一种肌酸激酶同工酶抗体及线粒体CK检测试剂盒的制作方法

一种肌酸激酶同工酶抗体及线粒体ck检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种肌酸激酶同工酶抗体以及基于该抗体的线粒体肌酸激酶检测试剂盒。


背景技术：

2.肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，ck)是一类重要的酶，在维持细胞内能量代谢平衡方面发挥着重要作用。肌酸激酶同工酶是二聚体酶，其结构由肌型亚单位(m)和脑型亚单位(b)两个亚基组成，根据其亚基组成不同，可分为ck-mm、ck-mb、ck-bb和线粒体ck(mtck)四种同工酶形式。ckmm主要存在于骨骼肌和心肌中，ckmb主要存在于心肌中，ckbb则存在于脑组织和神经元中。其中，ckmb在临床诊断中有重要的应用，例如，心肌梗死时，心肌细胞会释放出ck-mb型同工酶。因此，测定血清中ck-mb水平可作为心肌损伤的指标。
3.线粒体ck主要分布于心肌、平滑肌和神经组织等高能耗组织中的线粒体内，对于这些组织维持正常的能量代谢具有重要作用。线粒体ck由两个亚基组成，每个亚基都有一个肌酸结合位点和一个atp结合位点。通过肌酸和atp的相互作用，线粒体ck可以在高能磷酸化物的储备和释放之间起到平衡作用，保证细胞内的能量供应。此外，线粒体ck还可以调节线粒体内钙离子的浓度，维持线粒体内环境的稳定。线粒体ck在多种疾病中发挥着重要作用。例如，在心肌缺血再灌注损伤中，线粒体ck可以通过调节能量代谢和钙离子平衡来保护心肌细胞免受氧化应激和细胞死亡的影响。
4.近年来，研究人员发现线粒体ck在肿瘤诊断上具有重要的应用价值。线粒体ck在正常组织中的表达很低，而在多种癌症组织中表达显著增加。例如，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌、肝癌等多种恶性肿瘤中，线粒体ck的表达均明显高于正常组织。因此，线粒体ck可以作为一种肿瘤标志物，用于肿瘤的早期诊断和预后评估。此外，线粒体ck在肿瘤治疗中也具有重要的应用价值。研究表明，线粒体ck的表达水平与肿瘤的恶性程度和预后密切相关。因此，通过监测血清中线粒体ck的水平，可以反应肿瘤病人在治疗后的术后恢复状况，从而对肿瘤的治疗过程进行监测。
5.近年来，还有研究表明线粒体ck在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用价值。线粒体ck可以影响肿瘤细胞的代谢和能量转移，从而影响肿瘤细胞的生长和增殖。因此，通过调节线粒体ck的表达水平，可以提高肿瘤细胞对免疫治疗的敏感性，从而提高治疗效果。总之，线粒体ck在肿瘤诊断、治疗和免疫治疗中具有重要的应用价值。未来，随着对线粒体ck的深入研究，相信会有更多的应用场景被发掘出来，为肿瘤治疗带来更多的希望。
6.然而，目前临床上还未有针对血清中线粒体ck水平检测的试剂盒，究其原因主要在于以下两方面：(1)还未深刻意识到线粒体ck水平检测的重要性，因而未深入研究；(2)若想对血清中线粒体ck水平进行检测，利用现有技术难以排除ckmm、ckmb、ckbb的干扰，导致检测结果准确性无法保证。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够完全阻断ckmm、ckmb、ckbb酶学活性的肌酸激酶同工酶抗体以及基于该抗体制备的线粒体ck检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高、特异性好，可实现临床上线粒体ck的定量、准确检测。
8.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
9.一种肌酸激酶同工酶抗体，包括轻链和重链；所述轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示，重链的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.作为本发明的优选方式之一，所述肌酸激酶同工酶抗体的轻链，包括轻链可变区vl和轻链恒定区cl；其中，所述轻链可变区vl的氨基酸序列如seq id no.3所示，轻链恒定区cl的氨基酸序列如seq id no.4所示。
