一种单细胞蛋白的生产方法与流程

1.本发明涉及一种发酵生产方法，尤其涉及一种单细胞蛋白的生产方法。


背景技术：

2.单细胞蛋白主要是指细菌、酵母、藻类等单细胞生物体。作为人口大国的中国，蛋白质的需求量非常巨大。中国作为全世界最大的蛋白质进口国，每年花费在蛋白质进口方面的费用高达1500亿元，其中主要包括进口大豆蛋白和动物蛋白。但由于植物和动物具有较长的生长周期，这无疑大大增加了动物蛋白和植物蛋白的生产成本。而单细胞蛋白的应用则避免了这个问题，单细胞蛋白即利用微生物代谢生产蛋白，然后将微生物菌体制成干粉添加在饲料或其他可食用物质里。单细胞蛋白具有丰富的氨基酸种类，营养丰富，而且微生物能够将无机氮转化为有机氮，这相较于植物和动物蛋白来说，即降低了生产成本又环保。
3.微生物在生长和生产单细胞蛋白的过程中，需要氨、铵盐或硝酸盐等提供的氮源，而且在生长过程中培养基需要保持合适的碳氮比。当碳氮比较高时，会导致培养基中的氨先被消耗完影响后期单细胞蛋白的合成；当碳氮比过低时，氨大部分被浪费掉，不能进入细胞。
4.但是在单细胞蛋白发酵过程中，现有技术通常全程维持一定的碳氮比，或者只保证总的碳氮比处于合适区间，而忽略菌株生长不同阶段对氮的需求，以及有机氮和无机氮之间的比例区别，并且也未见对于碳磷比的研究。如专利cn110982717a、cn110982706a中碳氮比为6:1-10:1，蛋白含量占菌体干重的32％～45％，发酵5～8天dcw(细胞干重)浓度最终仅20g/l。
5.综上，提供一种高效生产单细胞蛋白的方法具有重要的意义。


技术实现要素：

6.为了解决以上技术问题，本发明提出一种单细胞蛋白的生产方法。
7.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
8.一种单细胞蛋白的生产方法，包括以下步骤：
9.s1、准备包含碳源、氮源、磷源的发酵培养基a，其中以元素质量比计，碳氮比为(5-50):1，优选(10-40):1，更优选(15-30):1，氮源中有机氮、无机氮的比例为(3-10):1，优选(5-8):1，优选(6-7):1，碳磷比为(1-20):1，优选(4-15):1，优选(6-10):1；
10.s2、将活化后的发酵菌株接种至上述发酵培养基a中，待菌株进入对数生长期后，开始流加发酵培养基b，其中以元素质量比计，碳氮比为(1-20):1，优选(3-17):1，更优选(5-15):1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:(50-100)，优选1:(60-90)，优选1:(65-85)，碳磷比为(20-50):1，优选(25-45):1，优选(30-40):1；
11.s3、当发酵菌株进入稳定生长期后，开始流加发酵培养基c，其中以元素质量比计，碳氮比(3-15):1，优选(5-10):1，更优选(6-9):1，氮源中有机氮、无机氮的比例≤1/100，且
有机氮含量可以为零，碳磷比为(50-100):1，优选(60-90):1，优选(70-80):1；
12.s4、当氮源消耗速率以氮元素质量计降低至0.1-5g/l/h优选0.5-4g/l/h更优选1-3g/l/h，停止流加，耗尽发酵液中碳源后停止发酵，发酵液脱水获得单细胞蛋白。
13.作为本发明优选的实施方案，所述发酵菌株为酵母菌，优选解脂亚罗酵母、酿酒酵母、异常汉逊酵母中的一种或多种。
14.作为本发明优选的实施方案，所述发酵菌株的活化采用含1-50g/l碳源的ypd培养基进行摇瓶培养，发酵菌株例如可以使用甘油保存菌种，常规可以按照0.1-1％，优选0.2-0.8％，更优选0.4-0.6％的接种量进行摇瓶培养。
15.优选地，所述发酵菌株活化时的摇瓶培养条件为25-35℃，转速100-500rpm，培养至菌密度od600为3-10。
16.优选地，ypd培养基包括：酵母粉1-20g/l，蛋白胨1-40g/l，1-50g/l碳源。所述碳源为葡萄糖、蔗糖、甘油中的一种或多种。
17.作为本发明优选的实施方案，步骤s2中发酵菌株的接种量以溶液体积比计，为发酵培养基a的1-10％。
