一种高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体及其对映体杂质的方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体及其对映体杂质的方法。


背景技术：

2.乌布吉泮（ubrogepant）是由美国默克公司研发的一款治疗偏头痛的口服药，其作用机制是降钙素基因相关肽受体拮抗剂，该药物于2019年在美国上市。其结构式如下：。
3.乌布吉泮中间体是对硝基苯甲酸盐形式存在，有明显的碱性基团，化合物中有3个手性中心，对映体分离较差，在方法开发中存在一定挑战。目前暂无文献报道乌布吉泮中间体(i)及其对映体杂质(ii)和非对映体杂质的分析方法。乌布吉泮中间体(i)及其对映体杂质(ii)结构式如下： 。


技术实现要素：

4.本发明提供一种高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法：,
5.1）色谱条件：色谱柱chiralcel oj-rh，采用多糖衍生物涂敷型硅胶为填充剂；采用磷酸氢二铵缓冲溶液为流动相a，乙腈-甲醇为流动相b；检测波长为205 nm～215 nm；柱温为20～25 ℃；流动相流速为0.3～0.7 ml/min；2）供试品溶液的配制：将样品用70%乙腈水溶解；3）测定：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
6.本方法所述流动相a中磷酸氢二铵的浓度为10～30 mmol/l。
7.本方法所述流动相b中乙腈 ∶甲醇的比例为30～40∶70～60。
8.本方法所述流动相b中乙腈∶甲醇的比例为30∶70或40∶60。
9.本方法所述流动相a∶流动相b的比例为60～55∶40～45。
10.本方法所述流动相a ∶流动相b的比例为60∶40或55∶45。
11.本方法所述流动相流速为0.4～0.6 ml/min。
12.本方法所述检测波长为210 nm。
13.本方法所述柱温为22～25 ℃。
14.本方法所述色谱柱为chiralcel oj-rh， 4.6
×
150 mm，5 μm。
15.分离度，用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标，用r表示，r等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。r越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当r＜1.0时，两峰有部分重叠，当r＝1.0时，分离度可达98%，当r＝1.5时，分离度可达99.7%。
16.本发明提供的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体(i)及其对映体杂质(ii)的方法可实现乌布吉泮中间体(i)与其对映体杂质(ii)的分离度r ≥ 1.6，供试品溶液连续进样6次对映体杂质含量rsd ≤ 1.2%，进样重复性良好，方法耐用性好，可用于乌布吉泮中间体(i)的质量控制。
附图说明
17.图1、实施例2方法专属性实验-空白溶液。
18.图2、实施例2方法专属性实验-对硝基苯甲酸定位。
19.图3、实施例2方法专属性实验-系统适用性溶液。
20.图4、实施例2方法专属性实验-供试品溶液。
具体实施方式
21.实施例1：色谱条件的筛选通过色谱柱、流动相、波长、流速等进行筛选确定色谱条件。
22.实施例1-a
23.色谱柱：大赛璐od-h 4.6
×
250 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a：正己烷；流动相b：0.4%正丁胺乙醇；按照以下条件进行梯度洗脱；
24.结论：采用碱性体系和大赛璐od-h色谱柱，对硝基苯甲酸出峰较晚，基线较差，有干扰。
25.实施例1-b尝试使用反向体系；色谱柱：大赛璐id 4.6
×
250 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为乙腈；流动相b为20 mmol/l六氟磷酸钾ph 2.0；采用流动相a∶流动相b＝30∶70，按照0 min、60 min等度洗脱；结论：乌布吉泮中间体(i)、对映体杂质(ii)及对硝基苯甲酸未完全分离。
26.实施例1-c尝试在实施例1-b的基础上，更换色谱柱大赛璐od-rh色谱柱：大赛璐od-rh 4.6
×
150 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为乙腈∶甲醇＝70∶30；流动相b为20 mmol/l六氟磷酸钾ph 2.0；采用流动相a∶流动相b ＝30∶70；按照0 min、40 min等度洗脱；结论：在实施例1-b基础上调整色谱柱，乌布吉泮中间体(i)及对映体杂质(ii)出峰较早，且完全重合。
27.实施例1-d尝试在实施例1-c的基础上，更换色谱柱大赛璐ay-rh；色谱柱：大赛璐ay-rh 4.6
×
150 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为乙腈∶甲醇＝40∶60；流动相b为20 mmol/l碳酸氢铵；采用流动相a∶流动相b ＝40∶60，按照0 min、30 min等度洗脱；结论：采用大赛璐ay-rh，乌布吉泮中间体(i)及对映体杂质(ii)未完全分离，峰型变差且响应变低。
28.实施例1-e尝试在实施例1-d的基础上，更换色谱柱大赛璐as-rh；色谱柱：大赛璐as-rh 4.6
×
150 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为乙腈∶甲醇＝40∶60；
