一种白芷原生质体高效分离的方法

1.本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种白芷原生质体高效分离的方法。


背景技术：

2.原生质体是指植物细胞中除去细胞壁后有生命活性的部分，包括细胞膜、细胞质和细胞核，是能存活的植物细胞的最小单位。由于原生质体失去了细胞壁的阻碍作用，对dna、病毒颗粒、细胞器、染色体等外源遗传物更易摄取，是作为研究植物生理学、细胞生物学、分子生物学等方向的理想材料，其主要用于细胞融合、亚细胞定位、蛋白质互作、蛋白质活性分析、基因表达调控和新品种选育等领域。截止目前，原生质体的制备与转化在烟草(nicotiana tabacum linn)、拟南芥(arabidopsis thaliana)等模式植物以及水稻(oryza sativa)、玉米(zea mays)等大宗作物中已得到广泛应用。
3.白芷为多年生伞形科植物，作为一味应用历史悠久的药食两用中药，含有香豆素等多种有效活性成分，具有极高的药用价值和广泛应用前景。随着转录组测序资源的积累，白芷分子生物学、次生代谢与调控等研究都飞跃到了新的阶段。目前，白芷细胞及分子水平的研究相对滞后，且农杆菌和基因枪介导的基因功能研究技术在白芷中更是很难实现；其主要表现在不易进行遗传转化、体外再生困难以及生命周期长等方面问题突出，且遗传转化效率低、耗时长，严重禁锢了白芷生物学研究的发展与探索，因此高效、便捷和完善的生物技术研究体系变得尤为重要。原生质体中瞬时表达为基因相关方面的研究提供了一种快速而高效的技术手段，并极大的缩短白芷的培养时间，提高遗传转化效率，为研究蛋白亚细胞定位和基因表达的调控提供一种方便而有效的实验系统，因此原生质体的分离、转化及其应用对于白芷研究具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种白芷原生质体高效分离的方法。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种白芷原生质体高效分离的方法，包括以下步骤：
6.s1、白芷的培养：选取含有3片以上基生叶的白芷进行黑暗培养，黑暗培养的时间为20-60天，优选为25-55天，更优选为25-35天；
7.s2、原生质体材料的选择：选取步骤s1处理后白芷的黄化叶片作为原生质体材料；所述黄化叶片是从白芷基生叶中新抽出长大的黄化叶；
8.s3、原生质体的分离：将步骤s2得到的所述黄化叶片进行酶解，其中所述酶解使用的酶解液含有1.3-1.7％的纤维素酶、0.6-0.8％的离析酶和0.35-45mol/l的甘露醇。
9.进一步的，步骤s1中，所述白芷含有3-5片基生叶。
10.进一步的，步骤s1中，含有3片以上基生叶的白芷由白芷种子在光照条件下培养20-40天获得，优选为25-35天。
11.进一步的，步骤s3中，所述酶解的时间为5h
±
30min。
12.进一步的，步骤s3中，所述酶解液的用量为：每克黄化叶片使用10-80ml酶解液。
13.本发明的有益效果是：经过本发明提供的分离的方法得到的白芷原生质体，具有产量高、细胞完整、杂质少，以及基因转化率高的特点。
附图说明
14.图1为白芷原生质体制备的植物材料；
15.图2为白芷黄化叶片原生质体的制备；
16.图3为表3中试验6号的原生质体产量及活力(原生质体用fda染色，有gfp荧光的为有活力的原生质体)；
17.图4为不同因素处理下原生质体产量及活力；
18.图5为原生质体转化nac20-3301质粒后的荧光图片(有gfp荧光的为转化成功的原生质体)；
19.图6为原生质体转化nac20-3301质粒后基因nac20表达量；
20.图7为川芷3号白芷品种的原生质体细胞(原生质体用fda染色，有gfp荧光的为有活力的原生质体)；
21.图8为bzb003白芷品系的原生质体细胞(原生质体用fda染色，有gfp荧光的为有活力的原生质体)。
具体实施方式
22.下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
23.1、实验材料和方法
24.1.1供试植物材料培养
25.本发明使用“川芷2号”白芷品种作为供试材料，其原植物为杭白芷angelica dahurica(fisch.ex hoffm.)benth.et hook.f.var.formosana(boiss.)shan et yuan。
26.生长条件为：长出4片基生叶后，黑暗条件下培养生长一个月。参见图1，图中该植物材料的左上角两片叶片呈明显黄色。(注：直接采用种子放在黑暗中生长、将组培苗转至黑暗环境下培养等方式均不能成功实现白芷黄化苗的产生)
27.1.2质粒载体
28.实验所用植物表达载体为pcambia3301-35s-egfp-kana。
29.构建方法为：将nac20基因构建到植物表达载体pcambia3301-35s-egfp-kana质粒上，构建成为nac20-3301质粒。
30.1.3主要试剂
31.纤维素酶采用日本yakult cellulase r-10，离析酶采用日本yakult macerozyme r-10，peg4000(聚乙二醇4000)采购自成都市科隆化学品有限公司，cacl2、mgcl2、nacl、kcl、mes、甘露醇等购自西陇化工股份有限公司。
