用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的新型组合物

1.本发明涉及一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的新型组合物，其包含作为活性成分的来源于金黄色葡萄球菌的毒素的特定组合。
2.

背景技术：

3.金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种革兰氏阳性菌，可引起人体皮肤、软组织和血流的严重感染，并可能通过多种途径演变成耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)，其对β-内酰胺类抗生素甲氧西林具有耐药性。mrsa感染治疗困难，预后差，社会成本高。
4.金黄色葡萄球菌(s.aureus)双组分杀白细胞素(bcl)是一种重要的毒力因子，属于成孔毒素(pft)家族。每个bcl都有两个亚基，分类为宿主细胞靶向s成分(用于色谱柱中的缓慢迁移：luks-pv、luke、hlga、hlgc和luka)和聚合f成分(用于色谱柱中的快速迁移：lukf-pv、lukd、hlgb和lukb)。另一方面，lukab作为预组装的可溶性异质二聚体分泌，金黄色葡萄球菌的α-毒素(hla)是形成β-桶pft的单一成分。
5.金黄色葡萄球菌bcl毒素和hla通过与宿主细胞表面特异性表达的受体结合，诱导宿主细胞(例如中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和红细胞(rbc))溶解。luksf-pv和hlgcb使用c5ar1和c5ar2作为受体，luked用ccr5、cxcr1和cxcr2作为受体，以及hlgab和luked用cxcr1和cxcr2作为受体，但也可能用ccr2和darc(趋化因子duffy受体)受体，同时lukab与cd11b结合。hla识别在rbc、上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞(如中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和t细胞)的细胞膜中表达的adam10蛋白。
6.迄今为止，为预防侵袭性金黄色葡萄球菌感染而开发的疫苗的所有人体临床试验都失败了。尽管大多数疫苗产生了针对金黄色葡萄球菌表面抗原的高滴度调理素抗体，但由于对宿主免疫机制和金黄色葡萄球菌感染机制的不完全了解以及缺乏能够诱导人类对金黄色葡萄球菌的可持续长期免疫，它们最终没有被开发成有效的疫苗。
7.最近，已采用两种新方法来开发金黄色葡萄球菌疫苗。第一种方法是使用金黄色葡萄球菌表面抗原通过免疫产生的抗体诱导调理吞噬作用。产生的抗体有望与细菌表面结合并杀死细菌，但这些基于调理素抗体的候选疫苗在临床试验中无效，一些候选疫苗在实际发生金黄色葡萄球菌感染时显示出有害结果(fowler vg等人,2013,jama 309:1368-78)。另一种方法是使用金黄色葡萄球菌类毒素作为候选疫苗，这种策略是通过用多种类毒素抗原免疫来诱导中和抗体。
8.据报道，共有11种成分(包括5种金黄色葡萄球菌bcl和hla(α-毒素))特异性识别5种不同的受体家族，即趋化因子受体、补体受体、cd11b受体、darc受体和adam 10受体，它们分别在宿主细胞和红细胞中表达(wilke ga等,2010,美国科学院院报(proc natl acad sci usa)107:13473-8)。在使用活性毒素成分的免疫中，这些成分由于其毒性而难以用作疫苗，并且用所有11种类毒素蛋白进行免疫牵涉到生产上的困难。
9.因此，本发明人已尝试寻找用于广泛阻断11-毒素介导的细胞毒性的候选毒素与免疫产生的抗体的最有效组合。此外，本发明人通过探索能够在感染对象内最好地诱导调理吞噬作用和最有效地控制血液凝固的蛋白质片段和其组合，来尝试开发一种实用的预防性疫苗或治疗剂，其能够全面去除或减轻由感染引起的综合病理状况，而不是逐步改善由金黄色葡萄球菌感染引起的个体症状。
[0010][0011]
通过本说明书，参考并引用了许多出版物和专利文件。所引用的出版物和专利文件的公开内容通过引用整体并入本文以更清楚地描述相关领域的状态和本发明。
[0012]
公开技术问题
[0013]
本发明人进行了广泛的研究努力以开发用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物，其能够通过显著中和由金黄色葡萄球菌感染引起的细胞毒性来有效阻断宿主细胞的溶解。为此，本发明人研究了抗体与源自金黄色葡萄球菌的每种毒素的交叉反应性，并基于研究结果开发了表现出最广泛中和作用活性的最佳组合。结果，本发明人发现，当hla、luks、lukab和hlga单一毒素中的三种或更多种，更具体地所有四种毒素组合时，通过用这些毒素免疫而在受试者中产生的抗体可以完全阻断所有金黄色葡萄球菌毒素介导的溶细胞活性和显著抑制血液的溶血活性，从而完成了本发明。
[0014]
因此，本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物。
[0015]
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染引起的血栓性疾病的组合物。
[0016][0017]
本发明的其他目的和优点将从以下对本发明的详细描述、所附权利要求和附图中变得更加明显。
[0018]
技术方案
[0019]
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物，其包含作为活性成分的至少三种选自下组的金黄色葡萄球菌衍生毒素：α-溶血素(hla)、杀白细胞毒素s(luks)、杀白细胞毒素ab(lukab)和γ-溶血素(hlga)，或特异性识别毒素的抗体或其抗原结合片段，或编码毒素的核苷酸。
[0020]
本发明人进行了广泛的研究努力以开发用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物，其能够通过显著中和由金黄色葡萄球菌感染引起的细胞毒性来有效阻断宿主细胞的溶解。为此，本发明人研究了抗体与源自金黄色葡萄球菌的每种毒素的交叉反应性，并基于研究结果开发了表现出最广泛中和作用活性的最佳组合。结果，本发明人发现，当hla、luks、lukab和hlga毒素中的三种或更多种，更具体地所有四种毒素组合时，通过用这些毒素免疫而在受试者中产生的抗体可以完全阻断所有金黄色葡萄球菌毒素介导的溶细胞活性和显著抑制血液的溶血活性。
[0021]
本发明的组合物可以是包含每种毒素蛋白或编码它们的核苷酸的疫苗形式，将其施用于受试者以在受试者中产生针对每种毒素的抗体，所述组合物也可以以含有作为药理成分的针对各毒素的分离/纯化抗体的抗体治疗剂的形式使用。因此，在前一种情况下，术
语“用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物”与“金黄色葡萄球菌疫苗组合物”具有相同的含义。
[0022]
如本文所用，术语“抗体”是指由哺乳动物免疫系统产生的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白包含一个或多个与抗原表位结合并特异性识别抗原的可变结构域。作为本发明中特异性识别各金黄色葡萄球菌毒素的抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体，具体而言，可以使用具有交叉反应性的多克隆抗体。
[0023]
本发明的抗体可以通过本领域常规的方法生产，例如融合法(kohler和milstein,欧洲免疫学杂志(european journal of immunology),6:511-519(1976))、重组dna法(美国专利号4,816,567)、噬菌体抗体库法(clackson等人,nature,352:624-628(1991)或marks等人,j.mol.biol.,222:58,1-597(1991))。在harlow,e.和lane,d.,使用抗体：实验室手册(using antibodies:a laboratory manual),冷泉港出版社,纽约,1999；和zola,h.，单克隆抗体：技术手册(monoclonal antibodies:a manual of techniques)，crc出版社，佛罗里达州博卡拉顿，1984年中详细描述了抗体生产的一般步骤。
[0024]
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指整个免疫球蛋白结构的片段，其具有负责结合抗原的多肽的一部分。抗原结合片段的实例包括但不限于f(ab')2、fab'、fab、fv和scfv。
[0025]
如本文所用，术语“特异性结合”与“特异性识别”具有相同含义，是指抗原和抗体(或其片段)通过免疫反应特异性相互作用。
[0026][0027]
本发明还可以以含有编码上述四种毒素的氨基酸的核苷酸作为活性成分的dna疫苗或mrna疫苗的形式使用。
[0028]
除非另有说明，如本文所用，术语“核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括天然核苷酸的类似物(scheit,核苷酸类似物(nucleotide analogs),john wiley,纽约(1980)；uhlman和peyman，化学评论(chemical reviews)，90：543-584(1990))。当本发明以dna疫苗或mrna疫苗的形式使用时，本发明的三个或四个毒素基因可以包含在每个基因递送系统中，或者可以将多个毒素抗原基因同时插入一个基因递送系统中并在受试者中表达。
[0029]
如本文所用，术语“表达”是指允许受试者表达外源基因或使用基因递送系统人工引入的内源基因以增加内源基因的天然表达水平，从而通过染色体整合使基因作为染色体外因子在受试者的细胞中复制。因此，术语“表达”与“转化”、“转染”或“转导”同义。
[0030]
如本文所用，术语“基因递送系统”是指用于将所需靶基因引入靶细胞以表达靶基因的载体。一个理想的基因传递系统应该是对人体无毒、易于大量生产、高效传递基因的。
[0031]
如本文所用，术语“基因递送”是指将基因递送到细胞中，并且与基因的细胞转导具有相同的含义。在组织水平上，术语“基因传递”与基因传播具有相同的含义。因此，本发明的基因递送系统可称为基因转导系统和基因传播系统。
[0032]
为了构建本发明的基因递送系统，本发明的核苷酸序列优选地存在于合适的表达构建体内并且与表达调控序列(例如，启动子、信号序列或转录调控因子结合位点阵列)可操作性地连接。如本文所用，术语“可操作性地连接”是指核酸表达调控序列与另一核酸序列之间的功能性连接，并且通过该连接，调控序列调控另一核酸序列的转录和/或翻译。
[0033]
本发明的基因递送系统可以以多种形式构建。具体地，基因递送系统可以以以下形式构建：(i)裸重组dna分子，(ii)质粒，(iii)病毒载体，(iv)包含裸重组dna分子或质粒的脂质体或泡囊，或(v)包含mrna的脂质体。
[0034]
根据本发明的一个具体实施方式，hla是hla(α-溶血素)蛋白氨基酸序列35位氨基酸残基被取代的变异体。更具体地，35位的氨基酸残基his被leu取代。
[0035]
根据本发明的一个具体实施方式，lukab是lukab(杀白细胞素ab)蛋白的氨基酸序列323位氨基酸残基glu被取代的变异体。更具体地，323位的氨基酸残基glu被ala取代。
[0036][0037]
如本文所用，术语“预防”是指抑制从未被诊断为患有病症或疾病但可能患有此类病症或疾病的受试者发生该病症或疾病。
[0038]
如本文所用，术语“治疗”是指(a)抑制病症、疾病或症状的进展；(b)减轻病症、疾病或症状；(c)消除病症、疾病或症状。当本发明的组合物施用于受试者时，其功能是抑制由金黄色葡萄球菌感染引起的症状的进展，或者通过有效抑制由衍生自金黄色葡萄球菌的11种毒素介导的广谱溶细胞活性来消除或缓解症状。因此，本发明的组合物可以单独用作疾病的治疗组合物，或者可以与其他药理学成分组合施用并作为疾病的辅助治疗施用。因此，如本文所用，术语“治疗”或“治疗剂”包括“辅助治疗”或“治疗助剂”。
[0039]
如本文所用，术语“施用”或“施用了”是指直接向受试者施用治疗有效量的本发明的组合物，使得在受试者体内形成相同量的组合物。
[0040]
如本文所用，术语“治疗有效量”是指含有足以对施用了本发明药物组合物的受试者提供治疗或预防效果的药理学成分的组合物的量。因此，术语“治疗有效量”包括“预防有效量”。
[0041]
如本文所用，术语“受试者”包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴子、黑猩猩、狒狒或猕猴。具体地，本发明的受试者是人。
[0042][0043]
根据本发明的具体实施方案，金黄色葡萄球菌可以是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(mssa)或致病性金黄色葡萄球菌，更具体地，是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
[0044]
金黄色葡萄球菌感染性疾病包括但不限于软组织感染、化脓性关节炎、化脓性骨髓炎、中耳炎、肺炎、败血症、急性呼吸道感染、由于导管的使用造成感染、术后伤口感染、菌血症、心内膜炎和食物中毒。
[0045]
根据本发明的一个具体实施方式，除了金黄色葡萄球菌衍生毒素之外，本发明的组合物还可以包含糖肽类抗生素作为活性成分。
[0046]
如本文所用，术语“糖肽类抗生素”是指具有约1,400da或更大的分子量并具有糖肽核心的亲水性抗生素，它是单糖结合的稠环结构。糖肽类抗生素抑制细菌肽聚糖的合成，并且其实例包括但不限于雷莫拉宁、达巴万星、奥利万星(oritavancin)、特拉万星(telavancin)、万古霉素和替考拉宁。可以使用本领域已知的任何糖肽类抗生素。
[0047]
具体地，本发明中使用的糖肽类抗生素选自下组：万古霉素、替考拉宁及其组合。
[0048]
如后面将要描述的实施例中所示，证实了当在本发明中发现的毒素的组合或针对这些毒素的分离/纯化的抗体与糖肽类抗生素如万古霉素或替考拉宁共施用时，它甚至可
以完全消除肾脏中的残留细菌，进一步提高感染个体的存活率，从而对患者表现出多方面、协同保护作用。
[0049]
共施用可以使用包含本发明的所有毒素和糖肽类抗生素的单一制剂进行，或者可以通过以任何顺序、同时或顺序地以适当的时间延迟分别施用包含毒素和糖肽类抗生素的单独制剂来进行。在顺序施用的情况下，例如，可以首先施用本发明的毒素或针对毒素的分离/纯化的抗体，然后施用糖肽类抗生素。
[0050]
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用上述本发明的组合物。
[0051]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物，其包含作为活性成分的至少一种选自下组的蛋白质：凝集因子a(clfa)、纤维蛋白结合蛋白a(fnbpa)、纤维蛋白结合蛋白b(fnbpb)及其功能部分，或特异性识别该蛋白的抗体或其抗原结合片段，或编码该蛋白的核苷酸。
[0052]
由于已经详细描述了用于本发明的抗体或其抗原结合片段和核苷酸以及用本发明的组合物预防或治疗的金黄色葡萄球菌感染性疾病，因此将省略其描述以避免过度重叠。
[0053][0054]
本发明人还进行了广泛的研究努力，以探索通过中和金黄色葡萄球菌特有的宿主免疫系统逃避系统来预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物，或改善金黄色葡萄球菌治疗组合物(包括疫苗)的治疗敏感性的组合物。结果，本发明人发现，当向受试者施用选自clfa、fnbpa、fnbpb及其功能部分(它们是属于mscramm(微生物表面成分识别黏附基质分子(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules))的蛋白质)的一种或多种的组合时，这些蛋白质在宿主血清中竞争性地结合因子h(人补体因子h，fh)而不是活细菌细胞表面上的mscramm，从而阻断补体c3b向ic3b的水解，并且细菌调理吞噬作用由具有保留活性的c3b促进。