11.作为本发明的优选方式之一，所述轻链可变区vl包括lcdr1、lcdr2、lcdr3三个可变区，氨基酸序列分别为seq id no.5～seq id no.7所示。
12.作为本发明的优选方式之一，所述肌酸激酶同工酶抗体的重链，包括重链可变区vh和重链恒定区ch；其中，所述重链可变区vh的氨基酸序列如seq id no.8所示，重链恒定区ch的氨基酸序列如seq id no.9所示。
13.作为本发明的优选方式之一，所述重链可变区vh包括hcdr1、hcdr2、hcdr3三个可变区，氨基酸序列分别如seq id no.10～seq id no.12所示。
14.作为本发明的优选方式之一，所述肌酸激酶同工酶抗体能够同时结合ckmm、ckmb、ckbb蛋白，并阻断ckmm、ckmb、ckbb的酶学活性。
15.一种线粒体ck检测试剂盒，包括上述肌酸激酶同工酶抗体。
16.作为本发明的优选方式之一，所述线粒体ck检测试剂盒具体包括试剂r1和试剂r2；
17.所述试剂r1包括：30～70ug/ml肌酸激酶同工酶抗体，1～5g/l醋酸镁，1～10g/l咪唑，1～10g/l葡萄糖，0.1～1g/l硫代硫酸钠，0.1～1g/l乙二胺四乙酸二钠，0.5～5g/l二磷酸腺苷，1～5g/l一磷酸腺苷，1～10g/l n-乙酰半胱氨酸，1～5g/l氧化型辅酶i，1～50mg/l二腺苷五磷酸，1～10ku/l己糖激酶，1～10ku/l葡萄糖6磷酸脱氢酶，0.1～1g/l防腐剂yk300；
18.所述试剂r2包括：1～10g/l capso缓冲液，0.1～2g/l氢氧化钠，1～10g/l葡萄糖，30～100g/l肌酸磷酸，0.1～1g/l防腐剂yk300。
19.作为本发明的优选方式之一，还包括校准品。
20.作为本发明的优选方式之一，所述校准品包括：0.1～1g/l叠氮钠，0.5～10g/l牛血清白蛋白，30～500u/l线粒体肌酸激酶同工酶，1～10g/l ph值为7.5的tris-hcl缓冲液，10～100g/l甘油。其中，线粒体肌酸激酶同工酶可直接选择市售产品，例如，安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人mtck”，来源于hek293细胞，人，纯度≥95％，货号：ag02601；也可采用现有市场的其他体外真核系统表达并纯化的重组人mtck蛋白。
21.作为本发明的优选方式之一，所述线粒体ck检测试剂盒具体包括试剂r1、试剂r2和校准品；
22.所述试剂r1包括：50ug/ml本发明肌酸激酶同工酶抗体，3g/l醋酸镁，8g/l咪唑，5g/l葡萄糖，0.25g/l硫代硫酸钠，0.79g/l乙二胺四乙酸二钠，1.3g/l二磷酸腺苷，3g/l一
磷酸腺苷，5g/l n-乙酰半胱氨酸，2.5g/l氧化型辅酶i，13mg/l二腺苷五磷酸，3ku/l己糖激酶，3ku/l葡萄糖6磷酸脱氢酶，0.5g/l防腐剂yk300；
23.所述试剂r2包括：5g/l capso缓冲液，0.8g/l氢氧化钠，5g/l葡萄糖，50g/l肌酸磷酸，0.5g/l防腐剂yk300；
24.所述校准品包括：0.5g/l叠氮钠，5g/l牛血清白蛋白，120u/l线粒体肌酸激酶同工酶，5g/l ph值为7.5的tris-hcl缓冲液，50g/l甘油。
25.本发明的线粒体ck检测试剂盒可在半自动、全自动生化分析仪上用于定量检测人体血液中线粒体ck的活性，其中所述血液包括全血、血清及血浆。
26.检测原理：如图1所示。
27.本发明相比现有技术的优点在于：
28.(1)本发明肌酸激酶同工酶抗体，亲和力高，能够有效完全阻断ckmm、ckmb、ckbb酶学活性，市场上目前并无同类在售产品；
29.(2)本发明试剂盒为第一个能够定量检测出临床血液中人线粒体ck活性的试剂盒，且具有操作简单、可自动化、灵敏度高、特异性好的特点；对临床样本的检测结果经统计分析，本发明试剂盒可有效的排除血液中ckmm、ckmb、ckbb对线粒体ck(mtck)检测的干扰，使最终检测结果准确可靠，能够广泛应用于临床诊断。
附图说明