流动相b为20 mmol/l碳酸氢铵；采用流动相a∶流动相b ＝40∶60，按照0 min、30 min等度洗脱；结论：在实施例1-d基础上调整色谱柱，乌布吉泮中间体(i)及对映体杂质(ii)完全重合且峰型较差。
29.实施例1-f尝试在实施例1-e的基础上，更换色谱柱chiralcel oj-rh；色谱柱：chiralcel oj-rh 4.6
×
150 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为乙腈∶甲醇＝70∶30；流动相b为20 mmol/l六氟磷酸钾ph 2.0；采用流动相a∶流动相b＝30∶70，按照0 min、60 min等度洗脱；结论：采用有机相乙腈∶甲醇＝70∶30，乌布吉泮中间体(i)及对映体杂质(ii)分离度有所改善，但未完全分离。
30.实施例1-g尝试在实施例1-f的基础上，将流动相a变更为乙腈∶甲醇＝60∶40；色谱柱：chiralcel oj-rh 150
×
4.6 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为乙腈∶甲醇＝60∶40；流动相b为20 mmol/l六氟磷酸钾ph 2.0；采用流动相a∶流动相b＝30∶70，按照0 min、60 min等度洗脱；结论：采用流动相a为乙腈∶甲醇＝60∶40，乌布吉泮中间体(i)及对映体杂质(ii)分离无明显改善。
31.实施例1-h尝试在实施例1-g的基础上，将流动相b变更为20 mmol/l碳酸氢铵；色谱柱：chiralcel oj-rh 4.6
×
150 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为乙腈∶甲醇＝60∶40；流动相b为20 mmol/l碳酸氢铵；采用流动相a∶流动相b =40∶60，按照0 min、60 min等度洗脱；结论：采用20 mmol/l碳酸氢铵，乌布吉泮中间体(i)及对映体杂质(ii)分离度为0.88，未完全分离。
32.实施例1-i尝试在实施例1-h的基础上，将流动相b变更为20 mmol/l磷酸氢二铵；色谱柱：chiralcel oj-rh 150
×
4.6 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为乙腈∶甲醇＝40∶60；流动相b为20 mmol/l磷酸氢二铵；采用流动相a∶流动相b ＝45∶55，按照0 min、40 min等度洗脱；结论：采用20 mmol/l磷酸氢二铵，乌布吉泮中间体(i)及对映体杂质(ii)分离度
为1.89，完全分离，峰型较好，空白处无干扰。
33.实施例2：方法专属性【步骤1】流动相的配制：流动相a：20 mmol/l磷酸氢二铵缓冲溶液的配制：称取磷酸氢二铵 2.64 g，加水至1000 ml溶解制得。
34.流动相b：乙腈∶甲醇＝40∶60：依次量取乙腈400 ml，甲醇600 ml置1l烧杯中，搅拌混匀，超声备用。
35.【步骤2】溶液配制：将乌布吉泮中间体(i)样品、对硝基苯甲酸样品及系统适用性溶液分别用70%乙腈溶解，浓度为5.0 mg/ml。
36.色谱条件如下：色谱柱：chiralcel
®ꢀ
oj-rh，150
×
4.6 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为20 mmol/l磷酸氢二铵缓冲溶液流动相b为乙腈∶甲醇＝40∶60采用流动相a∶流动相b =55∶45，按照0 min、40 min等度洗脱；结果：乌布吉泮中间体(i)保留时间：15.152 min；对映体杂质(ii)保留时间：13.577 min；对硝基苯甲酸保留时间：3.5 min。
37.本发明方法能实现乌布吉泮中间体(i)、对映体杂质(ii)和对硝基苯甲酸的完全分离，方法专属性好。
38.实施例3：重复性实验取6份供试品溶液，连续进样，记录色谱图，结果如下：（1）对映体杂质(ii)保留时间：13.589 min；峰面积：1.3263；对映体含量：0.10%；乌布吉泮中间体(i)保留时间：15.118 min；（2）对映体杂质(ii)保留时间：13.582 min；峰面积：1.3208；对映体含量：0.10%；乌布吉泮中间体(i)保留时间：15.111 min；（3）对映体杂质(ii)保留时间：13.581 min；峰面积：1.3160；对映体含量：0.10%；乌布吉泮中间体(i)保留时间：15.109 min；（4）对映体杂质(ii)保留时间：13.572 min；峰面积：1.3406；对映体含量：0.10%；乌布吉泮中间体(i)保留时间：15.103 min；（5）对映体杂质(ii)保留时间：13.576 min；峰面积：1.3403；对映体含量：0.10%；乌布吉泮中间体(i)保留时间：15.112 min；（6）对映体杂质(ii)保留时间：13.568 min；峰面积：1.3218；对映体含量：0.10%；乌布吉泮中间体(i)保留时间：15.101 min；重复性实验结果显示：6份供试品溶液连续进样，乌布吉泮中间体(i)保留时间、对映体杂质(ii)保留时间及含量rsd分别为0.04%、0.06%、1.11%，远低于2.0%，实验方法重复性好。
39.实施例4：耐用性实验通过将色谱条件的流速、流动相浓度、流动相比例、柱温等进行调整，测定结果不
受影响的承受程度。
40.实施例4-a、不同流速耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：chiralcel
®ꢀ
oj-rh，150
×
