一种杂环类免疫抑制剂及其制备方法和应用

1.本发明属于医药化学领域，涉及一种治疗vista信号通路相关的疾病的杂环类化合物，具体涉及一种杂环类免疫抑制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肿瘤免疫治疗是一种利用患者自身免疫系统识别和消灭肿瘤细胞的治疗方法，近年来已经成为肿瘤治疗领域的重要进展。肿瘤免疫治疗的主要策略之一是靶向免疫检查点蛋白，这些蛋白是一类调节免疫反应的分子，它们可以在免疫细胞表面或肿瘤细胞表面发挥作用，通过与相应的配体或受体结合，抑制或促进t细胞的活化和功能。目前已经有多种靶向免疫检查点蛋白的抗体药物获得临床批准或处于临床试验阶段，例如靶向ctla-4、pd-1或pd-l1的单克隆抗体。这些药物已经显示出对多种实体肿瘤和血液肿瘤的显著治疗效果，提高了患者的生存率和生活质量。
3.vista是一种新发现的免疫检查点蛋白，属于b7家族分子，与pd-l1具有同源性。vista广泛表达在髓系和淋巴细胞上，可以通过t-细胞内/外机制抑制t细胞的活化和功能，从而导致免疫耐受和免疫抑制。
4.近年来，针对vista的肿瘤免疫治疗研究取得了一些进展。动物模型研究表明，vista基因敲除或抗体阻断可以增强抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长和转移，同时增加肿瘤浸润性t细胞的数量和功能。但是，目前用于抑制vista蛋白活性的物质大部分活性低，没有明确的构效关系研究，因此迫切需要新抑制剂的相关研究。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一系列新颖的小分子化合物，它们可以特异性地结合并抑制vista蛋白的活性，从而增强t细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。这些化合物具有优良的药理学特性，可作为免疫检查点抑制剂用于肿瘤等疾病的免疫治疗。本发明申请还提供了这些化合物的制备方法。
6.技术方案：本发明所述的通式如下式（i）所示的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体：（i）；其中，环a选自或；
x1选自n、o、s；r1和r2分别选自h、羟基、氨基、甲氧基、吗啉基、c
1-c4烷基或环烷基、x取代的c
1-c4烷基、苯基；所述x选自卤素、羟基、羧基、氨基、酰胺基；当r1苯基，r2为甲基时，a环仅选自；
7.r3选自：；t是0、1、2、3或4；r4选自h或c
1-c3烷基；r5选自h或c
1-c4烷基；r6选自h或c
1-c4烷基；r7选自h或c
1-c4烷基；优选的，x1选自n；r1和r2分别选自h、羟基、甲氧基、吗啉基、c
1-c4烷基、苯基；优选的，所述化合物选自以下化合物：所述化合物选自以下化合物：
。
8.本发明中所涉化合物的制备可参照实施例中的方法进行，特别的，当所述式（i）化
合物中的x1为n，环a为时，所述化合物的合成路线如下式：。
9.其中，r1、r2、r3与所述式（i）中的定义一致，具体合成步骤如下：（1）化合物c1和甲醇钠作用反应生成c2；（2）化合物c2经还原剂还原，得到化合物c3；（3）化合物c3与氯化亚砜、二氯甲烷发生卤化反应，得到化合物c4；（4）化合物c4与hnr3在碱性条件下，反应生成终产物c5；（5）化合物c5在酸性条件下发生取代反应，得到化合物ia。
10.本发明还提供了所述杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在制备具有免疫检查点抑制剂中的应用。
11.本发明还提供了所述杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在制备具有vista抑制活性的抑制剂中的应用。
12.本发明所述的抑制剂治疗的疾病包括自身免疫性疾病、癌症或感染性疾病；所述的癌症选自肺癌、黑色素瘤、血液肿瘤、神经胶质肉瘤、消化系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、神经系统肿瘤、泌尿系肿瘤、皮肤癌；所述的感染性疾病选自细菌及病毒感染；所述的自身免疫性疾病选自器官特异性以及系统性自身免疫病。
13.本发明还提供了一种用于肿瘤免疫治疗的药物组合物，其中含有如本发明所述的治疗有效量的式（i）所示化合物或其药学上可接受的盐、互变及立体异构体、消旋体、代谢产物、代谢前体、前药或溶剂化物作为活性成分和药学上可接受的载体。可任意混合的载体根据剂型、给药形式等可以改变。载体的例子包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂和甜味剂等。所述药物组合物可以是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂和贴剂等制剂学上常规的制剂形式。