30.图1是本发明检测原理图；
31.图2是实施例2中抗体ck14与ckmm/ckmb/ckbb抗原亲和力elisa检测结果图；
32.图3是试验例2中本发明检测试剂盒的线性范围相关性图。
具体实施方式
33.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
34.以下实施例中的所使用的试剂产品及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。
35.实施例1
36.本实施例的一种肌酸激酶同工酶抗体ck14，由轻链和重链构成，所述轻链氨基酸序列如seq id no.1所示，重链氨基酸序列如seq id no.2所示。
37.具体地，本实施例中，所述轻链包括轻链可变区vl和轻链恒定区cl；其中，轻链可变区vl的氨基酸序列如seq id no.3所示，轻链恒定区cl的氨基酸序列如seq id no.4所示。更具体地，轻链可变区vl包括lcdr1、lcdr2、lcdr3三个可变区，氨基酸序列分别为seq id no.5～seq id no.7所示。
38.具体地，本实施例中，所述重链包括重链可变区vh和重链恒定区ch；其中，重链可变区vh的氨基酸序列如seq id no.8所示，重链恒定区ch的氨基酸序列如seq id no.9所示。更具体地，重链可变区vh包括hcdr1、hcdr2、hcdr3三个可变区，氨基酸序列分别如seq id no.10～seq id no.12所示。
39.实施例2
40.本实施例的一种上述肌酸激酶同工酶抗体ck14的获得：
41.(1)cho-k1-ck14稳定细胞株的构建
42.细胞复苏：取一支液氮冻存cho细胞(约1x10e7细胞)，37℃水浴快速融化，300g，离心5min。用酒精棉擦拭冻存管后置于超净工作台，吸出上清，用20ml预温的cho完全培养基重悬，并置于125ml摇瓶培养，37℃培养温度，5％co2，120～130rpm转速。
43.质粒抽提：提前接种“含肌酸激酶同工酶抗体ck14稳转载体的dh5a菌株”(生物公司基因合成，肌酸激酶同工酶抗体ck14的氨基酸序列如实施例1所述)，并于37℃培养过夜，用商业化质粒抽提试剂盒抽提pxc17.4-ck14稳转质粒。
44.细胞转染：细胞活率大于95％、无明显细胞聚团、密度在2到3x 10e6时，取4x 10e7 cho细胞，300g、离心5min。去除上清，用celetrix商业化电转液400ul重悬cho细胞。pxc17.4-ck14稳转质粒使用25ug，分别消耗cho细胞2x10e7。用celetrix细胞电转仪1250v电压下进行电转。
45.细胞恢复及加压：转染后的细胞用cho完全培养基重悬，并在37℃、5％ co2培养箱中静置恢复24h。恢复后的细胞300g、离心5min。去除培养基后，加入cho培养基，并添加25um msx，细胞密度为1x10e6。37℃、5％ co2培养箱中静置8～10天，至细胞活率大于30％。
46.单克隆筛选：将细胞活率大于30％的细胞池用“康晟商业化单克隆培养基”稀释至2.5cell/ml，200ul/孔铺96孔板，共30块板。37℃、5％ co2培养箱中静置培养至单克隆长满孔。将表达量高的单克隆转移至摇瓶扩大培养，将最终确定的单克隆构建cho-k1工作细胞库(其内为cho-k1-ck14工作细胞株)，并冻存于液氮罐中，用于后续抗体的表达。
47.(2)cho-k1悬浮表达系统表达“肌酸激酶同工酶抗体ck14”48.细胞复苏：从液氮罐中取出步骤(1)构建的cho-k1-ck14工作细胞株，37℃水浴快速解冻后，用cho细胞培养基重悬细胞，并放入细胞培养摇床中培养复苏48h。
49.细胞转接及流加培养：细胞恢复后，将细胞转接至发酵培养基中，密度0.5x10e6。培养至day5，开始流加补料，到day7降温培养。
50.上清收取：培养至day15或细胞活率低于60％，将培养上清离心，去除细胞沉淀，保留上清。
51.(3)亲和纯化“肌酸激酶同工酶抗体ck14”52.亲和柱装填：计算所需商品化的protein a填料，并将填料进行装柱，将装柱的填料用pbs平衡缓冲液进行清洗。
