一类靶向细胞内质网的光控焦亡诱导剂的制备及应用

1.本发明涉及化学生物学领域，具体涉及一类靶向细胞内质网的光控焦亡诱导剂的制备方法及其应用。


背景技术：

2.焦亡是一种促炎性的细胞坏死，由人半胱天冬酶1，3，4，5，6，8，9触发，当gasdermin (gsdm) 被半胱天冬酶切割后，n端的活性片段会使得细胞膜穿孔，细胞肿胀并释放出炎性成分。细胞焦亡对多种恶性肿瘤具有明显的抑制效果，因为它对肿瘤细胞的侵袭、增殖和转移发挥着重要的作用。但是引起焦亡的不同信号通路、调控机制及其对于抗肿瘤的意义和区别还需进一步的研究，这也将为肿瘤免疫的精准治疗提供可行的策略。
3.目前焦亡诱导剂大部分存在的问题有多药耐药性，不可控焦亡导致的安全性差等问题。通过产生活性氧 (ros) 引起细胞焦亡是常用的策略之一，具体可以通过产生ros引起线粒体损伤，内质网损伤，溶酶体损伤，细胞膜等损伤进而引发细胞焦亡。因此通过细胞器的靶向可以克服其无法定点引起细胞焦亡的缺点。将光控产生ros引入细胞焦亡可以达到可控定时引起焦亡。因此设计一种光控的细胞器靶向的诱导剂即可解决其多药耐药性、安全性差、可控性差等问题。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一类靶向细胞内质网的光控焦亡诱导剂 (pypss) 的制备及其应用。展示了一种新的光控材料引起gsdme介导焦亡的方法，通过内质网靶向的焦亡诱导剂，在光照下条件下引起多种癌细胞产生ros，继而激活caspase-3，活化的caspase-3可以剪切gsdme形成gsdme的n末端片段 (gsdme-n)，gsdme-n会使得细胞膜穿孔，细胞肿胀并释放出炎性成分，最终导致细胞焦亡。该类焦亡诱导剂在多种癌细胞均能引起焦亡，具有抗肿瘤的应用前景。本发明解决了现有细胞焦亡药物的合成困难，用于治疗过程中的精准性差等技术问题。
5.本发明提供了一类内质网靶向的光控细胞焦亡诱导剂，具有图1所示的结构式。式中，x为i，br，cl，所述不同的焦亡诱导剂分别为pyps-1、pyps-2、pyps-3。上述细胞焦亡诱导剂的制备方法以及反应如图2所示。
6.其中pyps-3的合成路线。
7.化合物1的合成：将多聚磷酸加入两口瓶中随后升温至90
ꢀ°
c搅拌20 min，将乙酰乙酸乙酯和4-叔丁基苯硫酚的混合物滴加到两口瓶中。惰性气体条件下继续反应6 h。反应结束后加入冰水中，用乙酸乙酯萃取，用2% naoh溶液洗，再用饱和氯化钠水溶液洗后干燥旋蒸，柱层析分离得到化合物1。
8.作为优选，乙酰乙酸乙酯和4-叔丁基苯硫酚的摩尔比为1.5：1，所述溶剂为多聚磷酸，多聚磷酸与4-叔丁基苯硫酚的体积比为8-10：1，所述惰性气体为氩气氛围。
9.化合物as的合成：将化合物1和丙二腈溶解于醋酸酐溶剂中加热回流2 h，反应结
束后旋蒸除去溶剂，使用重结晶方式得到化合物as。
10.作为优选，化合物1和丙二腈的摩尔比为1：1.2-1.5。重结晶溶剂为乙醇，得到黄色固体化合物。
11.化合物pyps-3的合成：将化合物as溶于乙醇溶剂中，加入哌啶搅拌反应30min后，继续加入冰醋酸反应10 min，加入化合物d
cl
，随后在油浴锅内升温至85
ꢀ°
c 反应6 h。反应结束后加入二氯甲烷溶解，加入1m hcl水洗，饱和氯化钠洗后干燥有机相。旋蒸除去溶剂，用乙醇作为溶剂进行重结晶纯化，得红色固体化合物。
12.作为优选，化合物as与反应溶剂乙醇的质量体积比为1：8-10 g/ml，除去多余的冰醋酸和哌啶后即可重结晶得到产物。优选地使用乙醇作为重结晶溶剂。
13.作为优选，为了模拟低氧肿瘤环境，将肿瘤细胞置于低氧环境下培养。在常氧条件下 (21% o2) 培养后，细胞被转移到缺氧培养室，并在37
ꢀ°
c的乏氧气体中 (2% o2, 5% co2, 93% n2) 中再培养12 h。在缺氧实验中，细胞培养和处理都是在缺氧培养箱中进行的，所有使用的dmem都预先用混合气体 (2% o2, 5% co2, 93% n2) 起泡5 min。