4.6 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.3～0.7 ml/min；流动相a为20 mmol/l磷酸氢二铵缓冲溶液流动相b为乙腈∶甲醇＝40∶60采用流动相a∶流动相b ＝55∶45，按照0 min、40 min等度洗脱；结果如下：（1）流速为0.3 ml/min，分离度为1.98；（2）流速为0.5 ml/min，分离度为1.75；（3）流速为0.7 ml/min，分离度为1.65；耐用性不同流速的测试结果显示：本测试方法在流速0.3 ml/min及0.7 ml/min之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
41.实施例4-b、不同流动相中缓冲盐浓度耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：chiralcel
®ꢀ
oj-rh，150
×
4.6 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为10～30 mmol/l磷酸氢二铵缓冲溶液流动相b为乙腈∶甲醇＝40∶60采用流动相a∶流动相b ＝55∶45，按照0 min、40 min等度洗脱；结果如下：（1）磷酸氢二铵缓冲溶液浓度为10 mmol/l，分离度为1.79；（2）磷酸氢二铵缓冲溶液浓度为20 mmol/l，分离度为1.75；（3）磷酸氢二铵缓冲溶液浓度为30 mmol/l，分离度为1.78；耐用性不同流动相浓度的测试结果显示：本测试方法流动相磷酸氢二铵缓冲溶液浓度在10 mmol/l及30 mmol/l之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
42.实施例4-c、不同流动相起始比例耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：chiralcel
®ꢀ
oj-rh，150
×
4.6 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为20 mmol/l磷酸氢二铵缓冲溶液；流动相b为乙腈∶甲醇＝40∶60；采用流动相a∶流动相b ＝60～55∶40～45，按照0 min、40 min等度洗脱；结果如下：（1）流动相a∶流动相b=60∶40，分离度为2.12；（2）流动相a∶流动相b=55∶45，分离度为1.75；耐用性不同流动相起始比例的测试结果显示：本测试方法的流动相a和流动相b的起始比例在60∶40及55∶45之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
43.实施例4-d、不同柱温耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：chiralcel
®ꢀ
oj-rh，150
×
4.6 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温：20～25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为20 mmol/l磷酸氢二铵缓冲溶液流动相b为乙腈∶甲醇＝40∶60；采用流动相a∶流动相b＝55∶45，按照0 min、40 min等度洗脱；结果如下：（1）柱温为20 ℃，分离度为1.76；（2）柱温为25 ℃，分离度为1.75。
44.耐用性不同柱温的测试结果显示：本测试方法在柱温20 ℃及25 ℃之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
45.实施例4-e、不同检测波长耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：chiralcel
®ꢀ
oj-rh，150
×
4.6 mm，5 μm；检测波长：205 nm～215 nm；柱温： 25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为20 mmol/l磷酸氢二铵缓冲溶液流动相b为乙腈∶甲醇＝40∶60采用流动相a∶流动相b ＝55∶45，按照0 min、40 min等度洗脱；结果如下：（1）检测波长为205 nm，分离度为1.75；（2）检测波长为210 nm，分离度为1.75；（3）检测波长为215 nm，分离度为1.75；耐用性不同检测波长的测试结果显示：本测试方法在检测波长205 nm及215 nm之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
46.实施例4-f、流动相b中乙腈与甲醇比例耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：chiralcel
®ꢀ
oj-rh，150
×
4.6 mm，5 μm；检测波长：210 nm；柱温： 25 ℃；进样量：5 μl；流速：0.5 ml/min；流动相a为20 mmol/l磷酸氢二铵缓冲溶液；流动相b为乙腈∶甲醇＝30～40∶70～60；采用流动相a∶流动相b ＝55∶45，按照0 min、40 min等度洗脱结果如下：（1）流动相b中乙腈∶甲醇＝30∶70，分离度为2.16；（2）流动相b中乙腈∶甲醇＝40∶60，分离度为1.75；耐用性不同乙腈与甲醇比例的测试结果显示：本测试方法在乙腈∶甲醇＝30∶70及乙腈∶甲醇＝40∶60之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。