[0055]
如本文所用，术语“功能部分”是指包含保留clfa、fnbpa或fnbpb蛋白的生物活性的任何长度的部分片段。因此，术语“clfa、fnbpa或fnbpb蛋白的功能部分”是指每种蛋白的部分片段，其能够与血清fh特异性相互作用或能够作为诱导产生能够与活细菌细胞表面的mscramm特异性结合的抗体的抗原发挥作用。
[0056]
根据本发明的一个具体实施方式，功能部分是包含所述蛋白质的n2-n3结构域，更具体地，所述蛋白质的n2-n3结构域(clfa
n2n3
、fnbpa
n2n3
或fnbpb
n2n3
)的片段。clfa
n2n3
、fnbpa
n2n3
和fnbpb
n2n3
与fh的相互作用是未知的，本发明人首先发现这些片段可以与fh竞争性结合，或者针对这些片段的抗体可以与活菌细胞表面的mscramm竞争性结合，从而有效阻断宿主血清中的fh与活菌细胞表面的mscramm之间的相互作用。
[0057]
根据本发明的一个具体实施方式，本发明的组合物包含作为活性成分的包含clfa的n2-n3结构域的部分片段和包含fnbpb的n2-n3结构域的部分片段，或特异性识别该片段的抗体或其抗原结合片段，或者编码该片段的核苷酸。
[0058][0059]
当本发明的组合物作为药物组合物制备时，本发明的药物组合物含有药学上可接受的载体。
[0060]
包含在本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体的实例包括但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，这些通常用于制剂。除了上述成分以外，本发明的药物组合物还可以含有润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。在雷明顿的制药科学(remington’s pharmaceutical sciences)(第19版，1995)中详细描述了合适的药学上可接受的载体和试剂。
[0061]
本发明的药物组合物可以口服或胃肠外施用。具体地，它可以静脉内、皮下或腹膜内施用。
[0062]
本发明的药物组合物的适合剂量可根据各种因素而变化，例如，配制方法、施用方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和反应敏感性。对于成人，本发明的药物组合物的优选剂量在0.001至100mg/kg的范围内。
[0063]
可以通过根据本发明所属领域的技术人员可以容易地执行的方法，与药学上可接受的载体和/或赋形剂配制将本发明的药物组合物以单位剂量形式制备或制备成容纳在多剂量容器中。这里，所述药物组合物的制剂可以是所述药物组合物在油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳剂，或者含有所述药物组合物的提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊，并且还可以含有分散剂或稳定剂。
[0064]
当本发明的药物组合物被制备为疫苗组合物时，本发明的多种抗原，以及任选地以各种形式组合的合适佐剂，可以包装在一个小瓶或预填充注射器中，或者每种抗原和佐剂可以包装在单独的小瓶中，并在临用前混合(床边混合)。
[0065]
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用上述本发明的组合物。
[0066]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种用于预防或治疗由金黄色葡萄球菌感染引起的血栓性疾病的组合物，其包含作为活性成分的至少一种选自下组的蛋白质：凝固酶(coa)、血管性血友病因子结合蛋白(vwbp)及其功能部分，或特异性识别该蛋白的抗体或其抗原结合片段，或编码该蛋白的核苷酸。
[0067]
本发明人进行了广泛的研究努力，以开发一种方法，该方法通过有效地阻断诱导宿主血管中纤维蛋白凝固的金黄色葡萄球菌特有的宿主免疫系统逃避机制，来最小化由感染期间的血液凝固引起的对患者的全身性损害，并进一步改善患者的存活率。结果，本发明人发现了，当使用凝固酶(coa)和血管性血友病因子结合蛋白(vwbp)，具体地，其特定功能片段(它们被称为金黄色葡萄球菌的主要毒力因子)时，血液凝固被免疫接种产生的抗体显著抑制。
[0068][0069]
在涉及coa或vwbp蛋白时，本文使用的术语“功能部分”是指涵盖保留coa或vwbp蛋白的生物活性的任何长度的任何部分片段。因此，术语“功能部分”是指每种蛋白质的部分片段，其可以充当诱导产生被金黄色葡萄球菌表面蛋白(例如fnbp)识别或显著抑制由金黄色葡萄球菌感染引起的血液凝固的抗体的抗原。
[0070]
根据本发明的一个具体实施方式，coa的功能部分是coa蛋白的n-末端片段，更具体地，是包含自n-末端起284个连续氨基酸残基的片段。
[0071]
根据本发明的一个具体实施方式，vwbp的功能部分是vwbp蛋白的n-末端片段，更具体地，是包含自n-末端起253个连续氨基酸残基的片段。
[0072][0073]
如本文所用，术语“血栓性疾病”是指由于血管微循环系统中的血小板凝固或纤维蛋白聚集产生的血凝块而导致血流减少或阻塞，导致在诸如肾脏、心脏或大脑等各器官中缺血性损伤的全身性疾病。
[0074]
具体地，用本发明的组合物预防或治疗的金葡菌感染引起的血栓性疾病是选自下组中的至少一种：卒中、脑梗死、脑血栓、脑栓塞、腔隙性脑梗死、急性冠脉综合征、心绞痛、主动脉瓣狭窄、心肌梗死、束支传导阻滞、脑缺血、急性缺血性动脉血管事件、血栓性静脉炎、静脉血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、周围血管疾病、动脉粥样硬化、血管痉挛和再狭窄，它们是由金葡菌感染引起的。
[0075]
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗金葡菌感染引起的血栓性疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用上述本发明的组合物。
[0076]
有利效果
[0077]
本发明的特征和优点概括如下：
[0078]
(a)本发明提供了一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物以及用于预防或治疗由金黄色葡萄球菌感染引起的血栓性疾病的组合物。
[0079]
(b)根据本发明，即使用毒素抗原的最小组合，通过使用针对金黄色葡萄球菌毒素的抗体的交叉反应性可以彻底抑制11种金黄色葡萄球菌毒素的细胞溶解。
[0080]
(c)本发明还可以作为一种有效的治疗组合物，通过诱导调理吞噬作用和有效地控制受感染的受试者的血液凝固，来全面消除或缓解由感染引起的综合病理状况，而不是逐个地改善由金黄色葡萄球菌感染引起的个体症状。
[0081]
附图简要说明
[0082]
图1显示了克隆野生型和bcl、hla和3种类毒素的类毒素基因产物的琼脂糖电泳图谱。获得了预期的基因产物。a，克隆的七种单组分基因；b，含lukab二聚体基因的克隆基因；c，hla基因；d，hla
h35l
；e，luks
t244a
；和f，luka
e323a
b。
[0083]
图2为本发明中构建的金黄色葡萄球菌重组野生型和类毒素bcl毒素的示意图。
[0084]
图3显示了重组bcl、类毒素、毒素的纯化结果以及其溶细胞活性的测定结果。图3a显示了在还原条件下将5μg每种蛋白质加载到15％ sds-page上的结果。图3b显示了5μg类毒素蛋白的sds-page图谱。图3c显示了将人pmn(2x106个细胞)与0.125μg纯化的bcl和类毒素共孵育1小时的结果。柱1，无毒素；2，luks
t244a-pv+lukf-pv；3，luka
e323a
b；4，luks-pv+lukf-pv；5，luke+lukd；6，hlgc+hlgb；7，hlga+hlgb；8，lukab。图3d显示了将2％兔rbc与hla
wt
(0.25μg)和hla
h35l
(0.25μg)毒素在37℃下共孵育1小时的结果。柱：1,pbs；2,hla
wt
；3,hla
h35l
。
[0085]
图4显示了从bcl免疫的兔血清中纯化的兔抗bcl识别的igg的洗脱图谱。首先，将兔血清(120mg)加载到蛋白a琼脂糖凝胶(sepharose)柱(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich))上，用0.15m甘氨酸缓冲液(ph 2.2)洗脱结合的总igg(数据未显示)。浓缩后，将收集的igg加载到每种毒素和类毒素缀合的琼脂糖凝胶(sepharose)柱上，然后用0.15m甘氨酸缓冲液(ph 2.2)洗脱。
[0086]
图5显示了在免疫点印迹测定中抗bcl igg对兔单bcl的识别图谱。将每个纯化的单bcl组分(1μg)点在pvdf条上，然后将其与每种同源抗bcl-igg在室温下孵育1小时。洗涤后，将每个条带与hrp缀合的山羊抗兔igg一起孵育。
[0087]
图6显示了在纯化的抗luks-pv-igg(a)、抗hlga-igg(b)、抗hlgc-igg(c)和抗luke-igg(d)的存在下，pmn(2x106个细胞)与bcl的同源s成分(0.25μg/ml)和f成分(0.25μg/ml)的混合物共孵育后的人pmn的存活率。柱1，无毒素(绿色)；柱2，hlga+hlgb(棕色)；柱3，luke+lukd(黄绿色)；柱4，luks-pv+lukf-pv(蓝色)；柱5，hlgc+hlgb(黄色)；柱6，lukab(橙色)。
[0088]
图7显示了在纯化的抗lukf-pv-igg(a)、抗hlgb-igg(b)和抗lukd-igg(c)的存在下，pmn(2x106个细胞)与bcl的同源s成分(0.25μg/ml)和f成分(0.25μg/ml)的混合物共孵育后的人pmn的存活率。柱1，无毒素(绿色)；柱2，hlga+hlgb(棕色)；柱3，luke+lukd(黄绿色)；柱4，luks-pv+lukf-pv(蓝色)；柱5，hlgc+hlgb(黄色)；柱6，lukab(橙色)。
[0089]
图8显示了在纯化的抗luke+lukd-igg(a)、抗hlga+hlgb-igg(b)、抗hlgc+hlgb-igg(c)、抗luks+lukf-igg(d)和抗lukab-igg(e)的存在下，pmn(2x106个细胞)与bcl的同源s成分(0.25μg/ml)和f成分(0.25μg/ml)的混合物共孵育后的人pmn的存活率。柱1，无毒素(绿色)；柱2，hlga+hlgb(棕色)；柱3，luke+lukd(黄绿色)；柱4，luks-pv+lukf-pv(蓝色)；柱5，hlgc+hlgb(黄色)；柱6，lukab(橙色)。
[0090]
图9显示了在纯化的抗luks-pv+hlgc-igg(a)、抗luks-pv+hlga-igg(b)、抗luks-pv+luke-igg(c)、抗hlga+luke-igg(d)、抗hlga+hlgc-igg(e)和抗hlgc+luke-igg(f)的存在下，pmn(2x106个细胞)与bcl的同源s成分(0.25μg/ml)和f成分(0.25μg/ml)的混合物共孵育后的人pmn的存活率。柱1，无毒素(绿色)；柱2，hlga+hlgb(棕色)；柱3，luke+lukd(黄绿色)；柱4，luks-pv+lukf-pv(蓝色)；柱5，hlgc+hlgb(黄色)；柱6，lukab(橙色)。
[0091]
图10显示了在纯化的抗lukf-pv+hlgb-igg(a)、抗lukd+hlgb-igg(b)、抗lukf-pv+lukd-igg(c)和抗lukf-pv+lukd+hlgb-igg(d)的存在下，pmn(2x106个细胞)与bcl的同源s成分(0.25μg/ml)和f成分(0.25μg/ml)的混合物共孵育后的人pmn的存活率。柱1，无毒素(绿色)；柱2，hlga+hlgb(棕色)；柱3，luke+lukd(黄绿色)；柱4，luks-pv+lukf-pv(蓝色)；柱5，hlgc+hlgb(黄色)；柱6，lukab(橙色)。
[0092]
图11显示了在纯化的抗luks-pv+hlga+lukab
e323a-igg(a)、抗luke+lukab
e323a-igg(b)和抗lukf-pv+hlgb+lukd+lukab
e323a-igg(c)的存在下，pmn(2x106个细胞)与bcl的同源s成分(0.25μg/ml)和f成分(0.25μg/ml)的混合物共孵育后的人pmn的存活率。柱1，无毒素(绿色)；柱2，hlga+hlgb(棕色)；柱3，luke+lukd(黄绿色)；柱4，luks-pv+lukf-pv(蓝色)；柱5，hlgc+hlgb(黄色)；柱6，lukab(橙色)。
[0093]
图12显示了同源bcl和hla在不同时间点的表达模式。在泳道1中，纯化的重组单独s成分(0.2μg)和f成分(0.2μg)的混合物被加载至凝胶上。将从金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞培养0h(泳道2)、1.5h(泳道3)、4h(泳道4)、5h(泳道6)和9h(泳道6)的培养基(60μg蛋白量)纯化并加载至15％sds-page凝胶上。此后，使用亲和纯化的抗单独s-和f-成分igg(各6μg)的混合物进行蛋白质印迹分析。
[0094]
图13显示了所选的4种igg对六种毒素介导的人pmn细胞溶解活性的效果(a)、存活pmn细胞的计数结果(b)、六种毒素处理的兔rbc的图像(c)以及它们在405nm处的吸光度测
量结果(d)。
[0095]
图14显示了测量用usa300培养基(图14a)处理的和用培养基和所选的四种毒素和类毒素igg(图14b)处理的人pmn存活的结果。
[0096]
图15显示了金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞与人全血、pbs、兔初始血清(serum)或四种所选的毒素和类毒素igg共孵育后的cfu评估的结果。在柱1中，将人全血(2ml)与细菌(2x106个细胞)和pbs(20μl)在37℃下共孵育3小时。在柱2中，添加了兔初始血清(40μg蛋白质)代替pbs。在柱3中，添加了所选的四种毒素和类毒素igg。
[0097]
图16显示了金黄色葡萄球菌cwap蛋白的结构域结构(图16a)、本发明中克隆的cwap
n2n3
结构域(图16b)以及纯化的七种cwap
n2n3
结构域的sds-page分析结果(图16c)。金黄色葡萄球菌cwap蛋白的初级转译产物包含在n端的信号序列(s)和分别称为n1、n2和n3的三个单独折叠的结构域。c端有一个细胞壁延展区域(w)和分选信号(ss)。
[0098]
图17显示了cwap
n2n3
免疫点印迹分析和在cwap
n2n3
/fh/fi存在下c3b向ic3b的转化。图17a显示了免疫点印迹测的结果，其中，七种cwap
n2n3
结构域(clfa
n2n3
、clfb
n2n3
、sdrc
n2n3
、sdrd
n2n3
、fnbpa
n2n3
和fnbpb
n2n3
)和bsa被点在了5条pvdf膜上。图17b显示了c3b通过固定化板上的人fh/fi/cwap
n2n3
结构域裂解为ic3b。
[0099]
图18显示了cwap
n2n3
蛋白捕获fh并抑制c3向ic3b的转化。图18a显示了sds-page凝胶电泳的结果，其中，5μg的cwap
n2n3
结构域蛋白和0.5μg的fh被加入至悬浮在100μl的pbs中的金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞(1
×
105cfu)。图18b显示了sds-page凝胶电泳的结果，其中，10μg的cwap
n2n3
结构域和0.1μg的人fh被加入至含黄色葡萄球菌usa300 lac细胞(1
×
105cfu)的100μl的gvb
++
中。
[0100]
图19显示了流式细胞术结果，其表明了抗fh结合cwap fab
′
2片段处理抑制了fh与活的金黄色葡萄球菌usa300细胞的结合(图19a)，并显示了通过在细菌表面沉积fh量来量化这种抑制作用的结果(图19b)。*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001；ns:统计学上无意义。
