鼻粘膜的间充质干细胞及应用

1.本发明涉及细胞治疗技术领域，具体涉及鼻粘膜的间充质干细胞及应用。


背景技术：

2.目前，用于移植修复骨缺损的主要种子细胞主要有：胚胎干细胞(escs)、诱导多能干细胞(ipscs)、骨髓间充质干细胞(bmscs)和脂肪干细胞(adscs)等。
3.胚胎干细胞(embryonicstemcell，escs，简称es、ek或esc细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，es细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
4.诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。分化的细胞在特定条件下被逆转后，恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成新个体的过程即为细胞重编程。
5.骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。
6.脂肪组织在人体内储量丰富，通过抽脂从中获得的大量脂肪干细胞(adscs)，有自我更新增殖及多向分化潜能，可向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子而抗炎、抗氧化，可抵抗氧自由基的损伤，有望成为修复受损的组织和器官的干细胞来源。
7.上述细胞移植尽管可部分促进骨缺损的修复，但是在实际应用方面仍然受到以下一些因素的制约，如escs来源困难且存在伦理问题；ipscs的诱导过程比较复杂体内移植时易致瘤；adscs和bmscs取材过程中较为困难，对供体打击较大，同时高龄群体骨髓内的bmscs含量较低。因此，寻找新的更合适的干细胞(可来源于自体，细胞数量足够、可塑性强、可受局部微环境诱导分化为成骨细胞)作为种子细胞，用于自体移植修复骨缺损。
8.为此，本发明旨在提供鼻粘膜的间充质干细胞及应用，以解决上述问题。