dmso-d6) δ 6.89 (s, 1h), 5.72 (t, j = 5.7 hz, 1h), 4.46 (d, j = 5.7 hz, 2h), 3.94 (s, 3h). ms(esi)：m/z 175.1 [m+h]
+
。
[0021]
3、化合物m-4-1的合成：将m-3-1（5.24 g，30 mmol）加入到单口茄型瓶中，加入二氯甲烷60 ml，冰浴，缓慢滴加30 ml氯化亚砜，室温反应3 h，期间用tlc板监测反应进程。待m-3-1反应完全，减压浓缩，通过快速硅胶柱层析纯化得到m-4-1（5.56 g，产率96.0%），白色固体。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 7.11 (s, 1h), 4.70 (s, 2h), 3.96 (s, 3h). ms(esi)：m/z 193.1 [m+h]
+
。
[0022]
4、化合物m-5-1的合成：将m-4-1（4.8 g，25 mmol）、乙醇胺（2.29 g，37.5 mmol）、dipea（4.837 g，37.5 mmol）加入到单口瓶中，加入dmf 75 ml，40℃反应8 h，期间用tlc板监测反应进程。待m-4-1反应完全后，向反应液中加入水和乙酸乙酯各250 ml，萃取3次，合并有机相。减压浓缩有机相，通过快速硅胶柱层析纯化得到m-5-1（2.90 g，产率53.4%），淡黄色液体。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 7.24 (s, 1h), 4.29 (s, 2h), 3.98 (s, 3h), 3.90 (t, j = 5.6 hz, 2h), 3.07 (t, j = 5.6 hz, 2h). ms(esi)：m/z 218.6 [m+h]
+
。
[0023]
5、化合物1的合成：将m-5-1（0.217 g，1 mmol）、苯胺（0.11 g，1.2 mmol）、冰醋酸（0.07 g，1.2 mmol）加入到单口茄型瓶中，加入1，4-二氧六环3 ml，60℃反应10 h，期间用tlc板监测反应进程。待m-5-1反应完全后，冷却至室温，减压浓缩，通过快速硅胶柱层析纯化得到化合物1（0.197 g，产率71.9%），白色固体。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.60 (s, 1h), 7.79
ꢀ–ꢀ
7.76 (m, 2h), 7.31-7.25 (m, 2h), 6.99
ꢀ–ꢀ
6.93 (m, 1h), 6.42 (s, 1h), 3.97 (s, 2h), 3.92 (s, 3h), 3.64 (t, j = 5.5 hz, 2h), 2.95 (t, j = 5.5 hz, 2h). hrms (esi) for c
14h18
n4o
2 [m+h]
+
: calcd, 275.1503, found, 275.1490。
[0024]
实施例2：2-(((6-甲氧基-2-((3-吗啉苯基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙烷-1-醇（化合物2）的制备化合物2的结构式：
[0025]
参考实施例1的合成方法，以相同摩尔比加入反应原料，将步骤5中的苯胺替换为3-吗啉苯胺，其他原料相同，得到化合物2。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.37 (s, 1h), 7.50 (brs, 1h), 7.24-7.18 (m, 1h), 7.11 (t, j = 8.1 hz, 1h), 6.58-6.52 (m, 1h), 6.34 (s, 1h), 3.91 (s, 3h), 3.77
ꢀ–ꢀ
3.68 (m, 6h), 3.53 (t, j = 5.6 hz, 2h), 3.12
ꢀ–ꢀ
3.04 (m, 4h), 2.73 (t, j = 5.6 hz, 2h). hrms (esi) for c
18h25
n5o
3 [m+h]
+
: calcd, 360.2030, found, 360.2017。
[0026]
实施例3：2-(((2-([1,1'-联苯]-3-基氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙烷-1-醇（化合物3）的制备
化合物3的结构式：
[0027]
参考实施例1的合成方法，以相同摩尔比加入反应原料，将步骤5中的苯胺替换为[1，1'-联苯]-3-胺，其他原料相同，得到化合物3。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.75 (s, 1h), 8.08 (s, 1h), 7.86