[0101]
图20显示了蛋白质印迹分析结果，其表明了纯化的兔(图20a)和人(图20b)抗cwap-igg对七种cwap
n2n3
结构域(clfa
n2n3
、clfb
n2n3
、sdrc
n2n3
、sdrd
n2n3
、sdre
n2n3
、fnbpa
n2n3
和fnbpb
n2n3
)的结合特异性。
[0102]
图21显示了通过cwa
pn2n3
结构域和通过纯化的识别igg的人或兔cwap
n2n4
对金黄色葡萄球菌的杀菌活性。图21a显示了在100μl金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞(1
×
105细胞/孔)中加入5μg各纯化的cwap
n2n3
结构域后测量cfu的结果。统计分析采用非配对学生t检验进行。*,p≤0.05；ns：统计学上无意义。同时，它显示了在100μl金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞(1x105个细胞/孔)中加入纯化的人(图21b)和兔(图21c)igg后测量cfu的结果。统计分析采用非配对学生t检验进行。*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001；***,p≤0.0001；ns:统计学上无意义。
[0103]
图22是显示本发明组合物的作用机制的示意图。大多数金黄色葡萄球菌菌株已知在其表面表达cwap。当细菌入侵宿主时，血清补体fh将通过dll机制与cwap
n2n3
结构域结合(14、15)。同时，人补体激活将在识别细菌后在其表面沉积c3b。随后，fh将招募fi将沉积的c3b转化为ic3b，导致c3b介导的宿主中性粒细胞的吞噬作用降低(中图)。通过将抗cwap
n2n3-igg与表达在细菌表面的原生蛋白结合，fh没有机会结合这些cwap
n2n3
结构域。通过
抑制fh在细菌上的招募，fi介导的c3b失活也将减少。较高的c3b含量将诱导更高的c3b介导的调理吞噬作用的可能性(左图)。通过将cwap
n2n3
结构域添加到金黄色葡萄球菌感染部位，这些蛋白将捕获血清fh，并使c3b在细菌表面沉积的可能性增加，从而导致c3b介导的吞噬作用增强(右图)。
[0104]
图23显示了克隆的金黄色葡萄球菌cwap
n2n3
结构域基因的确认结果。
[0105]
图24a显示了在还原(左)和非还原(右)条件下纯化的抗fh-igg和抗fh-fab
′
2的sds-apge图谱。泳道1,山羊抗人因子h igg；泳道2,经胃蛋白酶处理的山羊抗人因子h igg；泳道3,蛋白质a柱的通过部分；泳道4,蛋白质a柱上的经胃蛋白酶处理的山羊抗人因子h。图24b显示了抗fh-igg和抗fh-fab
′
2片段对六种蛋白质的结合特异性。图24c显示了五种抗cwap-fab
′
2片段对七种不同cwap
n2n3
结构域的结合特异性。
[0106]
图25显示了四种人(图25a)和兔(图25b)抗cwap-igg的洗脱图谱。
[0107]
图26显示了纯化的人(图26a)和兔(图26b)抗cwap-igg的sds-page分析结果。sh(+)和sh(-)分别表示还原和非还原条件。泳道1至5分别加载了clfa-igg、sdrc-igg、sdre-igg、fnbpa-igg和fnbob-igg。每个泳道加载了3μg的纯化igg。
[0108]
图27显示了金黄色葡萄球菌凝固酶(coa)和vwf结合结构域蛋白(vwbp)的结构域组分的示意图，并显示了重组coa(图27a)和vwbp(图27b)的构建结构域。这些数字表示基于金黄色葡萄球菌usa300 lac菌株基因组序列的氨基酸位置。
[0109]
图28显示了纯化的重组coa和vwbp结构域蛋白的sds-page分析结果(15％)。泳道1,coa
全
；泳道2,coan；泳道3,coac；泳道4,vwbp
全
；泳道5,vwbpn；泳道6,vwbpc。
[0110]
图29显示了通过点印迹分析对coa(图29a)和vwbp(图29b)的不同结构域蛋白的抗体特异性的检查结果。泳道1,bsa(3μg)；泳道2,coa
全
(3μg)；泳道3,coan(3μg)；泳道4,coac(3μg)；泳道5,bsa(3μg)；泳道6,vwbp
全
(3μg)；泳道7,vwbpn(3μg)；泳道8,vwbpc(3μg)。
[0111]
图30显示了金黄色葡萄球菌usa300培养过程中coa(图30a)和vwbp(图30b)蛋白的表达图谱，并显示了使用抗coa
全-igg(图30a)和抗vwbp-igg(图30b)进行蛋白质印迹分析的结果。左侧凝胶指示了纯化的coa
全
和vwbp
全
的sds-page图谱。
[0112]
图31显示了通过点印迹分析鉴定金黄色葡萄球菌细胞表面表达的coa(图31a)和vwbp(图31b)识别蛋白的结果。在7个pvdf膜条上点样七种细胞壁相关蛋白(cwap)的n2-n3结构域(3μg)。泳道1,bsa；泳道2,clfa
n2n3
；泳道3,clfb
n2n3
；泳道4,sdrc
n2n3
；泳道5,sdrd
n2n3
；泳道6,sdre
n2n3
；泳道7,fnbpa
n2n
；泳道8,fnbpb
n2n
。
[0113]
图32显示了利用抗fnbp-f(ab')2片段确认coa与fnbp蛋白之间结合特异性的结果。将金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞(1
×
105个细胞)与coac一起孵育1小时，然后获得细菌沉淀(泳道1)，表明添加的coa蛋白被招募到细菌表面。作为对照，虽然细菌细胞与coac和抗sdrc-f(ab)2’片段共孵育，但coac被招募到细菌表面(泳道2)。然而，当细菌细胞与coac和抗fnbp-f(ab’)2片段共孵育，细菌表面上添加的coac的量显著降低(泳道3和4)。这表明fnbp具有选择性结合分泌的coac的能力。
[0114]
图33显示了不同剂量的纯化的coa
全
或vwbp
全
(图33a)对血凝的诱导作用以及不同剂量的抗coa
全-igg和vwbp
全-igg(图33b)对血凝的抑制作用。
[0115]
图34显示了分泌的coa和vwbp介导的血凝被抗coa
全
igg或抗vwbp
全
igg抑制。试管1,rpmi(100ul)加人血液(200μl)孵育1.5h；试管2,血液(200μl)与1μg的coa
全
一起孵育1.5h；
试管3,5μg的vwbp加入至200μl的血液；试管5,usa300培养基(100μl)加血液；试管6,抗coa
全
igg(80μg)加入至usa300培养基(100μl)加血液；试管7,抗vwbp
全
igg(80μg)加培养基和血液；试管8,usa300培养基(100μl)加抗凝固酶
全
igg(40μg)和抗vwbp
全
igg(40μg)；试管9,usa300培养基(100μl)加抗coa
全
igg(80μg)+抗vwbp
全
igg(80μg)加血液。
[0116]
图35显示了仅coan和vwbpn诱导人血液凝固，但coac和vwbpc未诱导血液凝固。试管1,血液200μl加rpmi基质(100μl)在室温下孵育1.5h；试管2,usa300培养基(100μl)加人血液；试管3,血液加vwbpn(5μg)；试管4,血液加vwbpc(5μg)；试管5,血液加coan(1μg)；试管6,血液加coac(1μg)。
[0117]
图36显示了由包含在usa300培养基中的coa或vwbp导致的血液凝固(图36a)和coan和vwbpn介导的凝固(图36b)被抗coa
n-igg和抗-vwbp
n-igg抑制，但没有被抗coac和抗vwbpcigg抑制。在图36a中，试管1,血液200μl加rpmi基质(100μl)在室温下孵育2.5h；试管2,血液加培养基(100μl)；试管3,血液加培养基加coa
n-ab(60μg)；试管4,血液加培养基加vwbp
n-ab(60μg)；试管5,血液加培养基加coa
c-ab；试管6,血液加培养基加vwbp
c-ab(60μg)；在图36b中，试管1,血液(200μl)加rpmt(100μl)；试管2,血液加coan(5μg)；试管3,血液加vwbpn(5μg)；试管4,血液加coan(5μg)加抗coa
n-ab(80μg)；试管5,血液加vwbpn(5μg)加抗vwbp
n-ab(80μg)。
[0118]
图37是用来验证抗coa
全-igg和vwbp
全-igg体内凝血作用的兔免疫实验的示意图。
[0119]
图38是显示了属于pbs给药对照组和抗coa
全-igg和vwbp
全-igg给药组的每只兔子测量长达167小时体重变化的结果的图表。
[0120]
图39显示了计算pbs给药对照组和抗coa
全-igg和vwbp
全-igg给药组的随时间(图39a)和每日(图39b)变化的存活率的结果。
[0121]
图40显示了通过静脉注射针对四种在本发明中发现的抗原的纯化抗体预处理的组(组2,g2)和用万古霉素预处理组2(g2)获得的兔子组中的各组对usa300 mrsa感染保护作用，并显示了各组的存活率(图40a)和观察组2和组4兔肾脏的结果(图40b)。
[0122]
图41显示了通过usa300 mrsa菌株感染用4种抗原免疫3次的兔子获得的组(组2,g2)、在usa300 mrsa感染后3小时肌肉注射替考拉宁到g2获得的组(组4,g4)、单独用替考拉宁处理的组(组3,g3)和单独用生理盐水处理的组(组1,g1)中的各组对usa300 mrsa感染保护作用。具体而言，图41显示了为测量免疫后针对各抗原的抗体滴度进行的elisa的结果(图41a)、各组存活率(图41b)、每只肾脏中残留菌量化(cfu)的结果(图41c)和各组兔肾脏的观察结果(图41d)。
[0123]
发明方式
[0124]
以下将参考实施例更进一步描述本发明的细节。这些实施例仅用于更详细地解释本发明，并且对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明的主题的本发明的范围不受这些实施例的限制。
[0125]
实施例
[0127]
实施例1：筛选金黄色葡萄球菌毒素
[0128]
实验方法
[0129]
伦理声明
[0130]
人血获自从四名健康志愿者。釜山国立大学irb批准了这项研究方案(pnu irb/2019_59_br)。研究参与者提供了书面知情同意书。
[0131][0132]
细菌
[0133]
金黄色葡萄球菌菌株usa300 lac菌株在37℃的胰酶大豆肉汤(tsb)中振荡培养到对数中期(od
600 0.8-1.5)。大肠杆菌(escherichia coli)dh5α菌株在37℃下在添加有10μg/ml卡那霉素(km)的luria肉汤(lb)中振荡培养。
[0134][0135]
重组bcl毒素的纯化和类毒素制备
[0136]
使用大肠杆菌表达系统克隆并表达聚组氨酸标记的重组毒素。使用q5高保真dna聚合酶(赛默飞世尔科技公司)通过pcr从usa300基因组序列扩增靶基因的luks-pv、lukf-pv、luke、lukd、hlga、hlgb、hlgc、lukab、hla、hla
h35l
、luks
t244a-pv、luka
e323a
b。将pcr产物克隆到pet28a载体中，产生表达具有n-末端或c-末端6x his-标签的蛋白质。为了纯化lukab和luka
e323a
b，本发明人将6x his-标签插入n-和c-末端区域。对获得的克隆进行测序以验证正确的构造。用0.2mm异丙基-lβ-d-1-硫代半乳糖苷(iptg，0.2mm浓度)诱导，使重组蛋白在bl21plyss大肠杆菌中表达。使用ni-琼脂糖凝胶6快速流动树脂(通用(ge)医疗，17-5318-01，5ml)与加载缓冲液(20mm磷酸钠，0.1％triton x-100，150mm nacl，5mm咪唑，ph 7.4)、洗涤缓冲液(20mm磷酸钠，150mm nacl，5mm咪唑，ph 7.4)和洗脱缓冲液(20mm磷酸钠，150mm nacl，500mm咪唑，ph 7.4)纯化表达的蛋白。实施例1中使用的引物序列如下表1所示。
[0137]
[表1]
[0138]
兔预防接种获得毒素抗体
[0139]
将500μg六种金黄色葡萄球菌毒素的纯化单组分及其类毒素溶解在500μl的pbs中，与500μl的完全弗氏佐剂(西格玛奥德里奇)混合，并混合制成乳剂。将每种乳剂皮下注射到兔子中，两周后，将相同量的抗原与500μl不完全弗氏佐剂(西格玛奥德里奇)混合，并通过皮下途径注射。两周后，从兔耳静脉抽取500μl微升血液，并通过蛋白印迹分析确认每
种抗原的igg的产生。如果产生抗体，则收集兔全血并从中获得血清。将兔血清保存在-80℃，待用。
[0140][0141]
纯化蛋白与cnbr活化的琼脂糖微珠的偶联
[0142]
重组单组分毒素与cnbr活化的琼脂糖微珠之间的偶联是根据制造商(通用医疗(ge health care))提供的方法进行的。简言之，用偶联缓冲液(3ml/1次，0.1m nahco3，ph 8.5)洗涤1克cnbr活化的琼脂糖微珠3次。将溶解在1ml偶联缓冲液的5mg重组蛋白添加到经洗涤的cnbr活化微珠中，然后将其悬浮在4ml偶联缓冲液中。在室温下孵育2小时后，用偶联缓冲液洗涤微珠3次。然后，将微珠与4ml的1m乙醇胺(ph 8.0)在室温下孵育4小时。孵育后，用0.1m磷酸钠(ph 7.4)洗涤，直到在280nm下没有显示出uv吸收，并在4℃下储存，待用。
[0143][0144]
从兔血清中纯化识别igg的兔抗单组分
[0145]
在抗原偶联的琼脂糖柱用洗涤缓冲液(0.1m磷酸钠，含0.1m nacl，ph 7.4)平衡后，将抗原免疫的兔血清(1ml，60mg蛋白质)加载到柱上，然后用洗涤缓冲液集中洗涤，然后用洗脱缓冲液(0.15m甘氨酸/hcl，ph 2.2)洗脱结合的igg。收集的igg用中和缓冲液(1m tris/hcl缓冲液，ph 9.0)中和。用pbs改变缓冲液后，在还原和非还原条件下，通过sds-page分析收集的igg。
[0146][0147]
斑点印迹免疫分析
[0148]
将制备的pvdf膜条(immobilion p，0.22μm孔径，微孔)在甲醇中活化30秒。然后，将条用h2o洗涤5分钟，轻轻摇动。洗涤后，将1μg重组单组分毒素(luks-pv、lukf-pv、hlga、hlgb、hlgc、luke、lukd和lukab)加载到膜条上。将每种单组分和lukab蛋白(每种1μg)和作为阴性蛋白的金黄色葡萄球菌fnbpa
n2n3
(纤维蛋白结合蛋白的n2-n3结构域)进行点样。在室温下干燥条带2小时后，将斑点状蛋白用甲醇固定15秒，然后用h2o洗涤3次，用1
×
tbs(50mm tris-hcl，ph 7.5，150mmnacl)洗涤3次。然后，将膜条用5％脱脂乳封闭2小时，然后在4℃下和单组分毒素免疫的igg(用5％脱脂乳1:1600稀释)孵育1小时。孵育后，将膜用1
×
tbst(50mm tris-hcl，ph 7.5，150mmnacl，0.2％吐温20)洗涤3次。将小鼠抗兔igg-hrp(1:3000稀释，santacruz)加入到膜中并在4℃下孵育1小时。然后，用1x tbst洗涤膜3次，然后使用pico epd蛋白质印迹检测试剂盒[elpis-biotech]显影。
[0149][0150]
人类pmn分离
[0151]
在室温下，使用收集的全血(2ml)和多型核细胞分离液
tm
(polymorphprep
tm
)(2ml，axis-shield)在5ml圆底管中分离多形核白细胞(pmn)。将样品在20℃下以450xg离心30分钟。去除上清液后，获得两条白细胞带包括单核细胞上带和pmn下带。然后，将收集的pmn用rpmi(gibco)洗涤2次，然后在20℃下以400xg离心10分钟后收集。将收集的细胞轻轻重悬于2毫升rpmi+0.02％ hsa缓冲液中，然后用血细胞计数器(ekds，东京)计数。
[0152][0153]
兔红细胞分离
[0154]
通过耳静脉将1ml兔血收集到水蛭素涂覆的真空采血管(bd，becton drive)中以
防止凝血。然后，将管子在4℃下以9,100xg离心10分钟，并获得红细胞(rbc)。将rbc用含有0.02％ bsa的pbs洗涤2次，然后通过在4℃下以500xg离心5分钟收集。然后，通过用含有0.02％ bsa的pbs稀释至2％rbc来制备储存rbc。