14.该分子合成简单，合成步骤少，且原料便宜易得，可以大批量合成。as与三个分子di、d
br
、d
cl
得到的三个化合物pyps-1、pyps-2、pyps-3均能够引起细胞焦亡。
15.作为优选，pypss内质网靶向的细胞焦亡诱导剂具有如下特点。
16.(1) 不同于传统的化药焦亡诱导剂，本发明提供的pyps-1、pyps-2、pyps-3是光控焦亡诱导剂，在光照下才能产生超氧阴离子自由基 (o2•−
)。即使在乏氧条件下也能够产生大量的o2•−
，激活caspase-3从而引起细胞焦亡，克服了传统化药焦亡诱导剂的耐药性。
17.(2) 本发明的pyps-1、pyps-2、pyps-3具有良好的内质网共定位作用。在光照下产生的ros导致内质网损伤，引起钙离子外流和线粒体损伤。从而诱导caspase-3的活化，活化的caspase-3能够剪切多种肿瘤细胞中的gsdme，从而引起细胞焦亡。
18.(3) 肿瘤细胞焦亡会释放细胞内容物damps，比如atp，hmgb-1。本发明的pyps-1在常氧和乏氧均能诱导细胞释放damps，而damps能够启动适应性免疫应答，所以该光控焦亡诱导剂具有应用于肿瘤免疫治疗的前景。
附图说明
19.图1为pypss的结构式。
20.图2 为pypss的合成路线。
21.图3为紫外可见吸收光谱图和荧光光谱图。
22.图4所不同ph条件下的紫外可见吸收光谱法图。
23.图5为pypss产生的ros的对比图。
24.图6为pypss产生的超氧阴离子自由基的对比图。
25.图7是用dmpo为捕获剂检测超氧阴离子自由基信号图。
26.图8 为不同浓度的pypss在不同肿瘤细胞中诱导焦亡的明场图。
27.图9为乏氧和常氧条件下不同浓度的pypss在mcf-7细胞中诱导焦亡的明场图。
28.图10为乏氧和常氧条件下pyps-1在mcf-7细胞中产生ros的对比图。
29.图11为pypss在细胞中的定位图。
30.图12为pyps-1在细胞中的钙离子外流的结果图。
31.图13为乏氧和常氧条件下pyps-1诱导细胞线粒体损伤的对比图。
32.图14为pyps-1在细胞中诱导caspase-3活化和激活gsdme蛋白剪切图。
33.图15为pyps-1在细胞中释放hmgb-1结果图。
34.图16为乏氧条件下pyps-1诱导细胞中释放hmgb-1免疫荧光图。
35.图17为乏氧和常氧条件下pyps-1诱导细胞释放atp至细胞外培养基的结果图。
36.图18乏氧和常氧条件pypss的mtt结果图。
实施方式
37.下面结合附图和具体实施例对本发明做出进一步的解释和说明，基于本发明中的实施例，本领域的技术人员，在没有做出创造性的劳动成果下所获得的其他实施例，都属于本发明的保护范围。
38.实施例一：化合物1的合成。
39.将多聚磷酸50 ml在两口圆底烧瓶内混合均匀后，往两口瓶上加放一个冷凝管，另一个瓶口用橡胶塞封住，在 90
ꢀ°
c的油浴锅搅拌20 min后，将4-叔丁基苯硫酚 (34.8 mmol, 6 ml) 和乙酰乙酸乙酯 (41.8 mmol, 5.3 ml ) 混合均匀后用注射器滴加，必须缓慢滴加，否则会发生喷料现象。滴加完后继续反应6 h，用tlc监控反应进程。反应结束后，在磁力搅拌下将物料倒入冰水中。再用 2% naoh将溶液调成 ph9，用乙酸乙酯萃取，随后再用饱和氯化钠洗三次。有机相用无水硫酸钠干燥旋蒸得到液体粗品后直接用柱层析的方法纯化，洗脱剂比例为pe/ea=10: 1 v/v) 得到黄色油状液体1h nmr (400 mhz, cdcl3)δ(ppm) 8.52 (d,j= 2.1 hz, 1h), 7.65 (dd,j= 8.5, 2.1 hz, 1h), 7.50 (d,j= 8.5 hz, 1h), 6.84 (s, 1h), 2.45 (s, 3h), 1.38 (s, 9h).
