kg聚天冬氨酸显示出极小至轻度损害，影响《25％的轻度局灶性肺泡内出血面积(sqs：+1)；而该组合显示出组织的血管周围炎症的最小损害(sqs：+1)(图2b)。在多黏菌素b处理组中，肺损伤的总体半定量评分(sqs)为3.0
±
1.4，在共施用聚天冬氨酸的情况下，该评分降至0.75
±
0.5(n＝4)(图2a)。
[0094]
颗粒形态和尺寸分布
[0095]
图3示出了黏菌素(col)和聚天冬氨酸(paa)的喷雾干燥纯制剂和组合制剂的代表性扫描电子显微镜(sem)图像。喷雾干燥的(sd)黏菌素颗粒形成微凹的球体或带有裂缝或孔的中空光滑壳。具有较高比例的黏菌素-5:1col-paa-的制剂在形态特征和种类上与纯sd col相似。具有较高比例的paa(1:1和1:5的col-paa二者)的制剂显示出具有高度褶皱表面的球状颗粒。纯sd paa显示出光滑的球形颗粒，它们融合在一起以形成大的团簇。这些颗粒还在其表面具有发纹裂纹，这可能是由于成像过程中的充电造成的。
[0096]
在表2中汇总了不同制剂的颗粒尺寸分布。对于纯sd col和所有组合制剂，约80％的颗粒位于1至5μm之间。这表明颗粒处于用作干粉吸入器的最佳尺寸范围内
21
。纯sd paa显示出非常高的d
90
(329μm)，而其d
10
和d
50
值类似于另一些制剂的值。这表明由微米级颗粒形成了大的聚集体，这也由sem图像示出。
[0097]
表2.不同喷雾干燥制剂的颗粒尺寸分布汇总
[0098][0099]
结晶度
[0100]
纯制剂和组合制剂的粉末x射线衍射图在图4中示出。所有制剂都没有结晶度峰，这表明它们是无定形的。
[0101]
体外气溶胶化性能
[0102]
图5和图6显示了不同col-paa喷雾干燥制剂的细颗粒级分(fpf)、排放剂量(ed)、排放fpf(e-fpf)和ngi沉积谱。纯黏菌素和所有组合(5:1、1:1和1:5)显示出ed值在88％至93％的范围内。所有制剂的ed值相似。在另一方面，相对于纯黏菌素和另一些组合，观察到5:1col-paa制剂的fpf显著较低，为71％。这种趋势反映在e-fpf值中，其中纯黏菌素、5:1和1:1共制剂达到接近90％，而1:5col-paa仅得分80％。尽管不显著，但当比较纯黏菌素(按wt.计0％paa)、5:1(50％paa)和1:1col-paa(84％paa)组合时，ed、fpf和e-fpf值随着paa在制剂中的比例提高而略有提高。
[0103]
结论.我们已经发现，聚天冬氨酸和聚谷氨酸以剂量依赖的方式抑制多黏菌素在人肺上皮细胞中诱导的毒性(包括细胞死亡、线粒体超氧化物的产生和线粒体膜电位的损
失)。聚天冬氨酸的共施用显著减轻由多黏菌素在小鼠中诱导的肺毒性。黏菌素和聚天冬氨酸组合的所有干粉制剂都具有可吸入的颗粒尺寸分布和无定形固体形式。与另一些制剂相比，含有约96％聚天冬氨酸(w/w)的1:5col-paa制剂显示出较差的分散性，具有显著较低的fpf(71％)和e-fpf值(约80％)。组合制剂5:1和1:1col-paa显示出优异的细颗粒级分(》80％)和发射剂量(》90％)值，并且与纯sd col的值相似。我们的数据表明，在制剂中添加黏菌素改善了fpf。
[0104]
本领域技术人员将认识到可以对上述具体实施方式进行多种修改。实施方式不应限于所描述的特定限制。其他实施方式也是可能的。
[0105]
尽管已经在附图和前述中详细举例说明和描述了该发明，但是该发明应被认为在特征方面是举例说明性的而不是限制性的，应理解，仅示出和描述了一些优选实施方案，并且期望保护在该发明的精神之内的所有改变方案和修改方案。旨在本方法和装置的范围由所附权利要求书限定。然而，必须理解，在不脱离本公开内容的精神或范围的情况下，本公开内容可以以不同于具体解释和举例说明的方式来实践。本领域的技术人员应理解，在不脱离如所附权利要求书中限定的精神和范围的情况下，本文中所述的一些实施方案的多种替代可用于实践本权利要求。
[0106]
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技术特征：