18.作为本发明优选的实施方案，步骤s2、s3、s4的发酵培养条件为：发酵温度25-35℃，通气量2-8l/min，搅拌转速200-800rpm，ph为5-8优选6-7更优选6.3-6.7，同时控制溶解氧的饱和度含量为10-60％。
19.优选地，ph通过添加中和剂进行调整，所述中和剂可以选自以下任意的碱性中和剂和/或酸性中和剂，其中，碱性中和剂包括但不限于碱性钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、氨水中的一种或多种，优选氢氧化钠、氨水、氢氧化钙、碳酸钙中的一种或多种；所述酸性中和剂包括但不限于盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸、乳酸中的一种或多种，优选硫酸、甲酸、乙酸等。
20.作为本发明优选的实施方案，步骤s2中，发酵菌株接种至发酵培养基a中后，培养5-20h至菌株进入对数生长期；
21.优选地，发酵菌株从对数生长期进入稳定生长期的发酵周期为48-96h。
22.本发明中，对数生长期、稳定生长期分别是菌株生长过程中的不同阶段，已知的是，菌株接种后可通过生长曲线反映菌株在培养过程中生长、繁殖和衰亡的规律,在适宜条件下培养,会出现延迟生长期、对数生长生长期、稳定生长期和衰退生长期4个阶段。其中，对数生长期是微生物经过延迟生长期的调整后生长最快，细胞数以几何级数增加的阶段。稳定生长期是指新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时的生长速度又逐渐趋向零的生长阶段。
23.作为本发明优选的实施方案，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、糖蜜、甲酸及其盐、乙酸及其盐、乳酸及其盐、天然气、甲醇、酯类中一种或多种；
24.优选地，所述氮源中有机氮源为酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、豆粕及其水解液、毛发水解液、尿素、鱼粉及其水解液、蚕蛹粉及其水解液、废菌丝体水解液、棉籽饼粉及其水解液中的一种或多种；
25.优选地，所述氮源中无机氮源为氨、铵盐、硝酸盐中的一种或多种；
26.优选地，所述磷源为亚磷酸、亚磷酸钾、亚磷酸钠、亚磷酸二氢钾、亚磷酸异丙酯、亚磷酸二乙酯、磷酸、磷酸胍、磷酸钾、磷酸铁、磷酸硼、磷酸三钠、磷酸四钙、磷酸二氢钾、磷
酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠中的一种或多种。
27.作为本发明优选的实施方案，所述发酵培养基a中磷源含量为1-9g/l；
28.优选地，所述发酵培养基b中碳源含量为200-800g/l；
29.优选地，所述发酵培养基c中碳源含量为100-900g/l。
30.作为本发明优选的实施方案，所述生产方法中，以发酵罐的总容量为100wt％计，培养基用量分别为：
31.发酵培养基a 20-40wt％，
32.发酵培养基b10-50wt％，
33.发酵培养基c10-50wt％。
34.作为本发明优选的实施方案，所述发酵培养基a除包含碳源、氮源、磷源以外，还包括以下组成的无机盐：0.1-0.5g/l氯化钾、0.1-0.5g/l七水硫酸镁、0.1-1g/l氯化钙、1ml/l微量元素储液；
35.优选地，所述微量元素储液的配方为：
36.0.2-3g/l柠檬酸，0.5-5g/l七水硫酸亚铁，0.1-1g/l七水硫酸锌，0.1-1g/l一水硫酸锰，0.05-0.5g/l五水硫酸铜，0.05-0.5g/l四水钼酸铵，0.01-0.3g/l六水氯化钴，0.05-0.5g/l硼酸，水定容1l。
37.本发明的有益效果如下：
38.相比已有的单细胞蛋白生产工艺，通过调整初始培养基和流加培养基的碳氮比、有机无机氮源比例，以及碳磷比，达到增强菌株生长速率、提高蛋白质含量的目的，菌株生物量可提高10％以上，粗蛋白含量提高20％以上。
具体实施方式
39.下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，本发明所述实施例只是作为对本发明的说明，不限制本发明的范围。