13
c nmr (100 mhz, cdcl3)δ(ppm) 180.84, 151.04, 150.92, 134.73, 130.38, 129.34, 125.78, 124.84, 124.65, 35.03, 31.21, 23.30.
40.实施例二：pyps-3的合成。
41.将化合物as(500 mg, mmol) 加入到两口烧瓶中，溶解在15 ml的乙醇中，加入哌啶200μl搅拌30 min后加入冰醋酸100μl反应20 min后加入化合物d
cl
，随后在油浴锅内升温至85
ꢀ°
c反应6 h。反应结束后加入二氯甲烷溶解，加入1m hcl水洗三次，饱和氯化钠洗三次后干燥有机相。旋蒸除去溶剂，用乙醇作为溶剂进行重结晶纯化，得红色固体化合物 (260 mg, 91.2 %)。 1
h nmr (400 mhz, dmso-d6)δ10.67 (s, 1h), 8.80 (s, 1h), 7.94
ꢀ–ꢀ
7.83 (m, 4h), 7.72 (d,j = 16.3, 5.8 hz, 1h), 7.61 (d,j= 5.8 hz, 1h), 7.27 (d,j= 16.3, 5.8 hz, 1h), 1.37 (s, 9h).
13
c nmr (100 mhz, dmso-d6)δ(ppm) 155.94, 151.78, 150.81, 148.15, 134.48, 131.90, 130.94, 128.66, 128.46, 128.04, 126.15, 124.52, 123.05, 121.73, 118.04, 116.38, 66.62, 35.76, 31.10. hrms (esi): m/z [m+h]+ calcd for c
24h18
cl2n2os 453.0590, found 453.0586。
[0042]
实施例三：紫外可见吸收光谱图和荧光光谱图。
[0043]
紫外可见吸收光谱图和荧光光谱图均在pbs (5% dmf和0.3% f127，ph=4) 体系中测试所得。
[0044]
实施例四：不同ph条件下的紫外可见吸收光谱图。
[0045]
使用了磷酸氢二钠和柠檬酸为缓冲体系，配置不同的ph缓冲溶液并测试其紫外光
谱。
[0046]
实施例五：在pbs溶液中产生ros比较。
[0047]
qdpbf为ros捕获剂，dhe为超氧阴离子自由基的捕获剂，对比在光照条件下pypss产生ros的区别。以415 nm的变化来评估产生活性氧的能力。实验采用5 mw/cm2的氙灯 (490-700 nm) 为光源，每次光照10 s，总共光照60 s。测试样品溶于pbs (5% dmf, 0.3% f127, ph=7.4)，浓度均为2.5μm。dhe为超氧阴离子自由基为捕获剂时，由于dhe插入dna或者rna才有荧光，所以在溶液中加入了40μg/ml的dna-ct (小牛胸腺dna)，在氙灯光照下，每次光照2 min，总计光照10 min。
[0048]
实施例六：在pbs溶液中产生超氧阴离子自由基的对比。
[0049]
超氧阴离子自由基能够与捕获剂dmpo反应生成dmpo-ooh自由基，而后被顺磁共振波谱仪检测呈现1:1:1:1的四重峰。使用dmpo (100 mm) 为捕获剂，利用epr法测试其信号。将100μm的pypss溶解于dmf中，使用红色led灯 (570-660 nm, 20 mw/cm2)光照3 min后立即后将混合物吸入毛细管封端后测试。epr仪器的相应参数epr的微波频率为 9.8 ghz中心磁场3512 g ，微波功率为20 mw调制频率100 khz调制幅度1 g时间常数 0 .01 ms扫描时间30 s。
[0050]
实施例七：pypss在不同肿瘤细胞内诱导焦亡的明场图。
[0051]