[0155][0156]
溶细胞和溶血试验
[0157]
为了评估原代人pmn在存在或不存在金黄色葡萄球菌bcl或hla的情况下的体外的生存能力，将pmn以每孔2x106个细胞接种在48孔细胞培养板(spl)中，并且除lukab(130ng)外，将其与相同量的s-和f-组分(每个65ng)混合。将该混合物在5％ co2条件下于37℃孵育1小时。然后，用血细胞计数器计数存活的细胞。
[0158][0159]
毒素介导的红细胞溶血试验
[0160]
为了在存在或不存在hla
wt
毒素的情况下进行体外的兔rbc的溶血测定，将2％的rbc以100μl/孔接种在96孔细胞培养板中。然后，将0.25μg纯化的重组hla
wt
毒素加入到96孔板中，并在5％ co2条件下于37℃孵育1小时。孵育后，通过以500xg离心5分钟收集上清液。然后，使用分光光度计(eppendorf biophotomter)测量405nm处的吸光度。
[0161][0162]
蛋白质印迹分析
[0163]
将纯化的bcl毒素、hla和类毒素进行15％sds-page凝胶电泳，然后使用转移缓冲液(192mm甘氨酸，25mm tris，0.02％ sds，20％ mtoh)，以100v、400ma，在4℃下电转移75分钟至0.45的pvdf膜上。然后，用5％脱脂奶封闭膜1小时。将膜与免疫兔血清(1：6000)一起孵育，用5％脱脂奶在4℃下封闭1小时。孵育后，用1
×
tbst(50mm tris-hcl,ph 7.5,150mm nacl,0.2％吐温20)洗涤膜3次。加入小鼠抗兔igg-hrp(santacruz)并在4℃孵育1小时。然后，将膜用1x tbst洗涤3次，然后使用pico epd蛋白质印迹检测试剂盒[elpis-biotech]显影。
[0164][0165]
实验结果
[0166]
纯化的五种重组金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素(bcl)和hla(而不是它们的类毒素)分别水解了人pmn和rbc。
[0167]
为了研究金黄色葡萄球菌毒素与毒素介导的宿主细胞的细胞毒性之间的关系，本发明人首先克隆了(图1a至1c)并在大肠杆菌系统中表达了5种bcl和hla。为了纯化这六种表达的重组毒素，将他的his
6x
标签插入到目标毒素的n端或c端位点(图2)。如图3所示，金黄色葡萄球菌bcl的四种s成分和三种f成分的重组蛋白被纯化至同质，但是因为lukab的单体形式显示出很低表达量，lukab
wt
被克隆和纯化为二聚体形式(图3a)。此外，重组hla
wt
和hla
h35l
、luks
t244a
和luka
e323a
b类毒素也被纯化至同质(图3b)。具有单个活性氨基酸取代的hla类毒素(hla
h35l
)不能形成溶细胞孔，因为his-35残基突变为leu，但已知这保留了在宿主靶细胞上结合其受体的能力(menzies be等人,1994.感染与免疫(infect immun)62:1843-7；menzies be等人,1996.感染与免疫64:1839-41)。由于已知luks-pv的thr-244残基向ala的突变(luks
t244a-pv)导致表达c5a受体的人白细胞和未分化的u937细胞的结合亲和力显著降低(laventie bj等人,2014.plos one 9:e92094)，本发明人已克隆并纯化了
luks
t244a
突变体。此外，构建并使用了luka
e323a
b，因为据报道luka的glu-323残基对于lukab细胞毒性是至关重要的，并且对于lukab与其细胞靶标cd11b之间的相互作用是必需的(dumont al等人,2014.感染与免疫82:1268-76)。为了确认野生型杀白细胞素和类毒素是否可以显示针对人pmn的期望的溶细胞活性，本发明人混合了相同量的s成分和f成分，从而导致野生型杀白细胞素(如luksf-pv、luked、hlgab、hlgcb、lukab)和无活性的杀白细胞素(如luks
t244a-pv和luka
e323a
b)的产生。
[0168]
分别表达并纯化bcl、hla及它们的类毒素蛋白的s、f成分后，通过使用人pmn和rbc混合每种同源组合来检测其毒性。在混合相同量的s和f成分(每种0.25μg/ml)后(除了lukab(0.5μg/ml))，所有五种同源bcl(如luksf-pv、luked、lukab、hlgab、hlgcb)在30分钟内完全水解人多形核白细胞(pmn，2x106个细胞)，但是luks
t244a-pv类毒素(0.25μg/ml)和lukf-pv(0.25μg/ml)的混合物没有显示出任何对人pmn的毒性活性(图3c)。同样，luka
e323a
b二聚体类毒素(0.5μg/ml)没有显示出针对人pmn的任何细胞毒性活性(图3c)。此外，纯化的hla
wt
(2.5μg/ml)在30分钟内使2％兔rbc溶血，但其无活性的hla
h35l
类毒素未显示出任何对兔rbc的溶血活性(图3d)。总之，这些数据表明纯化的金黄色葡萄球菌bcl及其类毒素蛋白被正确克隆并纯化至同质。
[0169][0170]
单个s或f成分抗兔igg对其他bcl组分具有交叉反应性
[0171]
由于金黄色葡萄球菌bcl在s-s或f-f单组分之间具有高序列同源性，因此单组分免疫的兔抗体被期望能结合金黄色葡萄球菌bcl毒素的另一种单组分。然而，由于它们单组分igg的识别模式对于筛选能够广泛中和五种bcl介导的细胞毒性的bcl抗体将是重要的，因此本发明人通过使用单组分缀合的琼脂糖柱通过亲和纯化获得了针对八种不同的单组分的兔多克隆抗体(图4)。而且，由于本发明的重组毒素和类毒素在n或c末端区域上带有6x his-标签(his tag)，使用6x his标记的金黄色葡萄球菌纤维蛋白结合蛋白a(fnbpa
n2-n3
)缀合的琼脂糖柱去除his-标签衍生的igg(数据未显示)。使用这些纯化的兔单组分识别igg，本发明人通过点印迹免疫测定法检查了每种bcl单组分与纯化的bcl识别igg之间的交叉反应性(图5)。使用的所有igg均不与用作阴性对照蛋白的fnbpa
n2-n3
结合。抗luks-pv-igg识别所有四种s成分，例如luks-pv》hlgc》hlga和》luke，而不是所有三种f成分和lukab(图5中的柱a，红色和绿色框分别表示同源和非同源抗原)。抗luke-igg还识别出四种s成分，例如结合的luke》luks》hlgc》hlga(图5中的柱f)。抗hlga-igg识别出hlg》hlgc》lukf(柱c)。抗hlgc-igg识别出hlgc≥luks》hlga(图5中的柱e)。在f成分-igg的情况下，抗lukf-pv-igg已显示出针对lukf》lukd的阳性信号(图5中的柱b)。抗hlgb-igg识别了三种f成分，如lukf-pv》hlgb》lukd(图5中的柱d)。抗lukd-igg显示出对lukd》lukf-pv的结合能力(图5中的柱g)。如预期的那样，lukab-igg仅显示出针对其同源抗原lukab抗原的结合特异性(图5中的柱h)。综上所述，这些结果表明luks-pv和luke-igg针对四种bcl的s成分表现出最广泛的结合能力。然而，有趣的是，尽管抗hlga-igg是识别s成分的igg，但该igg也识别lukf-pv的f成分(图5中的柱c和g)。至于抗hlgb-igg，其识别了hlgb、lukd和lukf这三个f成分，但是其他两种f成分(lukf-pv和lukd)仅识别了它们的同源f成分和另一个种同源f成分。综上所述，这些结果表明，bcl的s和f成分显示出针对它们的同源和非同源抗原的不同的识别模式。
[0172][0173]
四种抗s成分igg显示出针对四种bcl介导的pmn溶细胞活性的部分中和作用
[0174]
本发明人研究了体外添加抗s或f成分-igg将中和多少bcl介导的中性粒细胞细胞溶解活性。当人pmn与每种bcl和抗luks-pv-igg共同孵育时(图6a)，抗luks-pv-igg抑制了luksf-pv(98.5
±
0.5％)、luked(74
±
1％)和hlgcb(68.1
±
1％)介导的pmn溶细胞活性，但是hlgab和lukab衍生的pmn溶细胞活性并未被抗luks-pv-igg完全中和。相反，抗hlga-igg仅中和了hlgab衍生的(90.3
±
3％)和luked介导的pmn溶解(27.5
±
4％)，但luksf-pv、hlgcb和lukab介导的pmn细胞毒性几乎没有被阻断(图6b)。抗hlgc-igg抑制了hlgab(43.9
±
0.5％)、luked(58.5
±
1％)和luksf-pv(73.2
±
0.5％)、hlgcb(85.4
±
1％)和lukab(0％)介导的pmn溶解(图6c)。如预期的那样，抗luke-igg抑制四种-bcl介导的pmn溶解70％以上，但没有完全抑制lukab衍生的溶解(图6d)。在斑点印迹实验中(图5)，抗luke-igg有力地识别了luke》luks-pv，但较弱地识别了hlgc》hlga。然而，四种-bcl介导的pmn溶解被抗luke-igg阻断了75
±
3％，这表明点印迹免疫测定与在bcl介导的人pmn溶细胞活性中单独s成分igg的中和能力之间存在一些差异。
[0175][0176]
三种抗f成分igg中和hlgcb介导的pmn溶细胞活性
[0177]
如图7所示，当抗f-成分-igg与人pmn和bcl共孵育时，抗lukf-pv igg阻断了luksf-pv介导的pmn溶解活性(85
±
0.5％)和hlgcb-衍生的pmn溶解活性(74
±
1％)，但hlgab、luked和lukab-介导的pmn溶细胞活性几乎没有被抗lukf-igg中和(图7a)。此外，抗hlgb-igg还抑制了hlgab-介导的pmn溶解活性(85.8
±
1％)和hlgcb-介导的pmn溶解活性(65
±
0.5％)，但抑制luked-(10
±
0.5％)、luksf-pv-(10
±
1％)和lukab-(2
±
1％)介导的裂解活性较差(图7b)。在抗lukd-igg的情况下，它还中和了luked-(84
±
4％)和hlgcb-(77
±
1％)介导的pmn溶解活性，但是，hlgab-(18.4
±
3％)、luksf-(20.8
±
0.2％)和lukab-(3
±
0.1％)介导的裂解活性不能有效地被lukd-igg中和(图7c)。总之，尽管在斑点印迹免疫测定中(图5)，两种f-成分-igg(如抗lukf-igg和抗lukd-igg)不识别hlgb，这两种f-成分-igg通常中和hlgcb-介导的pmn溶解活性，表明这两种f-成分-igg可能识别非同源hlgb的特定序列，从而导致抑制hlgcb bcl的低聚。
[0178][0179]
抗bcl-组分-igg的不同组合显示出针对bcl-介导的细胞毒性的多种多样的中和能力
[0180]
本发明人假设，如果我们能够筛选出能够广泛中和5种-bcl-介导的细胞毒性的最小数量的bcl的抗s-或抗f-组分igg，则它们将是设计针对金黄色葡萄球菌感染的新型治疗工具的有用信息。据报道，luksf-pv和hlgcb通常识别在宿主细胞上表达的c5ar1和c5ar2受体(7)。但是，luked利用ccr5、cxcr1和cxcr2(spaan an等人，2013，细胞宿主和微生物(cell host microbe)，13:584-594)。然而，luked识别ccr5、cxcr1和cxcr2(alonzo f等人,2013.自然(nature)493:51-5)，以及hlgab和luked已知共享cxcr1和cxcr2作为受体，但也可以利用ccr2(spaan an等人.,2017.自然微生物学评论(nat rev microbiol)15:435-447)，而lukab结合cd11b(dumont al等人,2014.感染与免疫(infect immun)82:1268-76)。基于图6和7中的实验结果，本发明人进一步研究了哪一个抗单-组分-igg或抗类毒素-igg的不同组
合可以有效地中和源于五种bcl的细胞毒性。如图8所示，当将抗luke-igg(5μg)和抗lukd-igg(5μg)的混合物与人pmn和五种bcl共同孵育60分钟时，除lukab外的四种bcl-介导的pmn细胞毒性被这两个igg中和70％以上(图8a)。然而，抗hlga-和hlgb-igg的混合物仅中和hlgab-(79.8
±
5％)和hlgcb-(60
±
1％)介导的细胞毒性(图8b)，但这种igg混合物显示出对luked、luksf-pv和lukab无抑制作用。这些结果表明，尽管据报道hlgab和luked结合cxcr1、cxcr2和ccr2作为受体，但hlga和hlgb的igg混合物几乎不中和luked-介导的细胞毒性。出乎意料的是，抗hlga-igg和抗hlgb-igg混合物抑制了c5ar-识别hlgcb的溶细胞活性。
[0181]
抗hlgc-igg和抗hlgb-igg的混合物中和了hlgcb(93.4
±
0.5％)》luksf-pv(70
±
1％)》hlgab(57.8
±
1％)的溶解活性，表明这种c5ar-识别bcl-兔多克隆igg混合物也抑制了趋化因子-受体-识别hlgab的细胞毒性(图8c)。然而，抗luks-pv-igg和抗lukf-pv-igg的混合物中和了luksf-pv-(93.5
±
1％)和hlgcb-(78.7
±
1％)介导的溶解活性，并且还抑制了luked(68
±
0.5％)-衍生的pmn溶解活性(图8d)。综上，如预期的那样，抗lukab-igg仅中和lukab的细胞毒性，但不是4种bcl介导的毒性作用(图8e)。这些结果表明，抗bcl-igg的不同组合针对四种-bcl-介导的细胞毒性表现出不同的中和能力，但对lukab毒性作用完全没有效果。
[0182][0183]
在抗s-成分-igg组合中，抗luks-pv-和抗hlga-igg的混合物显示出针对bcl-介导的细胞毒性的最高水平的中和活性
[0184]
接下来，本发明人已研究了同源bcl s-igg的组合对5种bcl-介导的pmn细胞溶解活性的中和能力。为此，本发明人评估了六种不同的抗s-组分-igg的组合针对五种bcl-介导的溶细胞活性的中和能力(图9)。当将每个可能的抗s-成分-igg的六种组合与人pmn和五种不同的bcl孵育时，计算pmn的存活率。pmn存活率如下：luks-pv+hlgc(平均生存率59.7％，图9a)、luks-pv+hlga(85.8％，图9b)、luks-pv+luke(45.2％，图9c)、hlga+luke(45.9％，图9d)、hlga+hlgc(31.3％，图9e)和hlgc+luke(36.8％，图9f)。其中，与其他五种组合相比，抗luks-pv和抗hlga-igg混合物最有效地抑制了四种bcl-介导的溶细胞活性(图9b)。这些结果表明，两种抗s-成分-igg的混合物能够中和四种bcl-毒性作用，但不能中和lukab。
[0185][0186]
在抗f-成分-igg组合中，抗lukf-和抗lukd-igg的混合物显示出针对四种-bcl-介导的细胞毒性的最高水平的中和活性
[0187]
进一步地，本发明人已研究了同源bcl f-igg的组合对5种bcl-介导的pmn细胞溶解活性的中和能力。为此，本发明人检验了四种不同的抗f-组分-igg的组合针对bcl-介导的溶细胞活性的中和能力(图10)。用每种混合物处理的pmn的平均存活率如下：抗lukf-pv-和抗hlgb-igg(52.9％，图10a)、抗lukd和抗hlgb-igg(42.6％，图10b)、抗lukf-pv-和抗lukd-igg(68.6％，图10c)和抗lukf-pv-、抗lukd和抗hlgb-igg(69.0％，图10d)。其中，相比其他三种组合，抗lukf-pv-和抗hlgb-igg的组合显示出更高的pmn存活率。这些结果表明，三种抗f-成分-igg针对四种bcl-毒性作用也显示出良好的中和活性，但不能中和lukab。
[0188][0189]
抗luks-pv-、hlga-和luka
e323a
b-igg的混合物中和了五种bcl-介导的pmn细胞溶解
活性
[0190]
如图6至图10所示，任何bcl-组分-igg和igg的任何组合均不抑制lukab-衍生的溶细胞活性。因此，本发明人认为，为了使用抗bcl-组分-igg来中和所有五种bcl-衍生的毒性，应使用抗lukab类毒素-igg和其他选择性的抗bcl-组分-igg。为此，本发明人纯化了重组luka