ꢀ‑ꢀ
7.80 (m, 1h), 7.66
ꢀ–ꢀ
7.62 (m, 2h), 7.51
ꢀ–ꢀ
7.44 (m, 2h), 7.41
ꢀ–ꢀ
7.34 (m, 2h), 7.28
ꢀ‑ꢀ
7.24 (m, 1h), 6.48 (s, 1h), 5.21 (brs, 1h), 4.09 (s, 2h), 3.95 (s, 3h), 3.68 (q, j = 5.4 hz, 2h), 3.08 (t, j = 5.4 hz, 2h). hrms (esi) for c
20h22
n4o
2 [m+h]
+
: calcd, 351.1816, found, 351.1801。
[0028]
实施例4：3-((4-(((2-羟乙基)氨基)甲基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)苯酚（化合物4）的制备化合物4的结构式：
[0029]
参考实施例1的合成方法，以相同摩尔比加入反应原料，将步骤5中的苯胺替换为3-氨基苯酚，其他原料相同，得到化合物4。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.38 (s, 1h), 9.21 (s, 1h), 7.34 (brs, 1h), 7.19
ꢀ–ꢀ
7.14 (m, 1h), 7.02 (t, j = 8.1 hz, 1h), 6.37
ꢀ–ꢀ
6.33 (m, 2h), 6.32 (s, 1h), 3.91 (s, 3h), 3.69 (s, 2h), 3.51 (t, j = 5.7 hz, 2h), 2.67 (t, j = 5.7 hz, 2h). hrms (esi) for c
14h18
n4o
3 [m+h]
+
: calcd, 291.1452, found, 291.1441。
[0030]
实施例5：2-(((6-甲氧基-2-(间甲苯基氨基)嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙烷-1-醇（化合物5）的制备化合物5的结构式：
[0031]
参考实施例1的合成方法，以相同摩尔比加入反应原料，将步骤5中的苯胺替换为3-甲基苯胺，其他原料相同，得到化合物5。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.50 (s, 1h), 7.61 (brs, 1h), 7.59
ꢀ‑ꢀ
7.55 (m, 1h), 7.15 (t, j = 7.8 hz, 1h), 6.78
ꢀ–ꢀ
6.74 (m, 1h), 6.38 (s, 1h), 3.92 (s, 3h), 3.87 (s, 2h), 3.59 (t, j = 5.5 hz, 2h), 2.86 (t, j = 5.5 hz, 2h), 2.27 (s, 3h). hrms (esi) for c
15h20
n4o
2 [m+h]
+
: calcd, 289.1659, found, 289.1648。
[0032]
实施例6：2-((4-(((2-羟乙基)氨基)甲基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)苯酚（化合物6）的制备
化合物6的结构式：
[0033]
参考实施例1的合成方法，以相同摩尔比加入反应原料，将步骤5中的苯胺替换为邻氨基苯酚，其他原料相同，得到化合物6。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.09
ꢀ–ꢀ
8.00 (m, 2h), 6.90
ꢀ–ꢀ
6.76 (m, 3h), 6.33 (s, 1h), 3.89 (s, 2h), 3.63 (s, 2h), 3.48 (t, j = 5.7 hz, 2h), 2.61 (t, j = 5.7 hz, 2h). hrms (esi) for c
14h18
n4o
3 [m+h]
+
: calcd, 291.1452, found, 291.1438。
[0034]
实施例7：4-((4-(((2-羟乙基)氨基)甲基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)苯酚（化合物7）的制备化合物7的结构式：
[0035]
参考实施例1的合成方法，以相同摩尔比加入反应原料，将步骤5中的苯胺替换为对氨基苯酚，其他原料相同，得到化合物7。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.33 (s, 1h), 9.18 (s, 1h), 7.50 (d, j = 8.5 hz, 2h), 6.71 (d, j = 8.7 hz, 2h), 6.39 (s, 1h), 5.29 (s, 1h), 4.06 (s, 2h), 3.88 (s, 3h), 3.70 (brs, 1h), 3.09 (t, j = 5.4 hz, 2h). hrms (esi) for c