1.用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，其包括将多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)、聚谷氨酸(pga)、paa和pga的组合、或其可药用盐共施用的步骤。2.根据权利要求1所述的用于降低多黏菌素的毒性的方法，其还包括添加聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸以减弱由所述多黏菌素引起的肺毒性的步骤。3.根据权利要求1所述的用于降低多黏菌素的毒性的方法，其中所述治疗剂用于治疗呼吸系统感染。4.根据权利要求1所述的用于降低多黏菌素的毒性的方法，其中所述治疗剂通过吸入来递送。5.根据权利要求1所述的用于降低多黏菌素的毒性的方法，其中所述治疗剂是多黏菌素b、多黏菌素e(黏菌素)、多黏菌素样脂肽或它们的盐。6.根据权利要求1所述的用于降低多黏菌素的毒性的方法，其中所述聚天冬氨酸或聚谷氨酸来自由聚天冬氨酸、聚谷氨酸或它们的盐组成的组。7.根据权利要求1所述的用于降低多黏菌素的毒性的方法，其中另外一种或更多种活性成分被添加至多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)、聚谷氨酸(pga)、paa或pga的组合、或其可药用盐的共施用中。8.根据权利要求1所述的用于降低多黏菌素毒性的方法，其中多黏菌素:聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的摩尔比为约1:1至约1:20。9.用于将聚天冬氨酸(paa)、聚谷氨酸(pga)、paa和pga的组合、或其可药用盐与多黏菌素一起共配制的方法。10.根据权利要求9所述的用于将聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸与多黏菌素共配制的方法，其中多黏菌素:聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的摩尔比为约1:1至约1:20。11.制备用于雾化多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的溶液或混悬液的方法，所述方法包括将多黏菌素和聚天冬氨酸(paa)、聚谷氨酸(pga)、paa和pga的组合、或其可药用盐溶解或混悬在水性或有机介质中以提供所述药物溶液或混悬液的步骤。12.权利要求11所述的方法，其中所述溶液或混悬液用于吸入。13.权利要求11所述的方法，其中所述溶液或混悬液用于通过吸入来治疗呼吸系统感染。14.权利要求11所述的方法，其中所述混合的溶液或混悬液包含约1:1至约1:20的多黏菌素:聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的摩尔比。15.权利要求11所述的方法，其中所述溶液或混悬液包含每毫升约5至300mg的摩尔比为约1:1至约1:20的所述多黏菌素和聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸。16.根据权利要求11至15所述的溶液或混悬液组合物，其中多黏菌素与聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的摩尔比约为约1:1至约1:20。17.根据权利要求11至15所述的溶液或混悬液组合物，其中所述多黏菌素选自多黏菌素b、黏菌素或多黏菌素样脂肽。18.根据权利要求11至15所述的溶液或混悬液组合物，其中所述聚天冬氨酸或聚谷氨酸来自由聚天冬氨酸(paa)、聚谷氨酸(pga)、paa和pga的组合、或其可药用盐组成的组。19.用于制备多黏菌素与聚天冬氨酸(paa)、聚谷氨酸(pga)、paa和pga的组合、或其可药用盐的干粉组合物的方法。
20.权利要求19所述的方法，其中所述干粉用于吸入。21.权利要求19所述的方法，其中所述干粉用于通过吸入来治疗呼吸系统感染。22.根据权利要求19至21所述的干粉组合物，其中多黏菌素与聚天冬氨酸和/或聚谷氨酸的摩尔比约为约1:1至约1:20。23.根据权利要求19至21所述的干粉组合物，其中所述多黏菌素选自多黏菌素b、黏菌素、多黏菌素样脂肽、或其可药用盐。24.根据权利要求19至21所述的干粉组合物，其中所述聚天冬氨酸或聚谷氨酸来自由聚天冬氨酸(paa)、聚谷氨酸(pga)、paa和pga的组合、或其可药用盐组成的组。25.药物组合物，其包含根据权利要求9至24所述的方法制备的产品连同一种或更多种可药用赋形剂。26.用于治疗患有感染的对象的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求9至25所述的药物组合物的步骤。

技术总结
本公开内容一般地涉及：用于降低多黏菌素作为治疗剂的毒性的方法，该方法包括共施用氨基糖苷类的步骤；用于改善氨基糖苷类气溶胶化的方法，该方法包括将制剂与多黏菌素组合的步骤；以及用于制备包含多黏菌素和氨基糖苷类的干粉组合物的方法。治疗肺部感染的药物组合物和方法在本发明的范围内。和方法在本发明的范围内。和方法在本发明的范围内。


技术研发人员：周琪 麦兹巴哈
受保护的技术使用者：普渡研究基金会
技术研发日：2021.10.27
技术公布日：2023/9/14