e323a
b类毒素及其兔抗luka
e323a
b igg(图4)。因为本发明人发现抗luks-pv-和hlga-igg的混合物高度中和了四种bcl-介导的溶细胞活性(图9b)，本发明人假设三种igg的混合物，例如抗luks-pv-、抗hlga和抗luka
e323a
b类毒素-igg将中和五种bcl-介导的溶细胞活性。此外，三种抗f-成分-igg与抗luka
e323a
b类毒素-igg的混合物(图10d)将是有价值的候选者。
[0191]
为了解决这些可能性，本发明人将人pmn与五种bcl和两种不同的igg组合一起孵育(图11)。抗luks-pv-、抗hlga和抗luka
e323a
b类毒素-igg的组合(图11a)，抗lukf-pv、抗hlgb-和抗luka
e323a
b类毒素-igg(图11b)分别显示出94.7％和68.0％作为测量pmn平均存活率的结果，这表明两种s-成分-igg和一种lukab类毒素igg的混合物高度中和了五种金黄色葡萄球菌bcl-介导的pmn溶细胞活性。
[0192][0193]
抗luks-pv-、hlga-、hla
h35l
和luka
e323a
b-igg的混合物保护了分泌的天然金黄色葡萄球菌毒素-介导的人pmn溶细胞和溶血活性
[0194]
直到此时，将五种重组bcl用于体外考察人pmn溶细胞活性。在此，本发明人考察了纯化的抗bcl igg是否也对从致病性金黄色葡萄球菌usa300分泌的天然bcl起作用。为此，本发明人首先检查了usa300培养期间在不同时间点分泌的bcl量。如图12所示，所有五种bcl在培养1.5至3小时时高度分泌(图12a)。在相同条件下，hla在1.5至9小时高度分泌。根据这些结果，假定5种bcl和hla毒素通常在第3小时的培养点积累。因此，本发明人在第3小时的培养点从金黄色葡萄球菌usa3000培养基中收集上清液并浓缩至1mg/ml蛋白质浓度，用作储存溶液。当本发明人通过点印迹分析定量储存溶液中分泌的bcl和hla量时，结果表明luksf-pv、hlgab、luked、hlgcb、lukab和hla的平均蛋白质量分别是0.13、0.26、0.32、0.37、0.24和1.50μg/ml(表2)。
[0195]
[表2]
[0196][0197]
接下来，本发明人考察了天然人pmn是否可以在体外被四种抗体的混合物保护，例如抗luks pv-、hlga、hla
h35l
和luka
e323a
b类毒素-igg图13)。当本发明人使用来自初始人全血的多型核细胞分离溶液制备人pmn时，清楚地显示了pmn带，没有任何损伤(图13a，左)。但是，当本发明人将六种重组毒素(总共4μg的hla、luksf-pv、hlgab、luked、hlgcb、lukab)加入到全人血液中时，在离心后没有恢复白色pmn带(图13a，中间)。在向人全血中加入六种毒素和四种igg(64μg的抗hla
h35l
、luks-pv-、hlga和luka
e323a
b-igg)的混合物后，在离心后重新出现pmn带(图13a，右)。此外，当通过血细胞计数器计数回收的pmn的细胞数(图13b)时，与对照组(列1)相比，从六种毒素处理的全血中仅回收20％的pmn(列2)。然而，从四种igg处理的人全血中回收了95％的pmn(柱3)。这些结果表明，本发明的四种筛选的igg可以在体外有效地阻断六种毒素-介导的pmn溶细胞活性。
[0198]
此外，已知在感染后金黄色葡萄球菌的hla和bcl诱导溶血活性(seilie es等，2017，细胞与发育生物学研讨会(semin cell dev biol)72:101-116)。与pbs处理的血液相比，当六种毒素与兔全血一起孵育时，观察到更高的溶血活性(图13c，管2)，但是，当将4种选定的igg和6种毒素加入到兔全血中时，与对照组相比，溶血活性被抑制了50％(图13c和13d)。这些结果支持了本发明的四种毒素抗体的混合物具有针对金黄色葡萄球菌毒素-介导的人血溶血活性的抑制作用。
[0199]
最后，本发明人通过四种所择的igg对金黄色葡萄球菌培养基-介导的pmn溶细胞活性考察了保护活性。首先，为了考察多少金黄色葡萄球菌培养基的蛋白质量对于展现针对人pmn(2x106细胞)的细胞毒性活性是必要的，将不同剂量的培养基与pmn一起孵育(图14a)。添加16μg/ml培养基后，pmn几乎被水解。基于这些数据，当人pmn(2x106细胞)与250μl的rpmi在37℃孵育1小时时，100％pmn存活(图14b，柱1)，但是当pmn与usa300培养基(终浓度为16μg/ml)和抗luks-pv-、hlga-、luka
e323a
b和hla
h35l-igg(终浓度为160μg/ml)的混合物共同孵育时，大约90％的pmn存活(柱2)。如预期的那样，仅用usa300培养基孵育pmn(终浓度为16μg/ml)，仅5％的pmn存活(柱3)。这些结果证明通过体外添加本发明的4种所选的毒素和类毒素-igg可保护免受6种毒素介导的pmn溶细胞损伤。
[0200][0201]
与人全血和金黄色葡萄球菌usa300共同孵育后，四种兔抗毒素-igg显示出杀菌作用
[0202]
已知通过抗原预防接种得到的血清抗体可诱导宿主吞噬细胞-介导的调理吞噬作用，从而清除感染的病原体(miller ls等，2020.fems微生物学评论(microbiol rev)44:
123-153)。由于本发明所选的四种抗兔毒素igg表现出对金黄色葡萄球菌bcl和hla毒素-介导的pmn溶细胞和红细胞溶血作用的抑制作用，本发明人考察了这四种抗体的混合物是否可以通过与金黄色葡萄球菌usa300细胞和人全血共孵育来诱导杀菌作用。为此，将usa300细胞(2x106细胞)与天然纯化的igg(40μg)或四种毒素-衍生的igg的混合物(总共40μg)和人全血(100μl)共孵育3小时，然后估计残余集落形成单位(cfu)(图15)。当对照样品可显示约2x106的cfu时，与对照组相比，天然兔源igg-处理的和混合物四种-毒素-igg处理的样品分别显示25％和6％的cfu，这表明四种抗毒素-igg的混合物在人全血中具有杀菌作用。
[0203][0204]
实施例2：与人补体因子h(fh)结合的cwap蛋白的探索
[0205]
实验方法
[0206]
含有clfa、clfb、sdrc、sdrd、sdre、fnbpa和fnbpb n2-n3结构域的pet28a载体的制备
[0207]
根据制造商的协议，使用gibson装配主混合物(新英格兰生物实验室，美国)进行克隆。将pet28a质粒(novagen，德国)用作载体，因为pet28a已经具有含6个组氨酸的基序(称为6-his标签)。为了表达cwap
n2n3
结构域，每个基因clfa(215-575)、clfb(200-555)、sdrc(166-507)、sdrd(224-570)、sdre(261-610)、fnbpa(180-559)和fnbpb(140-500)约11kbp，它们包括金黄色葡萄球菌usa300 lac菌株的n2和n3结构域。使用q5高保真聚合酶通过pcr扩增编码区(引物序列汇总在表3中)。将克隆的pet28a-clfa、clfb、sdrc、sdrd、sdre、fnbpa和fnbpb转化至大肠杆菌dh5α(enzynomics，韩国)中，并涂布在含有10μg/ml卡那霉素(km)(西格玛奥德里奇，美国)的lb琼脂平板上，并在37℃下孵育过夜。
[0208]
[表3]实施例2中使用的引物序列
[0209][0210]
pet28a-cwap质粒dna向大肠杆菌bl21(de3)plyss的转化
[0211]
制备的pet28a-clfa、clfb、sdrc、sdrd、sdre的100ng dna，通过热休克法将fnbpa和fnbpb转化为100μl的大肠杆菌bl21(de3)plyss感受态细胞，并涂布在含有10μg/ml卡那霉素(km)和50μg/ml氯霉素(cm)的lb琼脂平板上，然后在37℃下孵育过夜。
[0212][0213]
cwap
n2n3
结构域的表达与纯化
[0214]
将插入pet28a-clfa、clfb、sdrc、sdrd、sdre、fnbpa和fnbpb的大肠杆菌bl21(de3)
plyss在含10μg/ml的km和50μg/ml的cm的lb中培养并在37℃下孵育过夜。将10ml培养的样品接种到含有10μg/ml的km和50μg/ml的cm的1l的lb中，并在37℃下孵育1小时30分钟至2小时。当od
600
达到0.3至0.5时，将200μl的1m的iptg加入到1l的样品中，然后将样品在37℃孵育3小时。为纯化clfa
n2n3
、clfb
n2n3
、sdrc
n2n3
、sdrd
n2n3
、sdre
n2n3
、fnbpa
n2n3
、fnbpb
n2n3
结构域，将培养的溶液在4℃下以7,000
×
g离心20分钟。在-80℃下冷冻颗粒30分钟后，将颗粒悬浮在40ml的20mm磷酸钠缓冲液(ph 7.4)中，该缓冲液含有150mm nacl、5mm咪唑、0.1％triton x-100和5mg溶菌酶(bioshop，加拿大)，和一片不含edta的complete tm
蛋白酶抑制剂混合物(默克,美国)，并在室温下孵育15分钟。将样品在冰上超声处理30分钟，以破坏细菌细胞壁。将混合物在4℃下以20,400xg离心20分钟。收集上清液并用0.45μm注射器膜过滤器过滤。使用ni琼脂糖6快速流动柱(ge生命科学，usa)纯化表达的重组蛋白。简而言之，在施加样品之前，用含有150mm nacl和5mm咪唑(缓冲液a)的20mm磷酸钠(ph 7.4)平衡ni琼脂糖柱。将过滤溶液加载到柱上后，用缓冲液a洗涤柱，然后用分别含有150mm nacl和500mm咪唑的20mm磷酸钠(ph 7.4)梯度洗脱蛋白质。收集洗脱组分并在还原条件下通过sds-page分析。
[0215][0216]
cwap
n2n3
结构域偶联的琼脂糖亲和柱的制备
[0217]
重组cwap
n2n3
结构域与cnbr-活化的琼脂糖珠之间的偶联是根据制造商(通用医疗)的方案进行的。简言之，将1g的cnbr-活化的琼脂糖珠用偶联缓冲液(0.1m nahco3,ph 8.5)洗涤3次。将溶解在1ml偶联缓冲液中的5mg的cwap
n2n3
蛋白添加到经洗涤的cnbr-活化微珠中，然后将其悬浮在4ml偶联缓冲液中。在室温下孵育2小时后，用偶联缓冲液洗涤微珠3次。然后，将微珠与4ml的1m乙醇胺(ph 8.0)在室温下孵育4小时。孵育后，用0.1m磷酸钠(ph 7.2)洗涤，直到在280nm下没有显示出uv吸收，并在4℃下储存。
[0218][0219]
在兔子中制备cwap
n2n3
结构域识别抗体
[0220]
将溶解在500μl的pbs中的500μg纯化的cwap
n2n3
结构域与500μl完全弗氏佐剂(cfa，西格玛奥德里奇)混合以制备乳剂。在将乳剂皮下注射到兔子中后，7天后与相同量的抗原混合并与500μl不完全弗氏佐剂(ifa，西格玛奥德里奇)一起注射。一周后，从兔耳静脉抽取500μl血液，并通过蛋白印迹分析测试igg的产生。确认igg的产生后，取兔血清并将其保存在-80℃。
[0221][0222]
从兔血清中纯化兔抗cwap
n2n3
识别igg
[0223]
在用洗脱缓冲液(0.15m甘氨酸/hcl，ph 2.2)洗涤金黄色葡萄球菌蛋白a偶联的琼脂糖柱(西格玛奥德里奇)后，用洗涤缓冲液(0.1m磷酸钠，含0.1m nacl，ph 7.4)平衡该柱。将抗原免疫的兔血清(2ml，约100mg蛋白质)加载到柱上，然后用洗涤缓冲液洗涤，然后用洗脱缓冲液洗脱igg。收集的igg立即用中和缓冲液(1m tris/hcl缓冲液，ph 9.0)中和。在换成cwap
n2n3
结构域偶联的琼脂糖柱并用洗脱缓冲液(0.15m甘氨酸/hcl，ph 2.2)洗涤该柱后，用洗涤缓冲液(0.1m磷酸钠，含0.1m nacl，ph7.4)平衡该柱。将蛋白a柱收集的igg(约6mg蛋白质)加载到柱上，然后用洗涤缓冲液洗涤，然后用洗脱缓冲液洗脱igg。收集的igg立即用中和缓冲液(1m tris/hcl缓冲液，ph 9.0)中和。用pbs更换的缓冲液后，在还原和非还原条件下，通过sds-page分析收集的igg。
[0224][0225]
兔igg的fab
′
2片段的制备
[0226]
本发明中使用的fab’2片段如先前所述的制备(hymes aj等,1979.生物化学杂志(j biol chem)254:3148-51)。在此，制备抗人fh-igg fab’2片段的方法通常应用于其他fab'2片段的制备。首先，使用金黄色葡萄球菌蛋白a偶联的琼脂糖柱(西格玛奥德里奇)纯化山羊抗人fh-igg。简而言之，将500μl(40mg蛋白质)的山羊抗人fh(补体技术公司(complement technology,inc.))加载到蛋白a柱(1.5x8cm，10ml)上，该柱用缓冲液a(0.1m磷酸钠，ph 7.4，含有0.1m nacl)平衡。用缓冲液a洗涤柱后，将结合的igg用缓冲液b(0.15m甘氨酸/hcl，ph 2.2)洗脱，同时监测280nm处的uv吸光度。将收集的igg立即用1m tris/hcl(ph 9.0)中和直到达到ph 7.5。在将收集的igg浓缩到centricon(默克密理博公司(merck millipore ltd.))上之后，将2.5mg山羊fh igg和50μg胃蛋白酶(西格玛奥德里奇)与500μl的0.1m乙酸盐缓冲液(ph 4.2)混合，然后在37℃孵育18小时。通过用含有100mm nacl的冷100mm磷酸盐缓冲液(ph 7.4)更换的缓冲液来终止反应，并检查反应混合物在还原和非还原条件下igg是否被适当裂解。当反应进行时，将消化溶液浓缩并用缓冲液a更换的缓冲液，以加载后续的蛋白质a柱。收集含有f(ab’)2片段的蛋白a柱的通过(pt)级分。
[0227][0228][0229]
人ivig中的人cwap
n2n3
识别igg的纯化
[0230]
将5ml市售的静脉用igg(ivig，500mg蛋白)加载到cwap
n2n3
偶联琼脂糖柱(sdre，fnbpa:1ml微珠；clfa，fnbpb:3ml微珠)并如上所述洗涤。如上所述地洗脱并中和人抗cwap
n2n3
识别igg。在还原和非还原条件下，通过sds-page分析获得的人igg。
[0231][0232]
斑点印迹免疫分析
[0233]
将3μg的cwap
n2n3
的n2-n3结构域(clfa
n2n3
、clfb
n2n3
、sdrc
n2n3
、sdrd
n2n3
、sdre
n2n3
、fnbpa
n2n3
和fnbpb
n2n3
)和作为阴性对照的bsa点样在聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(immobilon-p
sq
转移膜，美国默克)上并干燥。通过室温下浸泡在含5％脱脂牛奶的tbs中，封闭2小时，然后与7μg的纯化人纤维蛋白原(西格玛奥德里奇，美国)、纯化的人纤连蛋白(西格玛奥德里奇，美国)、人fh(补体技术，美国)和人类fi(补体技术，美国)一起孵育，它们溶解在700μl的5％脱脂牛奶中。然后，将膜用tbst洗涤3次10分钟，并与6,000倍稀释的一抗(兔抗人纤维蛋白原-igg(西格玛奥德里奇，美国)、兔抗人纤连蛋白-igg(西格玛奥德里奇，美国)、山羊抗人fh-igg(补体技术，美国)和山羊抗人因子i-igg(货号a238，补体技术，美国)在室温下孵育1小时。将膜用tbst洗涤3次10分钟，并与3000:1稀释的二抗(小鼠抗兔igg hrp或驴抗山羊igg-hrp，santacruz，美国)在室温下孵育1小时。然后，将膜用tbst洗涤3次10分钟，并用与增强化学发光(ecl)试剂(pico epd，elpis-biotec，韩国)一起孵育1分钟。
[0234][0235]
流式细胞术
[0236]
进行facs分析以定量fh与金黄色葡萄球菌的结合。细菌在血板上生长过夜，然后悬浮在pbs中。用pbs洗涤细菌两次，通过测量600nm处的od来估计细菌数量。将20μg的clfa
n2n3
、sdrc
n2n3
、sdre
n2n3
、fnbpa
n2n3
、fnbpb
n2n3
兔f(ab’)2片段的cwap
n2n3
结构域与usa300(2
×
107细胞)一起在4℃下孵育1小时。孵育后，将样品在4℃下以1,500
×
g离心3分钟，然后用200μl的pbs洗涤细菌颗粒两次。洗涤后，将细菌悬浮在pbs中，加入30μg的fh，并在4℃孵育1小时。孵育后，将样品在4℃下以1,500