40.本发明实施例中主要原料信息如下：
41.酵母粉(有机氮9.9％)、蛋白胨(有机氮9.6％)购自oxoid，豆粕(有机氮6.9％)、玉米浆(有机氮5.7％)、棉籽饼粉(有机氮9％)购自aladdin，其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
42.ypd培养基：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，10g/l葡萄糖，水定容至1l。
43.解脂亚罗酵母：菌种保藏号cicc 32291。
44.生物量检测方法：
45.称量干燥的离心管，计作m1。将一毫升待测培养液放入离心管中，13000rpm转速下离心，移走上清液；烘箱温度控制在105℃，把以上含菌的离心管烘干直至质量不再改变，计作m2。那么，1ml培养液中含有的生物量m＝m2-m1。
46.粗蛋白含量检测方法：参照国标gb/t 6432-2018。
47.【实施例1】
48.按照以下方法生产单细胞蛋白：
49.(1)发酵菌株的活化：
50.在250ml三角瓶中装入50ml ypd培养基，将甘油保存的解脂亚罗酵母菌种按照
0.1wt％的接种量接种到三角瓶中，在28℃、200r/min的条件下摇床培养12h，od600为3.1，得到活化后的发酵菌株。
51.(2)准备发酵培养基a包括碳源、氮源、磷源，其中，以元素质量比计，碳氮比为15:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为7:1，碳磷比为7:1，且磷源添加量为2.5g/l。其中，碳源为葡萄糖，有机氮源为质量比为1.1：1.2的酵母粉和蛋白胨，无机氮源为硫酸铵，磷源为磷酸二氢钾。
52.除此以外，发酵培养基a还包括以下无机盐配方：0.1g/l氯化钾、0.5g/l七水硫酸镁、1g/l氯化钙、1ml/l微量元素储液；其中，微量元素储液的配方为：0.2g/l柠檬酸，5g/l七水硫酸亚铁，0.1g/l七水硫酸锌，1g/l一水硫酸锰，0.25g/l五水硫酸铜，0.5g/l四水钼酸铵，0.3g/l六水氯化钴，0.25g/l硼酸，水定容1l。
53.(3)将步骤(1)获得的活化后发酵菌株按照1vol％的接种量接种至发酵培养基a，在发酵温度32℃，通气量5l/min，搅拌转速500rpm，ph为7的条件下进行发酵培养，同时控制溶解氧的饱和度含量为20％。培养12h后，检测菌株进入对数生长期，开始流加发酵培养基b，其中，以元素质量比计，碳氮比为5:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:85，碳磷比为40:1，且碳源含量为400g/l。
54.发酵培养基b中，碳源为葡萄糖，有机氮源为酵母粉，无机氮源为氨，磷源为磷酸。
55.(4)当继续培养48h至发酵菌株进入稳定生长期后，开始流加发酵培养基c，其中以元素质量比计，碳氮比9:1，氮源完全使用无机氮源，碳磷比为70:1，且碳源含量为400g/l。
56.发酵培养基c中，碳源为葡萄糖，无机氮源为氨，磷盐为磷酸。
57.(5)当氮源消耗速率以氮元素质量计降低至1.3g/l/h，停止流加，耗尽发酵液中碳源后停止发酵，发酵液脱水获得单细胞蛋白。
58.本实施例生产方法中，以发酵罐的总容量为100wt％计，培养基用量分别为：发酵培养基a 40wt％，发酵培养基b10wt％，发酵培养基c 50wt％。
59.【实施例2】
60.按照以下方法生产单细胞蛋白：
61.(1)发酵菌株的活化：
62.在250ml三角瓶中装入50ml ypd培养基，将甘油保存的解脂亚罗酵母菌种按照0.1wt％的接种量接种到三角瓶中，在30℃、200r/min的条件下摇床培养15h，od600为4.5，得到活化后的发酵菌株。
63.(2)准备发酵培养基a包括碳源、氮源、磷源，其中，以元素质量比计，碳氮比为20:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为6.8:1，碳磷比为10:1，且磷源添加量为1.3g/l。其中，碳源为蔗糖，有机氮源为酵母粉，无机氮源为质量比为2.5：1的氯化铵和浓氨水，磷源为磷酸。