在hela、hepg2、a375和a549肿瘤细胞孵育pypss 2 h后，使用氙灯光照10 min后放置在恒温培养箱中2 h后，取出培养皿在荧光细胞成像仪中观察形貌变化。结果如图8所示，该内质网靶向的焦亡诱导剂能够引起细胞肿胀，细胞穿孔后并发生出泡现象。在常氧和乏氧条件下，pypss都能诱导mcf-7细胞产生焦亡。
[0052]
实施例八：pyps-1在mf-7细胞内响应前后产生ros比较。
[0053]
先将mcf-7细胞在37
ꢀ°
c 共聚焦小皿培养常氧条件孵育贴壁。分别在常氧或乏氧条件给药pyps-1 (1μm) 继续孵育，随后加入dcfda 和dhe孵育后。用氙灯光照 10 min后，用共聚焦激光扫描显微镜 (clsm) 对其进行成像。
[0054]
实施例九：pypss在细胞中的定位图。
[0055]
在mcf-7细胞中孵育pypss 2 h后，加入商用的内质网靶向的绿色探针pypss 30 min后用pbs洗三次。用共聚焦激光扫描显微镜 (clsm) 对其进行成像。实验结果如图11所示，内质网靶向的具有红色荧光的pypss和商用内质网靶向的绿色荧光探针高度重合，说明大部分pypss富集在细胞的内质网中。
[0056]
实施例十：pyps-1在细胞中的钙离子外流的结果图。
[0057]
mcf-7细胞孵育于35 mm共聚焦培养皿上24 h。pyps-1孵育2 h后，pbs洗涤3次，加入fluo-3 am (2.0μm) 继续孵育30 min，用pbs洗涤三次，然后用灯光照 (氙灯, 490-700 nm, 10 mw/cm2) 10 min。pbs洗涤后立即用clsm成像。ex/em: 488/500-550 nm。
[0058]
实施例十一：乏氧和常氧条件下pyps-1诱导细胞线粒体损伤的对比图。
[0059]
线粒体膜电位 (δψm) 通过使用jc-1作为荧光探针来评估。在mcf-7细胞用pyps-1 (1.0
µ
m) 孵育2 h，用pbs洗涤并置于光照射(xe灯, 490-700 nm, 10 mw/cm2) 5 min。继续孵育30 min后，加入jc-1探针溶液 (5.0
µ
g/ml) 并染色30 min。jc-1/聚集体红色荧光通道：ex/em 543/560-600 nm；jc-1/单体绿色荧光通道：ex/em 488/500-530 nm。
[0060]
实施例十二：pyps-1在细胞中诱导caspase-3活化，激活gsdme蛋白剪切，释放
hmgb-1的结果图。
[0061]
mcf-7细胞接种于35 mm培养皿中，与pyps-1孵育2 h并在常氧或低氧条件下进行光照后，继续培养3 h后，用冷pbs洗涤细胞，提取细胞中的蛋白并进行蛋白免疫印迹法检测caspase-3的活化，gsdme的剪切以及hmgb-1的释放。
[0062]
实施例十三：乏氧条件下pyps-1诱导细胞中释放hmgb-1免疫荧光图。
[0063]
mcf-7细胞接种于35 mm的共聚焦培养皿中，与pyps-1孵育2 h，并在常氧或低氧条件下进行光照后，继续培养3 h后，用pbs清洗细胞，用4%多聚甲醛固定15 min。然后用pbs洗掉固定液，用0.1% triton x-100孵育 15分钟使细胞通透。然后用2% bsa孵育细胞 30 min，用一抗在4
ꢀ°
c孵育过夜，再用alexa fluor 488山羊抗兔igg孵育1 h。然后用hoechst 33342孵育15 min。用pbs洗涤后，最后一步使用抗荧光猝灭剂。利用clsm获得荧光图像。ex/em: 488/500-550 nm。
[0064]
实施例十四：乏氧和常氧条件下pyps-1诱导细胞释放atp至细胞外培养基的结果图。
[0065]
mcf-7细胞接种于96孔板中，在常氧或缺氧条件下孵育24 h。然后，与pyps-1孵育2 h。用pbs洗涤后，将细胞置于光照射 (xe灯, 490-700 nm, 10 mw/cm2) 下10 min。37