53.上样及清洗：将离心收集的细胞上清低流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗10个柱体积，用ph5.0的预洗脱液a清洗10个柱体积。
54.洗脱与中和：将预洗脱液清洗后的填料，用ph3.2的柠檬酸洗脱液进行洗脱，洗脱后的蛋白用2m的tris缓冲液进行中和，将中和后的抗体溶液测定蛋白浓度后透析换液至pbs中并分装保存。
55.(4)“肌酸激酶同工酶抗体ck14”的elisa亲和力检测
56.铺板：ckmm、ckmb、ckbb蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至浓度0.5ug/ml，以100ul/孔加入至elisa板中，4℃静置过夜。
57.封闭：用pbs+0.1％吐温20清洗液清洗elisa板3遍后，加入pbst+2.5％脱脂奶粉封
闭液，加入量为200ul/孔，37℃封闭1h。
58.一抗结合：用pbs+0.1％吐温20清洗液清洗elisa板3遍，用pbst+2.5％脱脂奶粉稀释抗体，首孔浓度1ug/ml，3倍梯度稀释，共8个梯度。将稀释好的抗体加入到elisa板中，加入量为100ul/孔，37℃孵育2h。
59.二抗结合：用pbs+0.1％吐温20清洗液清洗elisa板3遍，用pbst+2.5％脱脂奶粉稀释羊抗人fc-hrp二抗。将稀释好的抗体加入到elisa板中，加入量为100ul/孔，37℃孵育1h。
60.显色：用pbs+0.1％吐温20清洗液清洗elisa板3遍，加入opd显色液，加入量为100ul/孔。显色5～15min后，每孔加入100ul 2m h2so4进行终止，并用酶标仪在波长od450下进行检测。将检测结果用graphpad进行处理，处理结果见图2。由图2可知：肌酸激酶同工酶抗体ck14分别与ckmm、ckmb、ckbb有很好的结合活性，且抗体的ec50范围在10～50ng/ml。
61.实施例3
62.本实施例的一种线粒体ck检测试剂盒，包括试剂r1、试剂r2和校准品。
63.试剂r1包括：30ug/ml肌酸激酶同工酶抗体(实施例2制得)，1g/l醋酸镁，1g/l咪唑，1g/l葡萄糖，0.1g/l硫代硫酸钠，0.1g/l乙二胺四乙酸二钠，0.5g/l二磷酸腺苷，1g/l一磷酸腺苷，1g/l n-乙酰半胱氨酸，1g/l氧化型辅酶i，1mg/l二腺苷五磷酸，1ku/l己糖激酶，1ku/l葡萄糖6磷酸脱氢酶，0.1g/l防腐剂yk300。
64.试剂r2包括：1g/l capso缓冲液，0.1g/l氢氧化钠，1g/l葡萄糖，30g/l肌酸磷酸，0.1g/l防腐剂yk300。
65.校准品包括：0.1g/l叠氮钠，0.5g/l牛血清白蛋白，30u/l线粒体肌酸激酶同工酶，1g/l ph值为7.5的tris-hcl缓冲液，10g/l甘油。其中，线粒体肌酸激酶同工酶采用安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人mtck”，来源于hek293细胞，人，纯度≥95％，货号：ag02601。
66.制备方法：
67.(1)配制试剂r1：
68.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
69.(2)配制试剂r2：
70.按照试剂r2的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r2；
71.(3)配制校准品：
72.按照校准品的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂校准品。
73.实施例4
74.本实施例的一种线粒体ck检测试剂盒，包括试剂r1、试剂r2和校准品。
75.试剂r1包括：50ug/ml本发明肌酸激酶同工酶抗体，3g/l醋酸镁，8g/l咪唑，5g/l葡萄糖，0.25g/l硫代硫酸钠，0.79g/l乙二胺四乙酸二钠，1.3g/l二磷酸腺苷，3g/l一磷酸腺苷，5g/l n-乙酰半胱氨酸，2.5g/l氧化型辅酶i，13mg/l二腺苷五磷酸，3ku/l己糖激酶，3ku/l葡萄糖6磷酸脱氢酶，0.5g/l防腐剂yk300。
76.试剂r2包括：5g/l capso缓冲液，0.8g/l氢氧化钠，5g/l葡萄糖，50g/l肌酸磷酸，0.5g/l防腐剂yk300。