14h18
n4o
3 [m+h]
+
: calcd, 291.1452, found, 291.1438。
[0036]
实施例8：2-(((6-甲氧基-2-((3-甲氧基苯基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙烷-1-醇（化合物8）的制备化合物8的结构式：
[0037]
参考实施例1的合成方法，以相同摩尔比加入反应原料，将步骤5中的苯胺替换为3-甲氧基苯胺，其他原料相同，得到化合物8。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.53 (s, 1h), 7.61 (t, j = 2.2 hz, 1h), 7.31
ꢀ–ꢀ
7.24 (d, j = 7.1 hz, 1h), 7.15 (t, j = 8.1 hz, 1h), 6.54
ꢀ–ꢀ
6.47 (m, 1h), 6.35 (s, 1h), 3.92 (s, 3h), 3.73 (s, 3h), 3.68 (s, 2h), 3.50 (t, j = 5.7 hz, 2h), 2.65 (t, j = 5.7 hz, 2h). hrms (esi) for c
15h20
n4o
3 [m+h]
+
: calcd, 305.1608, found, 305.1596。
[0038]
实施例9：6-(((2-羟乙基)氨基)甲基)-2-((3-羟基苯基)氨基)嘧啶-4(3h)-酮（化
合物9）的制备化合物9的结构式：
[0039]
合成路线：
[0040]
将化合物4（0.29 g，1 mmol）加入到茄型瓶中，向其中加入甲醇2 ml，浓盐酸1 ml，90 ℃反应16 h，期间用hplc监测反应进程。待反应结束，冷却至室温，冰浴滴加氨水至ph为7，减压浓缩，通过快速硅胶柱层析纯化得到9（0.243 g，产率88.1%），淡黄色液体。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 7.32 (s, 1h), 7.08
ꢀ–ꢀ
6.99 (m, 2h), 6.43
ꢀ–ꢀ
6.35 (m, 1h), 5.84 (s, 1h), 3.66 (s, 2h), 3.57 (t, j = 5.7 hz, 2h), 2.78 (t, j = 5.7 hz, 2h). hrms (esi) for c
13h16
n4o
3 [m+h]
+
: calcd, 277.1295, found, 277.1286。
[0041]
实施例10：6-(((2-羟乙基)氨基)甲基)-2-(苯基氨基)嘧啶-4(3h)-酮（化合物10）的制备化合物10的结构式：
[0042]
参考实施例9的合成方法，以相同摩尔比加入反应原料，将化合物4替换为化合物1，其他原料相同，得到化合物10。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.84 (s, 1h), 7.68 (d, j = 8.0 hz, 2h), 7.29 (t, j = 7.8 hz, 2h), 6.99 (t, j = 7.3 hz, 1h), 5.86 (s, 1h), 3.63 (s, 2h), 3.55 (t, j = 5.6 hz, 2h), 2.75 (t, j = 5.6 hz, 2h). hrms (esi) for c
13h16
n4o
2 [m+h]
+
: calcd, 261.1346, found, 261.1335。
[0043]
实施例11：2-([1,1'-联苯]-3-基氨基)-6-(((2-羟乙基)氨基)甲基)嘧啶-4(3h)-酮（化合物11）的制备化合物11的结构式：
10.18 (s, 1h), 9.55 (s, 1h), 8.06 (s, 1h), 7.40 (brs, 1h), 7.05 (t, j = 8.0 hz, 1h), 7.00
ꢀ‑ꢀ
6.95 (m, 1h), 6.43
ꢀ–ꢀ
6.39 (m, 1h), 5.81 (s, 1h), 3.58 (s, 2h), 3.24
ꢀ–ꢀ
3.19 (m, 2h), 2.70 (t, j = 6.3 hz, 2h), 1.80 (s, 3h). hrms (esi) for c
15h19
n5o
3 [m+h]
+
: calcd, 318.1561, found, 318.1552。
[0051]
实施例15：((2-((2-甲基-[1，1'-联苯]-3-基)氨基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-d-丝氨酸乙酯（化合物15）的制备化合物15的结构式：