64.除此以外，发酵培养基a还包括以下无机盐配方：0.5g/l氯化钾、0.1g/l七水硫酸镁、0.1g/l氯化钙、1ml/l微量元素储液；其中，微量元素储液的配方为：3g/l柠檬酸，0.5g/l七水硫酸亚铁，1g/l七水硫酸锌，0.1g/l一水硫酸锰，0.05g/l五水硫酸铜，0.05g/l四水钼酸铵，0.01g/l六水氯化钴，0.05g/l硼酸，水定容1l。
65.(3)将步骤(1)获得的活化后发酵菌株按照5vol％的接种量接种至发酵培养基a，在发酵温度30℃，通气量2l/min，搅拌转速200rpm，ph为7的条件下进行发酵培养，同时控制溶解氧的饱和度含量为20％。培养10h后，检测菌株进入对数生长期，开始流加发酵培养基
b，其中，以元素质量比计，碳氮比为8:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:65，碳磷比为30:1，且碳源含量为400g/l。
66.发酵培养基b中，碳源为蔗糖，有机氮源为豆粕，无机氮源为硫酸铵，磷源为磷酸二氢钾。
67.(4)当继续培养70h至发酵菌株进入稳定生长期后，开始流加发酵培养基c，其中以元素质量比计，碳氮比6:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:100，碳磷比为74:1，且碳源含量为400g/l。
68.发酵培养基c中，碳源为蔗糖，有机氮源为豆粕，无机氮源为硫酸铵，磷盐为磷酸二氢钾。
69.(5)当氮源消耗速率以氮元素质量计降低至0.3g/l/h，停止流加，耗尽发酵液中碳源后停止发酵，发酵液脱水获得单细胞蛋白。
70.本实施例生产方法中，以发酵罐的总容量为100wt％计，培养基用量分别为：发酵培养基a 40wt％，发酵培养基b 40wt％，发酵培养基c 20wt％。
71.【实施例3】
72.按照以下方法生产单细胞蛋白：
73.(1)发酵菌株的活化：
74.在250ml三角瓶中装入50ml ypd培养基，将甘油保存的解脂亚罗酵母菌种按照0.1wt％的接种量接种到三角瓶中，在30℃、200r/min的条件下摇床培养13h，od600为4.1，得到活化后的发酵菌株。
75.(2)准备发酵培养基a包括碳源、氮源、磷源，其中，以元素质量比计，碳氮比为25:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为6.5:1，碳磷比为6:1，且磷源添加量为2g/l。其中，碳源为甲酸，有机氮源为质量比为玉米浆，无机氮源为甲酸铵，磷源为磷酸氢二钠。
76.除此以外，发酵培养基a还包括以下无机盐配方：0.3g/l氯化钾、0.2g/l七水硫酸镁、0.8g/l氯化钙、1ml/l微量元素储液；其中，微量元素储液的配方为：1.5g/l柠檬酸，2.5g/l七水硫酸亚铁，0.5g/l七水硫酸锌，0.5g/l一水硫酸锰，0.3g/l五水硫酸铜，0.4g/l四水钼酸铵，0.2g/l六水氯化钴，0.3g/l硼酸，水定容1l。
77.(3)将步骤(1)获得的活化后发酵菌株按照10vol％的接种量接种至发酵培养基a，在发酵温度31℃，通气量8l/min，搅拌转速800rpm，ph为7的条件下进行发酵培养，同时控制溶解氧的饱和度含量为20％。培养20h后，检测菌株进入对数生长期，开始流加发酵培养基b，其中，以元素质量比计，碳氮比为12:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:70，碳磷比为35:1，且碳源含量为500g/l。
78.发酵培养基b中，碳源为甲酸，有机氮源为玉米浆，无机氮源为氯化铵，磷源为亚磷酸钠。
79.(4)当继续培养80h至发酵菌株进入稳定生长期后，开始流加发酵培养基c，其中以元素质量比计，碳氮比7:1，氮源完全使用无机氮源，碳磷比为76:1，且碳源含量为500g/l。
80.发酵培养基c中，碳源为甲酸，无机氮源为氯化铵，磷盐为磷酸氢二钠。
81.(5)当氮源消耗速率以氮元素质量计降低至2g/l/h，停止流加，耗尽发酵液中碳源后停止发酵，发酵液脱水获得单细胞蛋白。