技术实现要素：

9.本发明的目的是为了解决上述问题，提供鼻粘膜的间充质干细胞及应用。
10.为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
11.本发明提供了鼻粘膜的间充质干细胞的应用，所述鼻粘膜的间充质干细胞来源于自体，所述鼻粘膜的间充质干细胞作为种子细胞在自体移植修复骨缺损中的应用。
12.进一步地，鼻粘膜的间充质干细胞用于骨缺损修复的药物的制备。
13.本发明解决技术问题的难度及意义在于：
14.骨缺损是骨科中常见且重要的临床问题，如何有效地修复bd是骨科领域的研究热点和难点。鼻粘膜来源的外胚层间充质干细胞(ectomesenchymalstemcells,emscs)移植是
治疗骨缺损最有应用前景的治疗策略之一。此策略的主要治疗原理是：补充外源性emscs在损伤部位分化为成骨细胞，桥接损伤部位，促进bd损伤修复。
15.与现有技术相比，本方案的有益效果：
16.本发明的提供了将鼻粘膜的间充质干细胞来源于自体，将其作为种子细胞应用于自体移植修复骨缺损，其细胞数量足够、可塑性强、可受局部微环境诱导分化为成骨细胞，且克服了现有技术中escs来源困难且存在伦理问题，以及ipscs的诱导过程比较复杂体内移植时易致瘤，adscs和bmscs取材过程中较为困难，对供体打击较大，同时高龄群体骨髓内的bmscs含量较低的问题。
附图说明
17.图1是本发明实施例中体外分离的emscs高表达间充质干细胞标志物和神经嵴标志物；
18.图2是本发明实施例中体外分离培养的emscs具有多向分化的能力；
19.图3是本发明实施例中micro-ct和he染色评价emscs移植治疗免疫缺陷大鼠颅骨缺损；
20.图4是本发明实施例中体外分离培养的emscs在体外可定向诱导向成骨细胞分化。
具体实施方式
21.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
22.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
23.实施例1：
24.本发明实施例提供的方案如上述发明内容所述：提供了鼻粘膜的间充质干细胞的应用，所述鼻粘膜的间充质干细胞来源于自体，所述鼻粘膜的间充质干细胞作为种子细胞在自体移植修复骨缺损中的应用。
25.并且，鼻粘膜的间充质干细胞应用于骨缺损修复的药物的制备的。
26.在本实施例的方案中，鼻粘膜的间充质干细胞可来源于自体，细胞数量足够、可塑性强、可受局部微环境诱导分化为成熟神经元。通过本发明的方案，克服了现有技术中采用胚胎干细胞(escs)、诱导多能干细胞(ipscs)、骨髓间充质干细胞(bmscs)和脂肪干细胞(adscs)等移植促进骨缺损的修复中受到的制约的问题，如escs来源困难且存在伦理问题；ipscs的诱导过程比较复杂体内移植时易至瘤；adscs和bmscs取材过程中较为困难，对供体打击较大，同时高龄群体骨髓内的bmscs含量较低。
27.以下为本发明实施例方案的具体实验：
28.体外分离培养人源emscs
29.利用颅底内镜在无菌条件下取出中鼻甲鼻粘膜，约100mg，0.3x0.3cm大小组织。充分剪碎，然后0.25％胰酶，37℃环境中消化10min，终止消化后，再次用眼科剪充分将其剪
碎，500r/min离心，将碎组织接种至含有10％fbs的dmem/f12培养瓶中，37℃、5％co2饱和湿度条件下培养，每3d更换培养液1次，待原代细胞生长融合至培养瓶底75％左右时，进行传代培养。
30.在发明上述实施例1中，如图1所示，其为体外分离的emscs高表达间充质干细胞标志物和神经嵴标志物，该细胞是来源神经嵴的间充质干细胞。如图2所示，其为体外分离培养的emscs具有多向分化的能力。
31.实施例2
32.将体外分离培养的emscs移植到免疫缺陷的实验动物颅骨缺损模型体内，具体实施方案：大鼠经七氟烷麻醉后，剪开头皮，用直径为8mm的牙科钻，磨去8mm的颅骨，造成颅骨缺损模型；将体外分离培养的第四代emscs负载在纤维蛋白胶内，每只大鼠予以1x106的细胞量，在第12周时，对大鼠颅骨行micro-ct和组织学观察颅骨再生情况。
33.如图3所示，其为micro-ct和he染色评价emscs移植治疗颅骨缺损的效果。
34.图2中：移植emscs至大鼠颅骨缺损处，第12周时，micro-ct可见缺损处有新生骨，而对照组未观察到明显新生骨；对实验动物行he染色，可见移植emscs组颅骨缺损处大量新生骨组织，而对照组缺损处未见新生骨组织。
35.实施例3：
36.体外分离培养的emscs在体外可定向诱导向成骨细胞分化，在诱导emscs成骨分化第7天，用碱性磷酸酶(alp)染色；诱导分化第21天时行茜素红s(ars)染色，可以观察成骨诱导分化emscs高表达碱性磷酸酶和钙结节。参见图4所示，体外定向成骨诱导emscs，经过诱导后，emscs可高表达alp以及钙结节染色阳性。
37.以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.鼻粘膜的间充质干细胞的应用，其特征是：所述鼻粘膜的间充质干细胞来源于自体，所述鼻粘膜的间充质干细胞作为种子细胞在自体移植修复骨缺损中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征是：鼻粘膜的间充质干细胞用于骨缺损修复的药物的制备。

技术总结
本发明公开了鼻粘膜的间充质干细胞及应用，涉及细胞治疗技术领域，其技术要点为：所述鼻粘膜的间充质干细胞来源于自体，所述鼻粘膜的间充质干细胞作为种子细胞在自体移植修复骨缺损中的应用。本发明的提供了将鼻粘膜的间充质干细胞来源于自体，将其作为种子细胞应用于自体移植修复骨缺损，其细胞数量足够、可塑性强、可受局部微环境诱导分化为成骨细胞，克服了现有技术中ESCs来源困难且存在伦理问题，以及iPSCs的诱导过程比较复杂体内移植时易致瘤，ADSCs和BMSCs取材过程中较为困难，对供体打击较大，同时高龄群体骨髓内的BMSCs含量较低的问题。低的问题。低的问题。


技术研发人员：鲁晓杰 史文涛 张轩 卞璐 伍祎晴 高岩
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.07.21
技术公布日：2023/9/16