[0052]
合成路线：
[0053]
合成方法：1、化合物m-3-2的合成：将m-2-1（16.16 g，80 mmol），3-溴-2-甲基苯胺（14.88 g，80 mmol）和冰醋酸（7.20 g，120 mmol）于反应瓶中，加入400 ml二氧六环后，100℃回流反应过夜。tlc监测反应进程，原料反应完全后，加入饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯溶剂萃取3次。合并有机相，蒸干后硅胶柱层析得到纯化的化合物m-3-2（11.27g，收率40%）。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.47 (s, 1h), 7.48
ꢀ–ꢀ
7.41 (m, 2h), 7.13 (t, j = 8.0 hz, 1h), 6.69 (s, 1h), 3.84 (s, 3h), 3.81 (s, 3h), 2.29 (s, 3h). ms(esi)：m/z 352.2 [m+h]
+
。
[0054]
2、化合物m-4-2的合成：将m-3-2（10.57 g，30 mmol）溶于150 ml四氢呋喃中，通入氩气保护，加入120ml二异丁基氢化铝（1.0 mol/l），冰浴反应3个小时。滴加甲醇淬灭反应至无气泡生成，乙酸乙酯萃取3次后合并有机层。蒸干后硅胶柱层析纯化，得到纯化的化合物m-4-2（5.93 g，收率为
61%）。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.93 (s, 1h), 7.56
ꢀ–ꢀ
7.26 (m, 2h), 7.18
ꢀ–ꢀ
6.98 (m, 1h), 6.26 (s, 1h), 5.39 (s, 1h), 4.29 (s, 2h), 3.78 (s, 3h), 2.27 (s, 3h). ms(esi)：m/z 324.2 [m+h]
+
。
[0055]
3、化合物m-5-2的合成：将m-4-2（4.86 g，15 mmol）、苯硼酸（2.195 g，18 mmol）、1,1-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯（pd(dppf)cl2，0.65 g，0.9 mmol）和碳酸钾（5.18 g，37.5 mmol）依次加入单口瓶中，之后加入二氧六环/水混合溶剂75 ml（二氧六环和水的体积比为4:1），通入氩气保护，100℃反应16 h。旋蒸除去二氧六环后，加入30 ml水，并用乙酸乙酯萃取3次（30 ml*3）。合并有机相并旋干，硅胶柱分离得到纯化的化合物m-5-2（3.90 g，收率81%）。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.74 (s, 1h), 7.53
ꢀ–ꢀ
7.49 (m, 1h), 7.48
ꢀ–ꢀ
7.41 (m, 2h), 7.39
ꢀ–ꢀ
7.33 (m, 1h), 7.32
ꢀ–ꢀ
7.27 (m, 2h), 7.24
ꢀ–ꢀ
7.18 (m, 1h), 7.01
ꢀ‑ꢀ
6.95 (m, 1h), 6.25 (s, 1h), 5.38 (t, j = 5.9 hz, 1h), 4.31 (d, j = 5.9 hz, 2h), 3.81 (s, 3h), 2.08 (s, 3h). ms(esi)：m/z 322.3 [m+h]
+
。
[0056]
4、化合物m-6-1的合成：将m-5-2（3.21 g，10 mmol）放入单口瓶中，之后加入10 ml二氯亚砜，50℃搅拌2 h。减压蒸除溶剂后硅胶柱层析，即得化合物m-6-1 （3.23 g，收率95%）。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.67 (s, 1h), 7.55
ꢀ–ꢀ
7.51 (m, 1h), 7.48
ꢀ–ꢀ
7.42 (m, 2h), 7.39
ꢀ‑ꢀ
7.34 (m, 1h), 7.33
ꢀ–ꢀ
7.21 (m, 3h), 7.12
ꢀ–ꢀ
7.03 (m, 1h), 6.49 (s, 1h), 4.62 (s, 2h), 3.86 (s, 3h), 2.12 (s, 3h). ms(esi)：m/z 340.3 [m+h]
+
。
[0057]
5、化合物m-7-1的合成：将m-6-1（1.7 g，5 mmol）加入单口茄型瓶中，向其中加入浓盐酸10 ml，100℃反应10 h，期间用hplc监测反应进程。待m-6-1转化完全，停止加热，冷却至室温，冰浴，向反应液中缓慢滴加氨水至ph = 6，减压浓缩，通过快速硅胶柱层析纯化得到m-7-1（1.56 g，产率95.7%）。1h nmr (300 mhz, dmso-d6) δ 8.35 (s, 1h), 7.78