82.本实施例生产方法中，以发酵罐的总容量为100wt％计，培养基用量分别为：发酵
培养基a 30wt％，发酵培养基b 40wt％，发酵培养基c 30wt％。
83.【实施例4】
84.按照以下方法生产单细胞蛋白：
85.(1)发酵菌株的活化：
86.在250ml三角瓶中装入50ml ypd培养基，将甘油保存的解脂亚罗酵母菌种按照0.1vol％的接种量接种到三角瓶中，在31℃、200r/min的条件下摇床培养14h，od600为4.6，得到活化后的发酵菌株。
87.(2)准备发酵培养基a包括碳源、氮源、磷源，其中，以元素质量比计，碳氮比为30:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为6:1，碳磷比为9:1，且磷源添加量为1.7g/l。其中，碳源为乙酸，有机氮源为豆粕粉，无机氮源为乙酸铵，磷源为亚磷酸二氢钾。
88.除此以外，发酵培养基a还包括以下无机盐配方：0.4g/l氯化钾、0.3g/l七水硫酸镁、0.5g/l氯化钙、1ml/l微量元素储液；其中，微量元素储液的配方为：2g/l柠檬酸，3g/l七水硫酸亚铁，0.7g/l七水硫酸锌，0.7g/l一水硫酸锰，0.4g/l五水硫酸铜，0.15g/l四水钼酸铵，0.25g/l六水氯化钴，0.15g/l硼酸，水定容1l。
89.(3)将步骤(1)获得的活化后发酵菌株按照7vol％的接种量接种至发酵培养基a，在发酵温度28℃，通气量3l/min，搅拌转速300rpm，ph为7的条件下进行发酵培养，同时控制溶解氧的饱和度含量为20％。培养15h后，检测菌株进入对数生长期，开始流加发酵培养基b，其中，以元素质量比计，碳氮比为15:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:80，碳磷比为37:1，且碳源含量为500g/l。
90.发酵培养基b中，碳源为乙酸，有机氮源为蛋白胨，无机氮源为乙酸铵，磷源为磷酸钠。
91.(4)当继续培养85h至发酵菌株进入稳定生长期后，开始流加发酵培养基c，其中以元素质量比计，碳氮比8:1，氮源完全使用无机氮源，碳磷比为80:1，且碳源含量为500g/l。
92.发酵培养基c中，碳源为乙酸，无机氮源为乙酸铵，磷盐为亚磷酸二氢钾。
93.(5)当氮源消耗速率以氮元素质量计降低至1.5g/l/h，停止流加，耗尽发酵液中碳源后停止发酵，发酵液脱水获得单细胞蛋白。
94.本实施例生产方法中，以发酵罐的总容量为100wt％计，培养基用量分别为：发酵培养基a 20wt％，发酵培养基b 40wt％，发酵培养基c 40wt％。
95.【实施例5】
96.按照以下方法生产单细胞蛋白：
97.(1)发酵菌株的活化：
98.在250ml三角瓶中装入50ml ypd培养基，将甘油保存的解脂亚罗酵母菌种按照0.1wt％的接种量接种到三角瓶中，在35℃、200r/min的条件下摇床培养18h，od600为5.1，得到活化后的发酵菌株。
99.(2)准备发酵培养基a包括碳源、氮源、磷源，其中，以元素质量比计，碳氮比为18:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为6.6:1，碳磷比为8:1，且磷源添加量为1.5g/l。其中，碳源为葡萄糖，有机氮源为鱼粉，无机氮源为硝酸钾，磷源为磷酸氢二钾。
100.除此以外，发酵培养基a还包括以下无机盐配方：0.2g/l氯化钾、0.4g/l七水硫酸镁、0.7g/l氯化钙、1ml/l微量元素储液；其中，微量元素储液的配方为：1g/l柠檬酸，3.5g/l
七水硫酸亚铁，0.6g/l七水硫酸锌，0.4g/l一水硫酸锰，0.5g/l五水硫酸铜，0.35g/l四水钼酸铵，0.15g/l六水氯化钴，0.5g/l硼酸，水定容1l。
101.(3)将步骤(1)获得的活化后发酵菌株按照3vol％的接种量接种至发酵培养基a，在发酵温度29℃，通气量6l/min，搅拌转速200rpm，ph为7的条件下进行发酵培养，同时控制溶解氧的饱和度含量为20％。培养5h后，检测菌株进入对数生长期，开始流加发酵培养基b，其中，以元素质量比计，碳氮比为10:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:75，碳磷比为33:1，且碳源含量为500g/l。