ꢀ°
c孵育1 h，4
ꢀ°
c孵育2 h后，将孔板中的培养基转移至96孔白色底板上，用荧光素酶atp assay kit检测细胞外atp。
[0066]
实施例十五：常氧和乏氧条件下pypss处理下细胞的mtt的比较。
[0067]
以pyps-1为例说明，37
ꢀ°
c下mcf-7细胞在96孔板中培养常氧条件孵育贴壁。分别在常氧或乏氧条件下给药孵育，在光照10 min后继续孵育12 h，随后加入mtt 孵育4 h，最终加入dmso溶解晶体，用酶标仪测试96孔板的吸收值。图18的实验结果可知常氧条件和乏氧均表现出优异的pdt作用。
[0068]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使用本技术领域的研究人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，对这些实施例进行的多种修改，这些修改应该视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一类内质网靶向的光控细胞焦亡诱导剂的结构具有图1所示的结构式；式中，x为i，br，cl，分别为pyps-1、pyps-2、pyps-3。2.一类制备权利要求1所述的内质网靶向的光控细胞焦亡诱导剂的合成路线如图2所示。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤一选用多聚磷酸作为反应溶剂从而得到化合物1；步骤二中化合物1和丙二腈的摩尔比为1：1.2-1.5，使用乙醇重结晶得到产物a
s
；步骤三中在乙醇溶剂中，化合物a
s
和化合物d
x
在加入哌啶冰醋酸的条件下反应得到粗产物，随后使用乙醇为重结晶溶剂得到内质网靶向的光控细胞焦亡诱导剂。4. 根据权利要求1所示的结构，本发明提供了一种新的光控材料引起gsdme介导焦亡的方法，其特征在于通过靶向内质网的细胞焦亡诱导剂，在光照下条件下引起多种癌细胞产生ros，继而激活caspase-3，活化的caspase-3可以剪切gsdme形成gsdme的n末端片段 (gsdme-n)，gsdme-n会使得细胞膜穿孔，细胞肿胀并释放出炎性成分，最终导致细胞焦亡。5.根据权利要求4所述，本发明提供的一类光控焦亡诱导剂能够产生ros激活caspase-3，其特征在于，靶向内质网后产生超氧阴离子自由基，引起内质网损伤，导致钙离子外流和线粒体的损伤，最终激活caspase-3。6.根据权利要求4所述，该类光控焦亡诱导剂在常氧和乏氧条件下也同样能够诱导肿瘤细胞发生焦亡，其在不同的肿瘤细胞均能有效的引起细胞焦亡，其特征在于，引起肿瘤细胞焦亡的分别为mcf-7、hela、hepg2、a375和a549细胞。7.根据权利要求4所述的一类内质网靶向的光控细胞焦亡诱导剂，在不同肿瘤细胞上抗肿瘤的药物应用。8.据权利要求7所述的应用，其特征在于，常氧乏氧条件下均会诱导肿瘤细胞释放atp和hmgb-1。

技术总结
本发明提供了一类靶向细胞内质网的光控焦亡诱导剂(PyPSs)的制备及其应用。展示了一种新的光控材料引起GSDME介导焦亡的方法，通过内质网靶向的焦亡诱导剂，在光照下条件下引起多种癌细胞产生ROS，继而激活caspase-3，活化的caspase-3可以剪切GSDME形成GSDME的N末端片段(GSDME-N)，GSDME-N会使得细胞膜穿孔，细胞肿胀并释放出炎性成分，最终导致细胞焦亡。该类焦亡诱导剂在常氧和乏氧条件下均能引起多种癌细胞焦亡，在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。应用前景。


技术研发人员：李昌华 张永康 王亚铭
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/9/14