×
g离心3分钟，然后用200μl的pbs洗涤细菌颗粒两次。然后，将细菌用多克隆山羊抗人fh fab
′
2-fitc缀合物重悬于20μl pbs中，并在冰上孵育1小时。将金黄色葡萄球菌细胞超声处理30秒以使细胞分开，然后进行流式细胞分析，并记录10000个事件。
[0237][0238]
在固定板上存在cwap
n2n3
结构域的情况下，用人fh/fi复合物将c3b裂解为ic3b
[0239]
将20μl包衣缓冲液(其由含3μg的cwaps
n2n3
结构域的25mm碳酸钠和25mm碳酸氢钠(ph 9.6)组成)、bsa和山羊抗人fh-igg(1000:1稀释)涂覆到微量滴定板上。用pbst洗涤孔3次后，将孔与100μl的0.2％bsa的pbs溶液在室温下孵育2小时，然后用含有0.05％吐温20的pbs溶液(ph 7.4)的pbst洗涤孔3次。然后，加入0.37μg纯化的人fh。添加pbs代替人fh作为阴性对照。孵育30分钟后，用pbst洗涤孔3次。然后，将含1μg纯化的c3b的75μl混合物和1μg纯化的人fi的gvb
++
溶液添加到每个孔中，并在37℃下孵育3小时。孵育后，提取上清液，并使用6000:1稀释的山羊抗人c3-igg(美国补体技术公司)作为一抗，通过蛋白质印迹检测产生的ic3b量。然后，将膜用tbst洗涤3次，并与作为二抗的驴抗山羊-igg-hrp(santacruz，美国)一起孵育。用ecl试剂处理1分钟后，按如上所述获得图像。
[0240][0241]
活金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞上人fh的检测
[0242]
将细菌(1
×
个105cfu)制备在100μl的pbs中。向其中加入5μg的cwap
n2n3
结构域和0.5μg的fh，并在4℃下孵育1小时。孵育后，将样品在4℃下以1500
×
g离心3分钟，然后收集90μl的上清液，并用200μl的pbs洗涤细菌颗粒两次。最后，将细菌颗粒悬浮于90μl的pbs中。将每个悬浮的细菌沉淀和收集的上清液加载到6-15％梯度的sds-page凝胶上。凝胶电泳后，在4℃下将条带转移至0.45μmpvdf膜(immobilon-p转移膜，美国默克)上。通过浸泡在含有5％脱脂牛奶的tbst中于室温下1小时来封闭膜。然后，将膜与作为一抗的山羊抗人fh-igg一起孵育，然后用tbst洗涤3次，并与作为二抗的驴抗山羊-igg-hrp(美国santacruz)一起孵育。用ecl试剂处理1分钟后，按如上所述获得图像。
[0243][0244]
cwaps
n2n3
结构域存在下ic3b量的测量
[0245]
将金黄色葡萄球菌usa300 lac菌株细胞(1
×
105cfu)制备在100μl的gvb
++
中。向其中加入10μg的cwaps
n2n3
和0.1μg的人fh并在4℃下孵育1小时。孵育后，将样品在4℃下以1500
×
g离心3分钟，并收集90μl上清液。用200μl的pbs洗涤细菌颗粒两次。然后，将1.5μg纯化的c3b、0.25μg纯化人fi的gvb
++
加入上清液和颗粒中，然后在37℃下孵育3小时。将每个颗粒和收集的上清液加载到6-15％梯度sds-page凝胶上。凝胶电泳后，在4℃下将条带转移至pvdf膜上。通过浸泡在含有5％脱脂牛奶的tbst中于室温下1小时来封闭膜。然后，将膜与作为一抗的山羊抗人c3-igg一起孵育。将膜用tbst洗涤3次，并与作为二抗的驴抗山羊-igg-hrp(santacruz，美国)一起孵育。用ecl试剂处理1分钟后，按如上所述获得图像。
[0246][0247]
兔抗cwap-fab'2针对其他cwap
n2n3
结构域的结合特异性考察
page上迁移，预期分子大小约为35至45kda(图16c)。经计算，1升培养基的产量为约15至20mg的纯化cwap
n2n3
。
[0262]
因为cwap
n2n3
具有相似的三维结构(arora s等人,2016.front microbiol 7:540)，本发明人考察了四种人蛋白质(纤维蛋白原(fg)、纤连蛋白(fn)、补体因子h(fh)和补体因子i(fi))是否可以在体外识别七种cwap
n2n3
。通过用丽春红s染料染色确认相同量的蛋白质印迹在pvdf膜上后，通过点印迹免疫分析法将每个pvdf膜条与每7μg的人fg、fn、fh和fi蛋白孵育。洗涤未结合的蛋白质后，用特异性抗fg-、fn-、fh-和fi-igg考察膜上结合的蛋白质(图17a)。在上述条件下，如先前报道的，人fg显示出对fnbpa
n2n3
的高特异性结合能力(deivanayagam cc等人,2002.欧洲分子生物学组织杂志(embo j)21:6660-72.)，而fn显示出对fnbpb
n2n3
的特异性结合能力(broker bm等人,2014.国际医学微生物学杂志(int j med microbiol)304:204-14)，表明两种fnbp
n2n3
蛋白与人fg和fn蛋白具有高度结合能力。此外，人类fh被四种cwap
n2n3
(clfa
n2n3
、sdre
n2n3
、fnbpa
n2n3
和fnbpb
n2n3
)识别。在相同条件下，五种cwap
n2n3
蛋白(clfa
n2n3
、sdrc
n2n3
、sdre
n2n3
、fnbpa
n2n3
和fnbpb
n2n3
)显示出与fi结合的能力。有趣的是，clfb
n2n3
和sdrd
n2n3
没有显示出针对这四种人蛋白质的任何结合能力。尽管先前报道了fnbpa和fg之间、fnbpb
n2n3
和fn之间以及sdre
n2n3
和fh或fi之间的相互作用(sharp ja等人,2012.plos one7:e38407；bingham rj等人,2008.proc natl acad sci usa 105:12254-8；burke fm等人,2011.febs j 278:2359-71；zhang y等人,2017.biochem j 474:1619-163130)，clfa
n2n3
、fnbpa
n2n3
、fnbpb
n2n3
和fh、fi之间的相互作用以前没有报道。
[0263]
如果这些cwap
n2n3
结构域具有结合人fh的能力，则可以预期fh结合的cwap
n2n3
结构域将在fi存在下诱导补体c3b向ic3b的转化。为了证明这种可能性，将sdre
n2n3
和抗fh-igg蛋白用作阳性对照蛋白，因为据报道sdre
n2n3
结合人fh(sharp ja等人,2012.plos one 7:e38407；zhang y等人,2017.biochem j474:1619-1631)，并且因为抗fh-igg具有结合fh的能力。如图17b所示，将7种cwap
n2n3
蛋白涂布到具有阳性对照蛋白的微孔板上。也将bsa涂布作为阴性对照。与fh孵育后，将洗去未结合的fh。加入c3b和fi后，然后将板在37℃下孵育3小时。使用抗c3-mab通过蛋白质印迹分析检测生成的ic3b(图17b)。如预期的那样，即使添加fh/c3b/fi，bsa涂布的部分也几乎不产生42kda的ic3b片段(泳道1)，这表明bsa无法招募fh。然而，sdre
n2n3-涂布和抗fh-igg-涂布部分在fh/c3b/fi存在下高度产生42kda片段(泳道11和17)，而不是在仅fi/c3b存在下(泳道12和18)，表明sdre
n2n3
和抗fh-igg可以募集fh，导致fi将c3b转化为ic3b。在相同条件下，clfa
n2n3
、fnbpa
n2n3
和fnbpb
n2n3
涂布的部分通过添加fh、c3b和fi(分别为泳道3、13和15)产生了42kda片段，但在没有fh(泳道4、14和16)的情况下不会产生。这些结果再次证实，clfa
n2n3
、fnbpa
n2n3
、fnbpb
n2n3
和sdre
n2n3
结构域具有结合人fh的能力，然后进一步地fh能够募集fi，导致补体c3b在体外水解为ic3b。
[0264][0265]
通过添加fh结合cwap
n2n3
蛋白，抑制了fh募集到金黄色葡萄球菌细胞表面，导致c3b向ic3b的转化降低
[0266]
由于本发明人观察到四种金黄色葡萄球菌cwap显示出与fh的结合能力，因此本发明人考察了是否可以通过添加结合fh的cwap
n2n3
蛋白来抑制表达天然cwap的金黄色葡萄球菌活细胞上的fh募集。为此，将活的金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞与fh和五种不同的蛋白质(clfa
n2n3
、sdre
n2n3
、fnbpa
n2n3
、fnbpb
n2n3
和sdrc)一起孵育(图18a)。在pbs条件的情况
下，添加的所有fh蛋白被募集到细菌表面(颗粒)(泳道2)而不存在于上清液(泳道1)中，表明金黄色葡萄球菌细胞募集fh。在clfa
n2n3
、sdre
n2n3
和fnbpa
n2n3
的情况下，几乎添加的一半的fh存在于上清液中(泳道3、5和7)，另一半存在于颗粒上(泳道4、6和8)。如预期的那样，添加fnbpb
n2n3
完全抑制了细菌表面fh的富集(泳道10)，导致上清液中所有添加的fh的积累(泳道9)。相反，在sdrc
n2n3
蛋白的情况下，该蛋白被证明没有与fh结合的能力(图17a)，所有添加的fh被募集到细菌表面(泳道12)，而不是上清液(泳道11)，表明sdrc
n2n3
蛋白对fh与金黄色葡萄球菌的结合没有抑制作用(泳道11)。总之，这些结果支持了四种fh结合蛋白(fnbpa
n2n3
、fnbpb
n2n3
、sdre
n2n3
和clfa
n2n3
)通过结合fh与在细菌表面上表达的天然cwap蛋白起竞争性抑制剂的作用。在四种蛋白质中，fnbpb
n2n3
高度抑制金黄色葡萄球菌表面的fh募集。
[0267]
为了进一步证实这些观察结果，本发明人认为考察fh识别cwap
n2n3
蛋白是否可以防止金黄色葡萄球菌usa300细胞表面fh-介导的ic3b生成是有价值的。本发明人认为，当金黄色葡萄球菌细胞与fh/c3b/fi在不存在fh结合ceap
n2n3
蛋白的情况下一起孵育时，细菌表面上募集的fh将从100kda的c3b中产生更大量的43kda的ic3b片段。然而，当添加结合fh的cwap
n2n3
蛋白时，由于添加的cwaps
n2n3
蛋白捕获fh，少量fh将被招募到细菌表面，导致较少量的43kda的ic3b沉积在细菌表面。为了证明这种可能性，当将金黄色葡萄球菌usa300细胞与fh/c3b/fi和5种蛋白的每一种一起孵育时(图18b)，pbs和添加sdrc部分上产生的ic3b量高于四种结合fh的cwap
n2n3
蛋白的ic3b量(分别为泳道1和3vs泳道2、4-6)。这些结果强有力地说明，结合fh的cwap
n2n3
蛋白通过捕获补体fh抑制c3b向ic3b的转化，从而阻止在细菌表面上fi-介导的c3b向ic3b的转化。
[0268][0269]
兔抗cwap
n2n3 f(ab’)2片段抑制在金黄色葡萄球菌细胞表面上fh募集
[0270]
接下来，本发明人试图了解结合兔抗-fh的cwap
n2n3-igg是否也可以抑制活的金黄色葡萄球菌usa300细胞表面上的fh募集。为此，本发明人难以使用兔抗人fh-igg或兔抗cwap
n2n3-igg，因为金黄色葡萄球菌蛋白a可能通过结合igg的fc结构域非特异性地捕获天然igg。为了解决这个问题，本发明人决定通过胃蛋白酶处理从天然fh-igg和5种抗fh结合的cwap
n2n3-igg蛋白中制备6种不同的f(ab’)2片段(图23)。如图24a所示，纯化的抗fh-fab’2和五种抗cwap
n2n3
f(ab’)2片段分别在非还原条件下显示出100kda大小和在还原条件下显示出25kda大小，这表明正确地制备了所有制备的抗fab’2片段。作为考察六种纯化的抗fab’2片段对它们的同源抗原的结合特异性的结果，四种f(ab’)2片段(clfa
n2n3
、fnbpa
n2n3
、fnbpb
n2n3
和fh)特异性地识别了它们的同源抗原(图24b和24c)，但两种fab’2片段(sdrc
n2n3
和sdre
n2n3
)分别微弱地识别了sdrd
n2n3
和fnbpb
n2n3
(图24c)，表明六种制备的fab'2片段具有所需的特征。
[0271]
如图19a所示，当usa300细胞与fh共孵育时，fitc缀合的抗fh-fab’2片段正确地识别了细菌表面上的募集的fh，表明fh可以结合活的usa300细胞的cwap蛋白。此外，为了研究fh与活细菌的四种cwap
n2-n3
蛋白的结合特异性，首先将金黄色葡萄球菌usa300细胞(2
×
107个细胞)与五种不同的抗cwap fab’2片段(每种20μg蛋白量)一起孵育，然后洗涤细菌细胞以去除未结合的抗cwap f(ab')2片段。然后，将金黄色葡萄球菌usa300细胞与纯化的fh(每种30μg蛋白量)一起孵育，然后洗涤细菌细胞以除去未结合的fh。然后，使用fitc缀合的抗
fh-fab’2片段通过facs分析考察每种抗cwap fab’2片段处理的细菌细胞表面上的募集的fh量(图19a)。与抗fab’2片段未处理的细胞相比，三种抗cwapn2n3-fab’n2n3-fab’2片段(sdre、fnbpa和fnbpb)处理的细菌细胞特异性抑制fh与细菌细胞的结合(图19a(c-e vs a))，但抗clfa fab’2片段处理显示出低水平的抑制作用(图19a的b)。如预期的，20μg的抗sdrc fab’2片段处理不影响fh与usa300细胞的结合(图19a的f)。总之，这些结果再次证实了抗纯化的四种cwap
n2n3
抗体具有阻断fh与在活细菌上表达的天然cwap蛋白结合的能力。
[0272]
基于facs数据，对细菌表面上招募的fh量进行定量(图19b)。如预期的那样，与对照组相比，抗fnbpb-fab’2片段显示出对fh与金黄色葡萄球菌细胞表面的结合60％的抑制(柱6vs柱1)。抑制能力按照抗sdre(50％，柱4)》fnbpa(40％，柱5)》clfa-fab’2(30％，柱6)的顺序逐渐降低。抗sdrc-fab’2片段几乎没有显示任何抑制作用(10％，柱3)。这些结果与图2a的结果一致。
[0273][0274]
纯化的结合兔fh的cwap
n2n3
蛋白及其抗体增强人全血介导的对金黄色葡萄球菌usa300细胞的杀菌活性
[0275]
本发明人假设，如果本发明人能够分别从人静脉内igg(ivig)和兔血清获得人和兔抗cwap
n2n3
结构域识别igg，这些抗fh结合的cwap
n2n3-识别igg将结合金黄色葡萄球菌原始cwap蛋白，并且这种结合将防止金黄色葡萄球菌表面的fh募集，导致宿主吞噬细胞增强c3b-介导的调理吞噬作用。为了证明这一假设，本发明人纯化了人和兔抗cwap
n2n3
识别igg，例如抗clfa
n2n3
、抗sdre
n2n3
、抗fnbpa
n2n3
和抗fnbpb n2n3-igg。使用它们特异性的蛋白质缀合的s琼脂糖柱对这四种igg进行纯化。至于人血清来源，使用了市售人ivig，因为已知健康的人血清含有抗金黄色葡萄球菌cwap特异性抗体(dryla等，2005.临床诊断实验室免疫(clin diagn lab immunol)12:387-98)。通过将cwap
n2n3
结构域预防接种到兔体内三次获得兔血清。将人ivig或抗cwap
n2n3
结构域免疫的兔血清加载到cwap
n2n3
缀合的柱上后，洗脱兔抗cwap
n2n3
结构域识别-igg(图24)和人抗cwap
n2n3
结构域识别-igg(图25)。结果，人ivig含有约0.1％的抗cwaps
n2n3
结构域识别igg，兔血清含有约1％的抗cwap
n2n3
结构域识别igg。作为在还原性和非还原性条件下检测sds-page上这四种igg的纯度的结果(图26)，可以看出纯化的igg在非还原性条件下形成四聚体结构。
[0276]
接下来，本发明人分别通过蛋白质印迹分析或斑点印迹分析考察了纯化的兔和人igg针对其抗原(fnbpa
n2n3
、fnbpb
n2n3
、clfa
n2n3
和sdre
n2n3
结构域)的特异性。如图20a所示，对于7种cwap
n2n3
结构域，四种兔抗cwap
n2n3
识别igg特异性识别其同源抗原，而纯化的人抗cwap-igg对除clfa以外的显示出广泛的识别模式(图20b)。例如，抗sdre
n2n3-igg识别了四种抗原(clfa和三种sdr家族蛋白)。此外，抗fnbpa