‑ꢀ
7.68 (m, 1h), 7.51
‑ꢀ
7.38 (m, 3h), 7.37
ꢀ‑ꢀ
7.30 (m, 3h), 7.28
ꢀ–ꢀ
7.22 (m, 3h), 7.05
ꢀ–ꢀ
6.99 (m, 1h), 5.91 (s, 1h), 4.37 (s, 2h), 2.10 (s, 3h). ms(esi)：m/z 326.3 [m+h]
+
。
[0058]
6、化合物15的合成将m-7-1（0.325 g，1 mmol）、d-丝氨酸乙酯（0.25 g，1.5 mmol）、dipea（0.19 g，1.5 mmol）加入到25 ml单口茄型瓶中，向其中加入dmf 3ml，50℃反应8 h，期间用tlc板监测反应进程。待m-7-1反应完全，停止加热，冷却至室温，加入水和乙酸乙酯各10 ml，萃取3次，合并有机相，减压浓缩，通过快速硅胶柱层析纯化得到化合物15（0.323 g，产率76.7%）。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.19 (s, 1h), 7.78 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.50
ꢀ–ꢀ
7.41 (m, 2h), 7.40
ꢀ–ꢀ
7.34 (m, 1h), 7.34
ꢀ–ꢀ
7.29 (m, 2h), 7.23 (t, j = 7.8 hz, 1h), 7.02
ꢀ–ꢀ
6.97 (m, 1h), 5.81 (s, 1h), 4.85 (t, j = 5.7 hz, 1h), 4.08 (q, j = 7.1 hz, 2h), 3.59 (t, j = 5.4 hz, 2h), 3.54
ꢀ–ꢀ
3.46 (m, 1h), 3.32
ꢀ–ꢀ
3.23 (m, 2h), 2.10 (s, 3h), 1.18 (t, j = 7.1 hz, 3h). hrms (esi) for c
23h26
n4o
4 [m+h]
+
: calcd, 423.2027, found, 423.2011。
[0059]
实施例16：((2-((2-甲基-[1，1'-联苯]-3-基)氨基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-d-丝氨酸（化合物16）的制备
化合物16的结构式：
[0060]
将化合物15（0.21 g，0.5 mmol）和氢氧化锂（0.06 g，1.5 mmol）加入到10 ml单口茄型瓶中，向其中加入水3 ml，室温反应10 h，期间用tlc板监测反应进程。待化合物15完全转化，冰浴加入1 n hcl至ph = 6，减压浓缩，通过快速硅胶柱层析纯化得到16（0.182 g，产率92.8%），淡黄色液体。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.39 (s, 1h), 7.72 (d, j = 6.8 hz, 1h), 7.48
ꢀ–ꢀ
7.41 (m, 3h), 7.40
ꢀ–ꢀ
7.34 (m, 1h), 7.33
ꢀ–ꢀ
7.29 (m, 2h), 7.23 (t, j = 7.8 hz, 1h), 7.02 (d, j = 7.6 hz, 1h), 5.87 (s, 1h), 4.21 (t, j = 3.3 hz, 1h), 3.95
ꢀ–ꢀ
3.90 (m, 2h), 3.86
ꢀ–ꢀ
3.71 (m, 2h), 2.15 (s, 3h). hrms (esi) for c
21h22
n4o
4 [m+h]
+
: calcd, 395.1714, found, 395.1696。
[0061]
实施例17：6-(((2-羟乙基)氨基)甲基)-2-((2-甲基-[1，1'-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4(3h)-酮（化合物17）的制备化合物17的结构式：
[0062]
参考实施例15的合成方法，以相同摩尔比加入反应原料，将步骤6中的d-丝氨酸乙酯替换为乙醇胺，其他原料相同，得到化合物17。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.57 (s, 1h), 7.80
ꢀ–ꢀ
7.75 (m, 1h), 7.49
ꢀ–ꢀ
7.43 (m, 2h), 7.41
ꢀ–ꢀ
7.36 (m, 1h), 7.34
ꢀ–ꢀ
7.30 (m, 2h), 7.24 (t, j = 7.8 hz, 1h), 7.01 (d, j = 7.6, 1h), 5.81 (s, 1h), 3.57
ꢀ–ꢀ
3.48 (m, 4h), 2.70 (t, j = 5.6 hz, 2h), 2.12 (s, 3h). hrms (esi) for c