102.发酵培养基b中，碳源为葡萄糖，有机氮源为棉籽饼粉，无机氮源为乙酸铵，磷源为亚磷酸钠。
103.(4)当继续培养90h至发酵菌株进入稳定生长期后，开始流加发酵培养基c，其中以元素质量比计，碳氮比7.5:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:200，碳磷比为75:1，且碳源含量为500g/l。
104.发酵培养基c中，碳源为葡萄糖，有机氮源为棉籽饼粉，无机氮源为乙酸铵，磷盐为亚磷酸钠。
105.(5)当氮源消耗速率以氮元素质量计降低至0.7g/l/h，停止流加，耗尽发酵液中碳源后停止发酵，发酵液脱水获得单细胞蛋白。
106.本实施例生产方法中，以发酵罐的总容量为100wt％计，培养基用量分别为：发酵培养基a 40wt％，发酵培养基b 50wt％，发酵培养基c10wt％。
107.【对比例1】
108.按照与实施例1基本相同的方法生产单细胞蛋白，区别仅在于，将步骤(2)发酵培养基a中的元素比例修改为：碳氮比为5:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为2:1，碳磷比为25:1。
109.【对比例2】
110.按照与实施例1基本相同的方法生产单细胞蛋白，区别仅在于，将步骤(3)流加的发酵培养基b中的元素比例修改为：碳氮比为25:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:40，碳磷比为10:1。
111.【对比例3】
112.按照与实施例1基本相同的方法生产单细胞蛋白，区别仅在于，将步骤(4)流加的发酵培养基c中的元素比例修改为：碳氮比为碳氮比20:1，氮源中有机氮、无机氮的比例为20:1，碳磷比为40:1。
113.对以上实施例和对比例方法制得的生物量和粗蛋白含量分别进行测试，结果如表1所示：
114.表1、测试结果
[0115] 生物量/g/l粗蛋白含量/％实施例110060实施例212058实施例311547实施例412550实施例512749
对比例13027对比例23330对比例35028
[0116]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技术的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、准备包含碳源、氮源、磷源的发酵培养基a，其中以元素质量比计，碳氮比为(5-50):1，优选(10-40):1，更优选(15-30):1，氮源中有机氮、无机氮的比例为(3-10):1，优选(5-8):1，优选(6-7):1，碳磷比为(1-20):1，优选(4-15):1，优选(6-10):1；s2、将活化后的发酵菌株接种至上述发酵培养基a中，待菌株进入对数生长期后，开始流加发酵培养基b，其中以元素质量比计，碳氮比为(1-20):1，优选(3-17):1，更优选(5-15):1，氮源中有机氮、无机氮的比例为1:(50-100)，优选1:(60-90)，优选1:(65-85)，碳磷比为(20-50):1，优选(25-45):1，优选(30-40):1；s3、当发酵菌株进入稳定生长期后，开始流加发酵培养基c，其中以元素质量比计，碳氮比(3-15):1，优选(5-10):1，更优选(6-9):1，氮源中有机氮、无机氮的比例≤1/100，且有机氮含量可以为零，碳磷比为(50-100):1，优选(60-90):1，优选(70-80):1；s4、当氮源消耗速率以氮元素质量计降低至0.1-5g/l/h优选0.5-4g/l/h更优选1-3g/l/h，停止流加，耗尽发酵液中碳源后停止发酵，发酵液脱水获得单细胞蛋白。2.