n2n3
结构域识别了五种抗原(三种sdr和两种fnbp家族蛋白)。抗fnbpb
n2n3-igg也识别了四种抗原(clfb
n2n3
、sdre
n2n3
和两种fnbp
n2n3
蛋白)(图20b)。这些结果表明，与兔抗cwap
n2n3-igg相比，人抗cwap
n2n3-igg具有更广泛的识别模式。
[0277]
最后，本发明人试图评估cwap
n2n3
结构域或这些纯化的抗体的调理吞噬介导的细菌杀伤活性。将金黄色葡萄球菌usa300细胞(1x105个细胞)与cwap
n2n3
结构域蛋白(5μg)在100μl人全血中于37℃孵育3小时后，测量金黄色葡萄杆菌usa300 lac细胞的集落形成单位(cfu)。当添加各个cwap
n2n3
结构域时，与对照组相比，cfu显著降低(图21a)。这些结果支持
了cwap
n2n3
结构域可能抑制金黄色葡萄球菌细胞表面的fh募集，导致宿主吞噬细胞增加c3b沉积和诱导c3b-介导的调理吞噬作用。以同样的方式，本发明人使用人全血考察了人和兔抗cwap
n2n3-igg介导的对金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞的杀菌作用(图21b和21c)。通过将人抗cwap
n2n3-igg(5μg)与金黄色葡萄球菌usa300 lac细胞(1x105个细胞)在100μl的人全血中于37℃下孵育3小时，cfu相比对照组(如pbs、人ivig和初始兔血清)减少了2至4倍(图21b和21c)。此外，当将抗clfa
n2n3
和fnbpb
n2n3 igg的混合物添加到细菌和全血的混合物中时，cfu相比对照组也减少了(图21b)。此外，当将5μg兔抗clfa、抗fnbpb和抗fnbpa
n2n3-igg的混合物添加到细菌和全血的混合物中时，cfu相比初始兔igg减少了2倍(图21c)。在兔igg的情况下，本发明人观察到四种igg的混合物显示了比单独igg更高的杀菌活性。总之，这些结果支持了在与人全血一起孵育后，抗cwap
n2n3
结构域igg对金黄色葡萄球菌usa300lac菌株具有特异性杀菌活性。
[0278][0279]
实施例3：凝血抑制剂的选择
[0280]
实验方法
[0281]
重组coa和vwbp蛋白的纯化
[0282]
使用大肠杆菌表达系统克隆并表达了聚组氨酸标记的六种重组蛋白(coa
全
、coan、coac、vwbp
全
、vwbpn和vwbpc)。使用q5高保真dna聚合酶(赛默飞世尔科技公司)通过pcr从usa300基因组序列中扩增这些基因。将pcr产物克隆到pet28a载体中，导致表达具有n-末端或c-末端6x his-标签的蛋白质。为了纯化克隆重组蛋白，本发明人将6x his-tag插入n-和c-末端区域。对获得的克隆进行测序以验证正确的构造。用0.2mm异丙基-lβ-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)，使重组蛋白在bl21 plyss大肠杆菌中表达。使用ni-琼脂糖凝胶6快速流动树脂(通用医疗，17-5318-01，5ml)与加载缓冲液(20mm磷酸钠，0.1％triton x-100，150mm nacl，5mm咪唑，ph 7.4)、洗涤缓冲液(20mm磷酸钠，150mm nacl，5mm咪唑，ph 7.4)和洗脱缓冲液(20mm磷酸钠，150mm nacl，500mm咪唑，ph 7.4)纯化表达的蛋白。
[0283][0284]
纯化的重组coa和vwbp结构域蛋白的sds-page分析
[0285]
将3μg各结构域蛋白(coa
全
、coan、coac；vwbp
全
；vwbpn；vwbpc)与4x加样缓冲液(lsb，sh+)混合，然后加载到15％的sds-page凝胶上1小时(35ma，600v，100w)。
[0286][0287]
兔预防接种获得coa和vwbp蛋白抗体
[0288]
将500μg金黄色葡萄球菌的纯化单组分coa和vwbp蛋白溶解在500μl的pbs中，与500μl的完全弗氏佐剂(西格玛奥德里奇)混合，并混合制成乳剂。在每种乳剂皮下注射到兔子中后，两周后，将相同量的抗原与500μl不完全弗氏佐剂(西格玛奥德里奇)混合，并通过皮下途径注射。两周后，从兔耳静脉抽取500μl血液，并通过蛋白印迹分析检测每种抗原的igg的产生。如果产生抗体，则收集兔全血并从中获得血清。将兔血清保存在-80℃，待用。
[0289][0290]
针对coa和vwbp不同结构域蛋白的抗体特异性提高的检测
[0291]
将3μg各结构域蛋白(coa
全
、coan、coac；vwbp
全
；vwbpn；vwbpc)和阴性对照蛋白(bsa)点样在聚偏氟乙烯(pvdf)膜(0.22μm，immobilon-p
sq
转移膜，默克，美国)上并干燥。通过在
室温下浸泡在含5％脱脂乳的tbs溶液中2小时来封闭膜，然后在室温下将膜与在5％脱脂乳中的3,000：1稀释的一抗(抗rcoa
全
和抗rcoan、抗rvwbp
全
、抗rvwbpn)孵育1小时。将膜用tbst洗涤3次10分钟，并与在5％脱脂乳中的6000:1稀释的二抗(小鼠抗兔igg hrp，santacruz，美国)在室温下孵育1小时。然后，将膜用tbst洗涤3次10分钟，并用与ecl试剂(pico epd，elpis-biotec，韩国)一起孵育1分钟。
[0292][0293]
在rpmi培养基中的金黄色葡萄球菌usa300培养过程中coa和vwbp蛋白的表达模式
[0294]
在10ml的rpmi中，将usa300在37℃以180rpm的培养过夜。然后，将1ml细菌种培养液添加到50ml的rpmi中，并在37℃以180rpm进行培养，并在不同时间点(0h、1.5h、3h、6h、9h、12h)取1ml细菌培养液。然后，测定所取的细菌培养液的光密度(od
600
)值，然后以4400
×
g在室温下离心3分钟。将20μl细菌上清液装载到15％的sds-page凝胶上。凝胶电泳后，在4℃下将条带转移至pvdf膜上。通过浸泡在含有5％脱脂牛奶的tbst中于室温下1小时来封闭膜。然后，将膜与抗兔coa
全-和抗兔rvwbp
全-igg作为一抗孵育。将膜用tbst洗涤3次，并与作为二抗的小鼠抗兔-igg-hrp(santacruz，美国)一起孵育。用ecl试剂处理1分钟后获得图像。
[0295][0296]
金黄色葡萄球菌细胞表面表达的coa和vwbp识别蛋白的鉴定
[0297]
将3μg的七种不同的重组mscramm的n2-n3结构域(clfa
n2n3
、clfb
n2n3
、sdrc
n2n3
、sdrd
n2n3
、sdre
n2n3
、fnbpa
n2n3
和将fnbpb
n2n3
)和作为阴性对照的bsa点样在聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(immobilon-p
sq
转移膜，美国默克)上并干燥。通过浸泡在含有5％脱脂乳的tbs中于室温2小时来封闭膜，然后与7μg不同的纯化的重组coa
全
、coan、coac或vwbp
全
；vwbpn；vwbpc孵育，它们溶解在700μl的5％脱脂牛奶中。然后，将膜用tbst洗涤3次10分钟，并与3,000倍稀释的一抗(抗兔coa
全-igg、抗兔coa
n-igg、抗兔coa
c-igg、抗兔-vwbp
全-igg、抗兔-vwbp
n-igg、抗兔-vwbp
c-igg)在rt下孵育1小时。将膜用tbst洗涤3次10分钟，并与6000:1稀释的二抗(小鼠抗兔igg hrp，santacruz，美国)在室温下孵育1小时。然后，将膜用tbst洗涤3次10分钟，并用与增强化学发光(ecl)试剂(pico epd，elpis-biotec，韩国)一起孵育1分钟。
[0298][0299]
利用抗fnbp-f(ab')2片段确认coa与fnbp蛋白之间结合特异性
[0300]
将3μg的coac蛋白或20μg的抗fnbp-f(ab)2′
和抗sdrc-f(ab)2′
片段(作为阴性对照)与细菌细胞(usa300，1
×
105cfu)在4℃下共孵育1小时。孵育后，将样品在4℃下以4,400
×
g离心3分钟，然后用500μl的pbs洗涤细菌颗粒两次。将每个悬浮的细菌沉淀加载到15％梯度的sds-page凝胶上。凝胶电泳后，在4℃下将条带转移至0.45μmpvdf膜(immobilon-p转移膜，美国默克)上。通过浸泡在含有5％脱脂牛奶的tbst中于室温下1小时来封闭膜。然后，将膜与作为一抗的抗兔coa
c-igg一起孵育，然后用tbst洗涤3次，并与作为二抗的小鼠抗兔-igg-hrp(美国santacruz)一起孵育。用ecl试剂处理1分钟后获得图像。
[0301][0302]
不同剂量的纯化coa
全
或vwbp
全
诱导凝血
[0303]
将200μl经水蛭素处理的人血置于5ml圆底管中。然后，加入不同量的coa
全
和vwbp
全
(1μg、5μg、10μg、20μg、40μg、50μg)或pbs。将样品在室温下孵育，通过以1.5小时的间隔将管
c)，然后纯化至同质，如图28所示。这些蛋白质用于通过皮下注射两次预防接种来增加兔多克隆抗coa和vwbp识别igg。作为检查每种纯化蛋白的igg的抗原识别特异性的结果，抗coa
全-igg识别了coa
全
、coan和coac，而抗coa
n-igg仅识别了coa
全
和coan，而不识别coac(图29a)。此外，抗vwbp-igg也显示出对其抗原的特异性结合(图29b)。这些结果表明，四种生成的coa和vwbp-igg对其抗原具有特异性。
[0320][0321]
金黄色葡萄球菌usa300培养过程中coa和vwbp蛋白的表达模式
[0322]
由于获得了所有六种蛋白质及其兔多克隆抗体，因此使用收集的金黄色葡萄球菌usa300菌株的培养rpmi培养基在不同时间点通过蛋白质印迹分析检测了这两种分泌酶的表达模式。如图30a所示，ccoa
全
蛋白(60kda)在培养1.5小时起分泌，在培养3小时时被最大限度地检出，然后被检出直到9小时，量逐渐减少。如预期的那样，金黄色葡萄球菌蛋白a(45kda)在培养上清液中积累，直到孵育3小时(红色箭头)。然而，vwbp(50kda)在培养1.5小时时被最大限度地检出，并且被检出直到12小时，量逐渐减少(图30b)。蛋白a分泌显示出与coa相似的模式(图30b)。这些结果表明，coa
全
蛋白和vwbp
全
蛋白在1.5小时和3小时之间最大限度地分泌。
[0323][0324]
金黄色葡萄球菌细胞表面表达的coa和vwbp识别蛋白的鉴定
[0325]
本发明人试图筛选在细菌生长期间在细菌表面上表达的coa和vwbp识别蛋白。首先，将金黄色葡萄球菌细胞壁相关蛋白(cwap)作为这两种分泌酶的识别分子。本发明人使用7种重组cwap蛋白通过斑点印迹免疫分析法筛选coa-和vwbp-识别蛋白(图31)。在将这七种cwap蛋白和作为对照的bsa点样到pvdf膜条上后，将每个条带与六种不同的纯化的重组coa和vwbp结构域蛋白共同孵育，然后将每个条带与每个结构域特异性iggc孵育，以检查哪种coa或vwbp结构域蛋白可以结合cwap
n2n3
蛋白。如图31a所示，coa
全
蛋白、coan和coac蛋白特异性识别了fnbpa
n2n3
和fnbpb
n2n3
结构域。在相同条件下，vwbp
全
蛋白显示出对五种不同的n2-n3结构域(clfb
n2n3
、sdrc
n2n3
、sdre
n2n3
、fnbpa
n2n3
和fnbpb
n2n3
结构域)的结合能力，且vwbpn结构域显示出对fnbpa
n2n3
的强结合和对其他三种cwap蛋白的弱结合(图31b)。然而，vwbp-c蛋白显示出与除clfa
n2n3
和sdrd
n2n3
外的cwap蛋白的六种n2-n3结构域更广泛的结合能力。这些结果说明，coa蛋白可以识别在金黄色葡萄球菌细菌表面表达的fnbp蛋白，表明两种金黄色葡萄球菌fnbp cwap蛋白可以用作coa识别蛋白。然而，vwbp蛋白被几种金黄色葡萄球菌cwap更广泛地识别。
[0326][0327]
利用抗fnbp-f(ab')2片段确认coa与fnbp蛋白之间结合特异性
[0328]
接下来，本发明人观察了coa蛋白和两种fnbp
n2n3
蛋白之间的结合特异性。本发明人试图使用金黄色葡萄球菌usa300活菌、coa
全
和抗fnbp-f(ab’)2片段来确认这种特异性相互作用。制备抗fnbp-f(ab’)2片段的原因是，由于众所周知的金黄色葡萄球菌蛋白a通过与igg fc结构域结合来消耗添加的igg，本发明人预期抗fnbp-igg将不能充分抑制coa
全
和usa300细胞的初始fnbp蛋白之间的相互作用。通过使用抗fnbp-f(ab')2片段，本发明人假设将有可能看到coa和两种fnbp
n2n3
蛋白之间的结合是否是特异性的。如图32所示，当将金黄色葡萄球菌细胞与coac蛋白或coa c
抗sdrc-f(ab’)2片段的混合物共孵育时，coac蛋白被
募集到细菌颗粒上(泳道1和2)。然而，当细菌细胞与coac和抗fnbpa
n2n3-f(ab’)2片段或抗fnbpb
n2n3-f(ab’)2片段一起孵育时，添加的coac没有被募集到细菌沉颗上(泳道3和4)，表明在细菌表面表达的初始fnbp蛋白和coac蛋白之间的相互作用被抗fnbp-f(ab’)2片段特异性抑制了。这些结果支持了coa蛋白识别细菌表面表达的fnbp蛋白。
[0329][0330]
coa
全
或vwbp
全
诱导凝血及抗coa
全-igg和vwbp
全-iggs的凝血抑制作用
[0331]
接下来，本发明人尝试使用人全血考察重组coa
全
和vwbp
全
的生物学功能。当人血与不同剂量的coa
全
蛋白孵育时，加入1μg的coa
全
蛋白使得血液凝固，但加入5μg的vwbp
全
蛋白使得血液凝固(图33a)，表明纯化的重组coa
全
蛋白和vwbp
全
蛋白是功能活性蛋白。接下来，本发明人考察了抗coa
全-igg和抗vwbp
全-igg对coa和vwbp介导的凝血的作用(图33b)。当将80μg抗coa
全-igg或80μg抗vwbp
全-igg添加到人血与5μg coa
全
或vwbp
全
蛋白的混合物中时，酶介导的凝血被抑制。这些结果表明，产生的抗coa
全
和vwbp
全-igg可以体外抑制coa
全-或vwbp
全-蛋白介导的凝血反应。
[0332][0333]
usa300培养基介导的人凝血可被抗coa
全-igg和抗vwbp
全-igg抑制
[0334]
如图30所示，本发明人在培养金黄色葡萄球菌300lac细胞后已经检测到分泌的coa和vwbp。因此，本发明人考察了分泌的coa和vwbp介导的凝血是否可以被抗coa
全-igg和抗vwbp
全-igg阻断。当将200μl的人全血与100μl的usa300培养基(含约0.5μl的coa和0.5μl的vwbp蛋白)一起孵育时，在孵育1.5小时后血液凝固(图34，试管4)。在该条件下，当加入80μg纯化的抗coa
全-igg或抗vwbp
全-igg时，血液没有凝固(试管6和7)。此外，当将各40μg的抗coa
全-igg或40μg抗vwbp
全-igg添加到含coa或vwbp的血液中时，诱导了凝血(试管8)。这些结果表明，添加的igg抑制了活细菌分泌的coa或vwbp的凝血活性。
[0335][0336]
仅coan和vwbpn结构域而不是coac和vwbpc蛋白诱导人凝血
[0337]
为了确定coa和vwbp蛋白的哪些域参与人凝血，将全血与四种不同的蛋白(coan、vwbpn、coac和vwbpc)一起孵育。当孵育1.5小时后考察凝血时，两种n端结构域(coan和vwbpn)诱导了凝血，但两种c端结构域不诱导凝血(图35)。这些结果表明，凝血酶原结合n端结构域而不是纤维蛋白原结合的c末端结构域对于人凝血至关重要。
[0338][0339]
coan和vwbpn介导的人凝血或由usa300分泌的coa和vwbp导致的凝血被抗coa
n-igg和抗vwbp
n-igg抑制，而不是抗coac和抗vwbp
c-igg
[0340]
接下来，由于本发明人已经观察到coan或vwbpn对于凝血的重要性，因此本发明人使用了两种触发蛋白来考察抗coa
n-或vwbp
n-特异性igg能否阻断这些蛋白介导的凝固。一种触发蛋白是usa300培养基中含有的coa和vwbp(图36a)，纯化的重组coan或vwbpn是第二个触发蛋白(图36b)。当将抗coa