20h22
n4o
2 [m+h]
+
: calcd, 351.1816, found, 351.1803。
[0063]
实施例18：生物学评价1、本发明的化合物对vista蛋白的亲和力测试实验材料：试剂盒：monolith tm series protein labeling kit red-nhs 2nd generation；毛细管：mo-k022 monolith nt.115 capillaries lot: 899917；缓冲液：ph 7.4，10 mm hepes，150 mm nacl；蛋白：糖基化修饰的vista蛋白（将带有天然信号肽的人源vista胞外区(met1-ala194)克隆到含c端6xhis-tag的真核表达载体pcdna3.1(+)上，构建hvista-his表达质粒，并转化至e.coli top10感受态细胞（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成转化）。将无内毒素大提的pcdna3.1(+)-hvista-his质粒（南京诺唯赞生物科技有限公司，cat. dc 202-01）转染到expi293f细胞（南京大学提供）中，置于37℃，5% co2培养箱中120 rpm振荡培养96 h。将培养96 h后的细胞混悬液2000 rpm离心20 min后收集上清并浓缩至100 ml。将浓缩后的上清进行his-tag镍柱纯化以及分子筛（hiload tm
16/600 superdex tm 200 pg）纯化，得到糖基化的vista蛋白。
[0064]
实验机型：monolith nt.115
实验步骤通过微量热泳动法（mst）测定hvista蛋白与本发明化合物1~17的亲和力。按照monolith red-nhs二代蛋白标记试剂盒（nano temper technologies）说明书标记纯化后的蛋白。将小分子抑制剂（化合物1~17）倍比稀释，配置成浓度范围为400 μmol至0.0122 μmol的溶液（起始400μmol，稀释16次，每次都是两倍稀释，最终浓度是0.0122 μmol）。室温条件下，将化合物溶液与标记好的蛋白1：1混合均匀，避光孵育10 min，用玻璃毛细管吸取混合物进行检测。检测完成后，使用mo. affinity analysis v2.2.4软件处理数据，得到化合物与vista蛋白的亲和力数值（表1）。
[0065]
表1 实施例1~17中制备的化合物与vista蛋白的亲和力实施例编号vista (μm)实施例编号vista (μm)1c10c2b11b3b12b4a13b5b14b6b15c7b16b8b17a9a
ꢀꢀ
[0066]
所得kd值如表1所示，可以看出各实施例所合成的化合物均对vista有较好的结合活性。范围如下：a＝0.001-1 μm；b＝1.01-10 μm；c＝10.01-100 μm。
[0067]
2、化合物对vista相互作用抑制效果的测定：实验材料：elisa试剂盒购于北京四正柏生物科技有限公司（cat. che0017），用于检测ifn-γ的释放量；抗人源cd3抗体(okt3)采购于thermo fisher scientific，cat.16-0037-85；cd28单克隆抗体（cd28.2）购于thermo fisher scientific，cat.16-0289-85；pbmc细胞购自妙顺（上海）生物科技有限公司；96孔板。
[0068]
重组人源vista-fc蛋白的获得：将无内毒素大提的pcdna3.1-vista-fc质粒（由金斯瑞生物科技有限公司合成）转染到expi293f（南京大学提供）细胞中，置于37℃，5% co2培养箱中120 rpm振荡培养96 h。将培养96 h后的细胞混悬液2000 rpm，离心20 min后收集上清并浓缩至100 ml。其中，转染步骤为调整细胞密度至3
×
106/ml，每瓶细胞悬浮液体体积为1l。向无菌的50 ml离心管中加入1.5 mg无内毒素大提的pcdna3.1-vista-fc质粒，加入培养基稀释至约45 ml，轻轻震荡混匀，室温孵育2-5 min；向离心管中加入4 ml事先抽滤除菌的1 mg/ml pei溶液（上海起发实验试剂有限公司，cat. 78pei40000)，充分震荡混匀，室温孵育20-30 min。将孵育好的dna-pei混合溶液加入细胞悬浮体系中。然后，将浓缩后的上清缓慢加入protein a柱，使用glycine ph3.0 和tris-hcl ph 8.0进行洗脱。收集洗脱液浓缩至2 ml，使用hiload tm
16/600 superdex tm 200 pg凝胶柱进行纯化，收集峰尖部分浓缩至10 mg/ml，得到最终的重组人源vista-fc蛋白。
[0069]
实验仪器：多功能酶标仪实验步骤：