77.校准品包括：0.5g/l叠氮钠，5g/l牛血清白蛋白，120u/l线粒体肌酸激酶同工酶，
5g/l ph值为7.5的tris-hcl缓冲液，50g/l甘油。其中，线粒体肌酸激酶同工酶采用安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人mtck”，来源于hek293细胞，人，纯度≥95％，货号：ag02601。
78.制备方法：
79.(1)配制试剂r1：
80.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
81.(2)配制试剂r2：
82.按照试剂r2的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r2；
83.(3)配制校准品：
84.按照校准品的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂校准品。
85.实施例5
86.本实施例的一种线粒体ck检测试剂盒，包括试剂r1、试剂r2和校准品。
87.试剂r1包括：70ug/ml肌酸激酶同工酶抗体(实施例2制得)，5g/l醋酸镁，10g/l咪唑，10g/l葡萄糖，1g/l硫代硫酸钠，1g/l乙二胺四乙酸二钠，5g/l二磷酸腺苷，5g/l一磷酸腺苷，10g/l n-乙酰半胱氨酸，5g/l氧化型辅酶i，50mg/l二腺苷五磷酸，10ku/l己糖激酶，10ku/l葡萄糖6磷酸脱氢酶，1g/l防腐剂yk300。
88.试剂r2包括：10g/l capso缓冲液，2g/l氢氧化钠，10g/l葡萄糖，100g/l肌酸磷酸，1g/l防腐剂yk300。
89.校准品包括：1g/l叠氮钠，10g/l牛血清白蛋白，500u/l线粒体肌酸激酶同工酶，10g/l ph值为7.5的tris-hcl缓冲液，100g/l甘油。其中，线粒体肌酸激酶同工酶采用安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人mtck”，来源于hek293细胞，人，纯度≥95％，货号：ag02601。
90.制备方法：
91.(1)配制试剂r1：
92.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
93.(2)配制试剂r2：
94.按照试剂r2的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r2；
95.(3)配制校准品：
96.按照校准品的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂校准品。
97.试验例1
98.本试验例用于测试本发明肌酸激酶同工酶抗体ck14对ckmm、ckmb、ckbb蛋白的酶学活性抑制效果。
99.分别利用“本发明线粒体ck检测试剂盒”(添加有肌酸激酶同工酶抗体ck14)和“对照试剂盒”(不添加抗体ck14)对样本5000u/l-ckmm、2500u/l-ckmm、1250u/l-ckmm、625u/l-ckmm、312.5u/l-ckmm、样本5000u/l-ckmb、2500u/l-ckmb、1250u/l-ckmb、625u/l-ckmb、312.5u/l-ckmb、样本5000u/l-ckbb、2500u/l-ckbb、1250u/l-ckbb、625u/l-ckbb、312.5u/l-ckbb进行检测。其中，“本发明线粒体ck检测试剂盒”具体选择实施例4制备的试剂盒，“对
照试剂盒”对应选择不添加肌酸激酶同工酶抗体ck14、但其他成分与实施例4一致的试剂盒(可检测样本里的总ck)。
100.检测仪器：全自动生化仪au680。
101.检测方法为：测定主波长340nm，副波长405nm；先加入r1试剂200ul，37℃孵育30s；加入样本10ul，37℃反应60s；加入r2试剂50ul，37℃反应60s；反应类型速率法，反应5min，测定时间3min。具体参数见表1。
102.检测结果见表2。
103.表1、生化分析仪检测方法