根据权利要求1所述的单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，所述发酵菌株为酵母菌，优选解脂亚罗酵母、酿酒酵母、异常汉逊酵母中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，所述发酵菌株的活化采用含1-50g/l碳源的ypd培养基进行摇瓶培养；优选地，所述发酵菌株活化时的摇瓶培养条件为25-35℃，转速100-500rpm，培养至菌密度od600为3-10。4.根据权利要求1所述的单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，步骤s2中发酵菌株的接种量以溶液体积比计，为发酵培养基a的1-10％。5.根据权利要求1-4任一项所述的单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，步骤s2、s3、s4的发酵培养条件为：发酵温度25-35℃，通气量2-8l/min，搅拌转速200-800rpm，ph为5-8优选6-7更优选6.3-6.7，同时控制溶解氧的饱和度含量为10-60％。6.根据权利要求1-4任一项所述的单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，步骤s2中，发酵菌株接种至发酵培养基a中后，培养5-20h至菌株进入对数生长期；优选地，发酵菌株从对数生长期进入稳定生长期的发酵周期为48-96h。7.根据权利要求1-4任一项所述的单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、糖蜜、甲酸及其盐、乙酸及其盐、乳酸及其盐、天然气、甲醇、酯类中一种或多种；优选地，所述氮源中有机氮源为酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、豆粕及其水解液、毛发水解液、尿素、鱼粉及其水解液、蚕蛹粉及其水解液、废菌丝体水解液、棉籽饼粉及其水解液中的一种或多种；优选地，所述氮源中无机氮源为氨、铵盐、硝酸盐中的一种或多种；优选地，所述磷源为亚磷酸、亚磷酸钾、亚磷酸钠、亚磷酸二氢钾、亚磷酸异丙酯、亚磷酸二乙酯、磷酸、磷酸胍、磷酸钾、磷酸铁、磷酸硼、磷酸三钠、磷酸四钙、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠中的一种或多种。8.根据权利要求7所述的单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基a中磷源含量为1-9g/l；
优选地，所述发酵培养基b中碳源含量为200-800g/l；优选地，所述发酵培养基c中碳源含量为100-900g/l。9.根据权利要求8所述的单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，所述生产方法中，以发酵罐的总容量为100wt％计，培养基用量分别为：发酵培养基a 20-40wt％，发酵培养基b10-50wt％，发酵培养基c10-50wt％。10.根据权利要求7所述的单细胞蛋白的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基a除包含碳源、氮源、磷源以外，还包括以下组成的无机盐：0.1-0.5g/l氯化钾、0.1-0.5g/l七水硫酸镁、0.1-1g/l氯化钙、1ml/l微量元素储液；优选地，所述微量元素储液的配方为：0.2-3g/l柠檬酸，0.5-5g/l七水硫酸亚铁，0.1-1g/l七水硫酸锌，0.1-1g/l一水硫酸锰，0.05-0.5g/l五水硫酸铜，0.05-0.5g/l四水钼酸铵，0.01-0.3g/l六水氯化钴，0.05-0.5g/l硼酸，水定容1l。

技术总结
本发明公开了一种单细胞蛋白的生产方法，该方法在发酵菌株生长的不同阶段分别调整不同的碳氮比、有机氮和无机氮的比例、碳磷比，达到增强菌株生长速率、提高单细胞蛋白含量的目的。的。


技术研发人员：马光 张雅萍 常红星 姜西娟 孔令晓 马玲燕 李树森
受保护的技术使用者：万华化学集团股份有限公司
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/14