1、用无菌pbs（生工生物工程（上海）股份有限公司，cat no: e607008）配制含有抗人源cd3抗体（终浓度为2 μg/ml）、cd28单克隆抗体（终浓度为2 μg/ml）与vista-fc（终浓度为10 μg/ml）混合液。加入96孔板中4℃过夜孵育。
[0070]
2、用移液枪吸出混合液，轻轻加入100 μl 1640培养基清洗1次，弃去培养基。
[0071]
3、用培养基分别稀释实施例4、5、9制备的化合物，在96孔板中分别加入100 μl含dmso对照以及含上述化合物（5 μm）的培养基。37℃，5％co2孵育1-2h。
[0072]
4、向每孔加入100 μl密度为2
×
106/ml的pbmc细胞悬液，37℃，5% co2培养48 h，采用elisa试剂盒检测inf-γ确定其分泌水平。
[0073]
实验结果：由图1可见，制备得到的化合物可阻断vista通路，恢复ifn-γ的释放（图中stimulation+vista-fc组）。此外，还设置了对照组：stim.和vista-fc；其中stim.是仅用抗人源cd3抗体和cd28单克隆抗体刺激，不加任何化合物；vista-fc是添加了vista-fc蛋白和抗人源cd3抗体、cd28单克隆抗体，不加任何化合物。

技术特征：
1.如通式（i）所示的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体：（i）；其中，环a选自或；x1选自n、o、s；r1和r2分别选自h、羟基、氨基、甲氧基、吗啉基、c
1-c4烷基或环烷基、x取代的c
1-c4烷基、苯基；所述x选自卤素、羟基、羧基、氨基、酰胺基；当r1苯基，r2为甲基时，a环仅选自；r3选自：；t是0、1、2、3或4；r4选自h或c
1-c3烷基；r5选自h或c
1-c4烷基；r6选自h或c
1-c4烷基；r7选自h或c
1-c4烷基。2.权利要求1所述的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体，其特征在于，所述x1选自n；r1和r2分别选自h、羟基、甲氧基、吗啉基、c
1-c4烷基、苯基。3.根据权利要求1所述的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体，其特征在于，所述杂环类化合物如下所示：
。4.一种制备权利要求1所述的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体的方法，其特征在于，当所述式（i）化合物中的x1为n，环a为时，所述化合物的合成路线如下式：；其中，r1、r2、r3与权利要求1所述式（i）中的一致，具体合成步骤如下：（1）化合物c1和甲醇钠作用反应生成c2；（2）化合物c2经还原剂还原，得到化合物c3；（3）化合物c3与氯化亚砜、二氯甲烷发生卤化反应，得到化合物c4；（4）化合物c4与hnr3在碱性条件下，反应生成终产物c5；（5）化合物c5在酸性条件下发生取代反应，得到化合物ia。5.一种如权利要求1-3任一项所述的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在制备具有免疫检查点抑制剂中的应用。6.一种如权利要求1-3任一项所述的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在
制备具有vista抑制活性的抑制剂中的应用。7.根据权利要求5-6任一项所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂治疗的疾病包括自身免疫性疾病、癌症或感染性疾病；所述的癌症选自肺癌、黑色素瘤、血液肿瘤、神经胶质肉瘤、消化系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、神经系统肿瘤、泌尿系肿瘤、皮肤癌；所述的感染性疾病选自细菌及病毒感染；所述的自身免疫性疾病选自器官特异性以及系统性自身免疫病。8.一种药用组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的通式（i）化合物或其药学上可接受的盐、消旋体以及药学上可接受的载体。

技术总结
本发明公开了一种式（I）所示的杂环类免疫抑制剂及其制备方法和应用。本发明所制备的化合物可以与VISTA蛋白结合，阻断其与配体蛋白相互作用，抑制VISTA信号通路，从而治疗与VISTA信号通路相关的疾病如癌症、感染和身免疫类疾病等。式（I）。式（I）。式（I）。


技术研发人员：杨鹏 肖易倍 王格非 孙程亮 何玉玲 张煜 张国裕 郝海平 王丽萍
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.08.08
技术公布日：2023/9/14