104.校准方式线性反应方向上升主波长340nm副波长405nm反应类型速率法样本10ul反应温度37℃试剂r1200ul校准方法：2点定标试剂r250ul反应时间5minr1:r24:1延迟时间2min测定时间3min
105.表2、本发明及对照试剂对ckmm、ckmb、ckbb的检测结果
106.[0107][0108]
由表2可知：本发明肌酸激酶同工酶抗体ck14，能够对酶活5000u/l以内的ckmm、ckmb、ckbb的抑制率在99.9％以上。
[0109]
试验例2
[0110]
本试验例用于测试本发明线粒体ck检测试剂盒(以实施例4试剂盒为例)的整体性能。
[0111]
一、生化分析仪检测方法：
[0112]
以贝克曼au680生化分析仪为例：测定主波长340nm，副波长405nm；先加入r1试剂200ul，37℃孵育30s；加入样本10ul，37℃反应60s；加入r2试剂50ul，37℃反应60s；反应类型速率法，反应5min，测定时间3min。具体参数见上述表1。
[0113]
试验结果计算公式：mtck(u/l)＝δa/min
×
k；其中，δa/min：每分钟平均吸光度的变化；ε：毫摩尔消光系数＝6.3mmoll/l.cm；tv：总反应体积(μl)；sv：样本体积(μl)；l：比色杯光径(cm)。
[0114]
取待测血清或血浆样本，同法测定样本的吸光度变化值，代入公式，即可算出待测样本中线粒体肌酸激酶mtck的酶活。如果样本中的mtck酶活超出检测线性范围，需要对待测样本进行稀释后再检测，从而确保检测结果的准确性。
[0115]
二、灵敏度检测：
[0116]
5％牛血清白蛋白溶液为空白样本，按照上述生化分析仪检测方法反复测定20次以上，以空白均值加上两倍标准差作为最低检测限，结果显示本发明试剂盒的最低检测限
为0.2u/l。
[0117]
三、线性范围检测：
[0118]
用接近酶活3000u/l的高值样本，用生理盐水按照1/1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256稀释，共配制成9个梯度稀释浓度的样本溶液，用所述生化分析仪检测方法测定每个稀释的样本浓度。每个浓度重复测定3次，分别求出测定结果的平均值。
[0119]
以稀释浓度为自变量，以测定结果平均值为因变量求出线性回归方程，按照相应公式计算线性回归相关系数r。检测结果见表3，证明线性性能达到3000u/l，相关方程为y＝1.0396x-4.9266，相关系数r2＝0.9999，见图3。
[0120]
表3、本发明试剂盒线性范围检测
[0121][0122][0123]
四、重复性和精密度：
[0124]
线粒体肌酸激酶的活性为20u/l与100u/l的校准品作为样本，按所述生化分析仪检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，结果见表4。
[0125]
表4、线粒体肌酸激酶试剂盒的重复性和精密度检测
[0126][0127][0128]
由表4可知：线粒体肌酸激酶试剂盒的重复性及准确性都能达到临床应用的要求。
[0129]
五、批间差：
[0130]
按照本发明实施例4配方及方法制备三批试剂盒，用三批试剂盒按所述生化分析仪检测方法对同一份血清样本进行重复测定，每个批次重复测定三次，分别计算每批3次测定的均值，结果见表5。
[0131]
表5、线粒体肌酸激酶试剂盒的批间差检测
[0132][0133]
由表5可知：三个批次的线粒体肌酸激酶试剂盒的批间差较小相对偏差小于5％。
[0134]
六、临床样本检测
[0135]
取20例临床血清，分别用本发明线粒体ck检测试剂盒、大千生物商品化的ck检测试剂盒、ckmb酶法检测试剂盒，按照所述生化分析仪检测方法对临床样本进行检测，检测结果见表6。
[0136]
表6、临床样本检测
[0137][0138][0139]
由表6可知：本发明试剂盒能够检测出血液中的mtck含量，并且能够帮助排除临床检测ckmb活性时可能出现的假阳性，而且这种假阳性一般由血液中的mtck或ckbb含量异常导致。