技术特征：
1. 一种高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii) 的方法，其特征在于：，1）色谱条件：色谱柱chiralcel oj-rh，采用多糖衍生物涂敷型硅胶为填充剂；采用磷酸氢二铵缓冲溶液为流动相a，乙腈-甲醇为流动相b；检测波长为205～215 nm；柱温为20～25 ℃；流动相流速为0.3～0.7 ml/min；2）供试品溶液的配制：将样品用70%乙腈水溶解；3）测定：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。2. 根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法，其特征在于：所述流动相a中磷酸氢二铵的浓度为10～30 mmol/l。3. 根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法，其特征在于：所述流动相b中乙腈∶甲醇的比例为30～40 ∶70～60。4. 根据权利要求3所述的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法，其特征在于：所述流动相b中乙腈∶甲醇的比例为30∶70或40∶60。5. 根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法，其特征在于：所述流动相a∶流动相b的比例为60～55∶40～45。6. 根据权利要求5所述的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法，其特征在于：所述流动相a∶流动相b的比例为60∶40或55∶45。7. 根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法，其特征在于：所述流动相流速为0.4～0.6 ml/min。8. 根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法，其特征在于：所述检测波长为210 nm。9. 根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法，其特征在于：所述柱温为22～25 ℃。10. 根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体 (i) 及其对映体杂质 (ii)的方法，其特征在于：所述色谱柱为chiralcel oj-rh， 4.6
×
150 mm，5 μm。

技术总结
本发明涉及一种高效液相色谱法检测乌布吉泮中间体及其对映体杂质的方法，该方法色谱柱CHIRALCEL OJ-RH，4.6


技术研发人员：王丽委 何仁霖 梁兆娟 周西朋 刘永强 龚彦春
受保护的技术使用者：南京威凯尔生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/9/14