n-igg或抗vwbp
n-igg添加到含有培养基和血液的试管(试管2)中时，不会诱导凝血(试管3和4)，但是添加抗coa
c-igg或抗vwbp
c-igg(管5和6)诱导了凝血。此外，coan和vwbpn介导的人凝血被抗coa
n-igg和抗vwbp
n-igg抑制(图36b，试管4和5)。这些结果表明，抗coa
n-igg和抗vwbp
n-igg将是在金黄色葡萄球菌感染期间预防coa或vwbp介导的人凝血的极有用的分子。
[0341][0342]
抗coa
全-igg或vwbp
全-igg体内凝血抑制作用
[0343]
本发明人发现coa
全
、vwbp
全
、coan和vwbpn结构域具有人凝血诱导活性，并且用这四种蛋白质免疫兔获得的每种多克隆抗体选择性地抑制由这些蛋白质引起的凝血反应。因此，本发明人使用经由向兔子注射coa
全
和vwbp
全
蛋白而获得的抗体进行了体内被动免疫。
[0344]
在四只兔子中，第一组的两只兔子通过耳静脉注射pbs，然后注射金黄色葡萄球菌usa300菌株(1.6
×
108cfu)，第二组的两只兔子通过左耳静脉注射1mg的抗coa
全-igg(由coa
全
蛋白缀合的琼脂糖柱纯化获得)和1mg的抗vwbp
全-igg(由vwbp
全
蛋白缀合的琼脂糖柱纯化获得)的混合物，并1小时后经右耳静脉注射usa300株(1.6
×
108cfu)。
[0345]
[表4]体内实验的兔组构成[表4]体内实验的兔组构成
[0346]
作为以12小时间隔测量每只兔子的体重的结果，组1中的1号兔子在138小时后死亡，但组2中的所有兔子存活长达167小时，并且显示出最少的体重减轻(图38)。作为根据这些测量结果计算存活率的结果，组2中注射抗coa
全-igg和抗vwbp
全-igg(每种1mg)的兔子(2号和3号)存活7天，并显示出最少的体重减轻(图39)。从这些结果，体外证实的抗coa-igg和抗vwbp-igg的凝血抑制作用被在体内再次证实。
[0347][0348]
实施例4：与抗生素联合给药效果的确认
[0349]
为了使在实施例1中发现的四种金黄色葡萄球菌衍生毒素的组合对mrsa传染病治疗效果最大化，本发明人探索了一种最佳抗生素，当与毒素共同施用时，该最佳抗生素可以完全去除感染个体的肾脏中的残留mrsa菌株。结果，如后文所述，本发明人证实，当万古霉素和替考拉宁与本发明的疫苗组合物共同施用时，存在显著的协同效应。
[0350][0351]
4-1:万古霉素
[0352]
实验方法
[0353]
首先，将总共80μg的四种抗原(hlga、luks、hla
h35l
和luka
e323a
b)(每种抗原20μg)溶解在250μl的盐水中，与相同体积的明矾佐剂混合，孵育1小时，然后以2周的间隔肌肉注射3次。两周后，从五只免疫的兔子中收集血清，并使用蛋白a柱分离和纯化血清中的总igg。将纯化的总igg以10mg/kg/兔的浓度静脉注射到兔子中，然后将万古霉素(7.5mg/kg/兔)肌肉注射到兔子中。接下来，用金黄色葡萄球菌usa300 mrsa菌株(1
×
109个细胞/兔)感染兔子，并在15天内考察兔子的存活率、肾脏中残留细菌的数量和在肾脏中产生的脓肿模式。
[0354]
将20只兔子(新西兰白兔)分为4组，每组5只兔子。对于组1(g1-注射明矾-igg)，将从单独注射明矾的兔血清中通过蛋白a柱纯化得到的多克隆igg以10mg/kg的剂量静脉注射到兔体内，然后用1
×
109的cfu/兔的金黄色葡萄球菌usa300菌株感染兔子。
[0355]
对于组2(g2-注射抗4抗原-igg混合物)，将通过将总共80μg的4种抗原(hlga、luks、hla
h35l
和luka
e323a
)(每种抗原20μg)溶解在250μl的盐水中，将抗原溶液与相同体积的明矾混合，以2周的间隔肌内注射混合物三次来免疫兔，并通过蛋白a柱从兔血清中纯化这些抗原的igg获得的多克隆igg以10mg/kg的剂量静脉注射到五只兔子中，用1
×
109的cfu/兔的金黄色葡萄球菌usa300菌株感染兔子。
[0356]
对于组3(g3-单独注射万古霉素)，将万古霉素以7.5mg/kg的剂量肌肉注射到五只兔子中，每天两次，持续5天(共10次)，然后用1
×
109cfu/兔的金黄色葡萄球菌usa300注射兔子。
[0357]
对于组4(g4-注射抗4抗原-igg-混合物-万古霉素)，将使用蛋白a柱从与组2中相同的方式抗原免疫后获得的血清中纯化igg而获得的多克隆igg以10mg/kg的剂量静脉注射到兔体内，然后将万古霉素以7.5mg/kg的剂量肌肉注射到兔子，每天两次，持续5天(总共10次)，然后用1
×
109的cfu/兔的金黄色葡萄球菌usa300菌株感染兔子。
[0358]
在四组感染了金黄色葡萄球菌usa300 mrsa菌株后，每天称重兔子，观察体重变化直到第14天。在第15天，对兔子实施安乐死，收获肾脏，并测量产生的脓肿和肾脏中的残留细菌(菌落形成单位，cfu)。
[0359][0360]
实验结果
[0361]
作为考察感染mrsa后2周每组中兔子的存活率的结果，如图40a所示，组4(g4-注射抗-4抗原-igg-混合物-万古霉素)中的5只兔子存活了100％，然而组3(g3-单独注射万古霉素)中，一只兔子在第3天死亡，一只兔子在第5天死亡，表明存活率为60％，在单独注射明矾的组1(g1)中，所有5只兔子均在第3天死亡，表明存活率为0％。在组2(g2-注射抗-4抗原-igg混合物)中，仅注射了从用四种抗原免疫的兔子纯化的抗体，2只兔子在第3天死亡，2只兔子在第4天死亡，表明直到第14天的存活率为20％。从上述结果可以看出，当万古霉素与由本发明中发现的四种抗原诱导的抗体混合物共同给药时，显示出显著改善的治疗效果。
[0362][0363]
作为收集和观察组2和组4兔子的肾脏的结果，在组2的5只兔子中的4只死亡兔子的肾脏中观察到脓肿，而在组4的5只兔子的肾脏中没有观察到脓肿(图40b)。从这些结果证实，针对四种金黄色酿脓葡萄球菌衍生毒素抗原的抗体在mrsa感染期间通过中和分泌的毒素保护了免疫细胞，但是当它们与万古霉素共同给药时，它们可以以各种方式保护宿主，同时更完全地去除细菌。
[0364][0365]
4-2:替考拉宁
[0366]
实验方法
[0367]
将20只兔子(新西兰白兔)分为4组，每组5只兔子。将以2周间隔用四种疫苗免疫3次的10只兔子分为两组。对于组2(g2)中的五只兔子，检测了用usa300mrsa菌株预防接种后7天的存活率、肾脏中残留细菌的数量和肾脏中产生的脓肿的图案，组4(g4)中的其余5只兔
子以与g2相同的方式感染usa300 mrsa菌株，并在3小时后肌肉注射替考拉宁。将剩下的10只兔分为单独注射生理盐水的组1(g1)(由5只兔组成)和单独注射替考拉宁的组3(g3)。
[0368]
组1(g1-单独注射生理盐水)以2周的间隔单独注射生理盐水三次，并用金黄色葡萄球菌usa300菌株以8.5
×
107cfu/kg的浓度进行感染。
[0369]
对于组2(g2-免疫4种抗原混合物三次)，将四种抗原[hlga(40μg/兔)、luks(30μg/兔)、将hla
h35l
(25μg/兔)和luka
e323a
(40μg/兔)的混合物溶解于135μl的盐水中并与135μl的明矾混合，然后以2周的间隔肌内注射3次抗原混合物免疫兔子。在血清igg滴度充分增加的7天后，用金黄色葡萄球菌usa300菌株以8.5
×
107cfu/kg的浓度来感染兔子。
[0370]
对于组3(g3-单独注射替考拉宁)，用金黄色葡萄球菌usa300菌株以8.5
×
107cfu/kg的浓度肌肉内注射感染五只兔子，3小时后，肌肉注射一次替考拉宁(7.5mg/kg)。
[0371]
对于组4(g4-注射抗-4抗原-igg-混合物-替考拉宁)，以与组2中相同的方式，以2周的间隔，用四种抗原(hlga、luks、hla
h35l
和luka
e323a
)免疫兔子三次。7天后，当血清igg滴度充分增加，用金黄色葡萄球菌usa300菌株以8.5
×
107cfu/kg的浓度来感染兔子，并在3小时后，肌肉注射一次替考拉宁(7.5mg/kg)。
[0372]
第2组和第4组的兔子用抗原免疫后，每周收集血液，并通过elisa定量针对四种抗原的igg滴度。3次免疫后7天，兔子感染金黄色葡萄球菌usa300mrsa菌株并每天称重，观察体重变化直到第7天。在第7天，对兔子实施安乐死，收获肾脏，并测量产生的脓肿和肾脏中的残留细菌(菌落形成单位，cfu)。
[0373][0374]
实验结果
[0375]
每周收集兔血液，同时免疫四-抗原混合物三次，并测量针对血清中每种抗原的igg滴度(图41a)。如组2的抗体滴度(图41a(i))和组4的抗体滴度(图41a(i))所示，各抗原一致地诱导了抗体产生，并且igg滴度保持恒定。抗体滴度在第二次预防接种后的第42天略有下降，但在第三次预防接种后的第49天再次增加，因此兔感染了usa300 mrsa株。elisa结果如图2a-ii所示，表明五只兔子在组4中的五只兔子的血清中产生的抗体滴度的平均值。可以看出，测量的igg值的模式几乎与组2中相似，并且针对每种抗原的igg值在3次免疫后增加。
[0376]
作为检查各组中兔子感染mrsa后7天的存活率，组3(g3-单独注射替考拉宁)和组4(g4-注射4-抗原混合物以2周的间隔免疫3次，然后用usa300mrsa感染，然后肌内注射替考拉宁)中的10只兔子直到第7天存活率100％，然而，组2(g2-4抗原混合物免疫3次)中，在感染usa300 mrsa后一只兔子在第1天死亡，一只兔子在第5天死亡，表明存活率为60％，在单独注射pbs的组1(g1)中，一只兔子在第1天、两只兔子在第4天和一只兔子在第7天死亡，表明存活率仅为20％。综上所述，这些结果表明，当替考拉宁与本发明的四种抗原混合物(其诱导了有效的活性免疫)共同给药时，感染mrsa的个体的存活率显著提高。
[0377]
图41c显示了切碎活兔肾脏后保留的残余细菌数(cfu值)的计数结果。以2周的间隔三次注射四种抗原的混合物的组2和单独注射替考拉宁的组3中每一组，相比于单独注射pbs的组1，肾脏中残余细菌数显示出统计学意义上地显著减少，并且组4(g4)(将替考拉宁与四种抗原共同给药)，与组1相比，残余细菌数量平均减少约100倍。
[0378]
每组采集和观察至第7天的活兔肾脏的结果如图41d所示。组3和组4的兔子的肾脏
中显示了相似存活率，在组3的6只兔子中，第12号兔子的肾脏中观察到脓肿，第13号兔子的肾脏颜色变为黑色。另一方面，除第6号兔子外，组4的6只兔子的肾脏中未观察到脓肿。同时，在单独注射pbs的组1中，第2号兔子的肾脏是从死亡的兔子中采集的，而第3号兔子的肾脏是从存活的兔子上采集的，这些肾脏都有脓肿。
[0379]
如上所述，在本发明中发现的四种抗原是抗原的最少组合，并且可以彻底抑制由金黄色葡萄球菌的11种毒素引起的细胞裂解。除了这种抗原组合的优异治疗效果之外，本发明人还发现，当该抗原组合与万古霉素、替考拉宁或其组合共同给药以完全去除甚至残留在感染个体的肾脏中的细菌时，被感染个体肾脏中残留的细菌几乎可以完全清除，感染个体的存活率也可以进一步提高。
[0380]
尽管已经参考特定特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅是其优选实施例，而不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物，其包含作为活性成分的：至少三种选自下组的金黄色葡萄球菌衍生毒素：α-溶血素(hla)、杀白细胞毒素s(luks)、杀白细胞毒素ab(lukab)和γ-溶血素(hlga)；特异性识别毒素的抗体或其抗原结合片段；或编码毒素的核苷酸。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述hla为第35位氨基酸残基被取代的hla。3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，第35位氨基酸残基被leu取代。4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述lukab为第323位氨基酸残基被取代的lukab。5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，第323位氨基酸残基被ala取代。6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)。7.一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物，其包含作为活性成分的至少一种选自下组的蛋白：凝集因子a(clfa)、纤维蛋白结合蛋白a(fnbpa)、纤维蛋白结合蛋白b(fnbpb)及其功能部分；或特异性识别所述蛋白的抗体或其抗原结合片段；或编码所述蛋白的核苷酸。8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述功能部分包括蛋白的n2-n3结构域。9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含作为活性成分的包含clfa的n2-n3结构域的部分片段和包含fnbpb的n2-n3结构域的部分片段；特异性识别所述片段的抗体或其抗原结合片段，或者编码所述片段的核苷酸。10.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)。11.一种用于预防或治疗由金黄色葡萄球菌感染引起的血栓性疾病的组合物，其包含作为活性成分的至少一种选自下组的蛋白：凝固酶(coa)、血管性血友病因子结合蛋白(vwbp)及其功能部分；或特异性识别所述蛋白的抗体或其抗原结合片段；或编码所述蛋白的核苷酸。12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，coa的功能部分包括自coa蛋白n端起的284个连续氨基酸残基。13.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，vwbp的功能部分包括自vwbp蛋白n端起的253个连续氨基酸残基。14.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)。15.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，金黄色葡萄球菌感染引起的血栓性疾病是选自下组中的至少一种：卒中、脑梗死、脑血栓、脑栓塞、腔隙性脑梗死、急性冠脉综合征、心绞痛、主动脉瓣狭窄、心肌梗死、束支传导阻滞、脑缺血、急性缺血性动脉血管事件、血栓性静脉炎、静脉血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、周围血管疾病、动脉粥样硬化、血管痉挛和再狭窄。16.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还含有糖肽类抗生素。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述糖肽类抗生素选自下组：万古霉素、替考拉宁，和其组合。18.一种用于与如权利要求1至6中任一项所述的组合物共同施用的组合物，其包含作为活性成分的糖肽类抗生素。19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述糖肽类抗生素选自下组：万古霉素、替考拉宁，和其组合。

技术总结
本发明涉及一种用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物以及一种用于预防或治疗由金黄色葡萄球菌感染引起的血栓性疾病的组合物。根据本发明，即使用抗原的最小组合，通过使用针对金黄色葡萄球菌毒素的抗体的交叉反应性可以彻底抑制金黄色葡萄球菌毒素的细胞溶解。本发明还可以作为一种有效的治疗组合物，通过诱导调理吞噬作用和有效地控制受感染的受试者的血液凝固，来全面消除或缓解由感染引起的综合病理状况，而不是逐个地改善由金黄色葡萄球菌感染引起的个体症状。金黄色葡萄球菌感染引起的个体症状。金黄色葡萄球菌感染引起的个体症状。


技术研发人员：李福律 安东浩
受保护的技术使用者：釜山大学校产学协力团
技术研发日：2021.09.08
技术公布日：2023/9/16