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以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，包括轻链和重链；所述轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示，重链的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，所述肌酸激酶同工酶抗体的轻链，包括轻链可变区vl和轻链恒定区cl；其中，所述轻链可变区vl的氨基酸序列如seq id no.3所示，轻链恒定区cl的氨基酸序列如seq id no.4所示。3.根据权利要求2所述的肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，所述轻链可变区vl包括lcdr1、lcdr2、lcdr3三个可变区，氨基酸序列分别为seq id no.5～seq id no.7所示。4.根据权利要求1所述的肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，所述肌酸激酶同工酶抗体的重链，包括重链可变区vh和重链恒定区ch；其中，所述重链可变区vh的氨基酸序列如seq id no.8所示，重链恒定区ch的氨基酸序列如seq id no.9所示。5.根据权利要求4所述的肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，所述重链可变区vh包括hcdr1、hcdr2、hcdr3三个可变区，氨基酸序列分别如seq id no.10～seq id no.12所示。6.根据权利要求1～5任一所述的肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，所述肌酸激酶同工酶抗体能够同时结合ckmm、ckmb、ckbb蛋白，并阻断ckmm、ckmb、ckbb的酶学活性。7.一种线粒体ck检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～6任一所述的肌酸激酶同工酶抗体。8.根据权利要求7所述的线粒体ck检测试剂盒，其特征在于，所述线粒体ck检测试剂盒具体包括试剂r1和试剂r2；所述试剂r1包括：30～70ug/ml肌酸激酶同工酶抗体，1～5g/l醋酸镁，1～10g/l咪唑，1～10g/l葡萄糖，0.1～1g/l硫代硫酸钠，0.1～1g/l乙二胺四乙酸二钠，0.5～5g/l二磷酸腺苷，1～5g/l一磷酸腺苷，1～10g/l n-乙酰半胱氨酸，1～5g/l氧化型辅酶i，1～50mg/l二腺苷五磷酸，1～10ku/l己糖激酶，1～10ku/l葡萄糖6磷酸脱氢酶，0.1～1g/l防腐剂yk300；所述试剂r2包括：1～10g/l capso缓冲液，0.1～2g/l氢氧化钠，1～10g/l葡萄糖，30～100g/l肌酸磷酸，0.1～1g/l防腐剂yk300。9.根据权利要求8所述的线粒体ck检测试剂盒，其特征在于，还包括校准品。10.根据权利要求9所述的线粒体ck检测试剂盒，其特征在于，所述校准品包括：0.1～1g/l叠氮钠，0.5～10g/l牛血清白蛋白，30～500u/l线粒体肌酸激酶同工酶，1～10g/l ph值为7.5的tris-hcl缓冲液，10～100g/l甘油。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，提供了一种肌酸激酶同工酶抗体，包括轻链和重链；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了一种线粒体CK检测试剂盒，包所述肌酸激酶同工酶抗体。本发明的优点在于：本发明肌酸激酶同工酶抗体，亲和力高，能够有效完全阻断CKMM、CKMB、CKBB酶学活性；本发明试剂盒操作简单、可自动化、灵敏度高、特异性好，可有效的排除血液中CKMM、CKMB、CKBB对线粒体CK检测的干扰，使检测结果准确可靠。测结果准确可靠。测结果准确可靠。


技术研发人员：周伟 刘浩 李燕华 鲍文英 芮双印
受保护的技术使用者：安徽千诚生物技术有限公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/14