32.1.4白芷叶肉原生质体的制备部位
33.选取生长状况良好的白芷绿色叶片、黄化叶片、绿色茎秆、黄化茎秆、根系为试验
材料，进行原生质体提取。
34.1.5白芷叶肉原生质体的制备条件
35.称取0.1g植物组织，利用切丝法分别切成0.5-1.0mm的细丝，将切丝后的细丝放入5ml酶解液充分混合，利用循环水泵真空干燥器抽真空30min，之后立即转移至黑暗条件下，进行原生质体的分离。酶解后，用70μm细胞筛过滤除去较大组织碎块，滤液转至圆底离心管，100g、4℃、升降速为5离心2min收集原生质体，除去上清液。加2ml w5(154mmol/lnacl+125mmol/l cacl2+5mmol/l kcl+5mmol/l葡萄糖+2mmol/l mes)溶液清洗原生质体3次，离心弃上清，加入1ml mmg(0.4mol/l甘露醇，15mmol/l mgcl2，4mmol/l mes，ph 5.7)溶液重悬，即可获得纯化的原生质体。
36.为探究影响白芷叶肉原生质体产量的纤维素酶含量、离析酶含量、甘露醇浓度及酶解时间，利用正交实验对该4因素3水平进行实验设计。设计方案如表1。
37.表1白芷原生质体制备的正交试验因素水平
[0038][0039]
1.6原生质体转化
[0040]
在2ml离心管中加入10μl纯化后浓度为1μg/μl的nac20-3301质粒，随后加入100μl浓度为2
×
105个/ml原生质体，轻轻混匀，再加入peg-ca
2+
溶液110μl，使用剪尖蓝色枪头轻轻吸打，直至混匀，避免产生气泡，23℃黑暗放置20min。再加入480μl w5溶液，轻轻混匀，终止转化。常温升速3，降速3，100
×
g离心2min，去上清。最后加入1ml w5溶液将管底的原生质体重悬，置于28℃培养箱中黑暗培养16h后，用荧光显微镜观察。
[0041]
1.7产量测定
[0042]
使用血球计数板计数，收集的原生质体重悬于w5溶液中，取少量滴于0.1mm血球计数板上，在光学显微镜下观察，选取膜结构完整的原生质体计数，每个样品计数3个重复，取平均值，统计原生质体产量。
[0043]
原生质体产量(个/(g
·
fw))＝25个方格内原生质体总数/0.1
×
1000
×
10
[0044]
1.8活力测定
[0045]
用0.01％二乙酸荧光素(fda)染色，取少量原生质体重悬液，在荧光显微镜下，记录发绿色荧光的原生质体和原生质体总数，统计3个有代表性的视野数量取平均值。
[0046]
原生质体活力以一个视野中有活力原生质体数占该视野中原生质体总数百分数来表示。
[0047]
原生质体活力(％)＝(发绿色荧光的原生质体数/原生质体总数)
×
100
[0048]
2、结果与分析
[0049]
2.1白芷叶肉原生质体制备部位的选择
[0050]
经过实验结果可知，黄化叶片提取原生质体效果最好，即细胞完整度和细胞活力最高。
[0051]
表2不同部位原生质体产量汇总
[0052] 绿色叶片黄化叶片绿色茎秆黄化茎秆根系下胚轴原生质体产量(
×
106个/ml)33.4746.7330.6314.2616.254.76
[0053]
黄化叶片制备的原生质体对应图2，浓度为46.73
×
106个/ml。
[0054]
2.2白芷叶肉原生质体制备条件的筛选
[0055]
2.2.1白芷叶肉原生质体产量条件的筛选
[0056]
利用4因素3水平正交实验对影响白芷叶肉原生质体产量的酶浓度、甘露醇浓度及酶解时间进行极差分析，结果表明：甘露醇浓度的r值最大，说明设定的四个因素中甘露醇浓度对白芷叶肉原生质体分离的影响最大；其次是纤维素酶浓度和酶解时间；离析酶浓度的r值最小，说明四个因素中离析酶浓度对白芷黄化苗原生质体分离的影响不大(表3)。
[0057]
通过对比正交实验下各组合所得到的原生质体产量以及活性强弱，发现纤维素酶浓度1.5％，离析酶浓度0.7％，甘露醇浓度0.4mol/l，酶解时间5h得到的原生质体最为理想。
[0058]
表3不同实验条件下获得的白芷叶肉细胞原生质体产量极差分析
[0059][0060]
注:k1，k2和k3分别表示不同因素各水平下的原生质体总产量；k1,k2和k3分别表示不同因素各水平下的原生质体产量平均值；r表示极差。
[0061]
表4不同实验条件下获得的白芷叶肉细胞原生质体产量方差分析
[0062][0063]
对白芷黄化苗原生质体产量进行方差分析(表4)，结果表明纤维素酶、甘露醇、酶解时间均对原生质体产量均有显著影响(p《0.05)，离析酶浓度对原生质体产量无显著影响。各因素中甘露醇浓度对原生质体的产量影响最大，离析酶浓度对原生质体的产量影响最小，与极差分析结果一致。
[0064]
2.2.2白芷叶肉原生质体活力条件的筛选
[0065]
利用4因素3水平正交实验对影响白芷叶肉原生质体活力的酶浓度、甘露醇浓度及酶解时间进行极差分析，结果表明：甘露醇浓度的r值最大，说明设定的四个因素中甘露醇浓度对白芷叶肉原生质体分离的影响最大；其次是酶解时间和纤维素酶浓度；离析酶浓度的r值最小，说明四个因素中离析酶浓度对白芷黄化苗原生质体活力的影响不大(表5)。
[0066]
表5不同实验条件下获得的白芷叶肉细胞原生质体活力极差分析
[0067][0068]
表6不同实验条件下获得的白芷叶肉细胞原生质体活力方差分析
[0069][0070]
对白芷黄化苗原生质体活力进行方差分析(表6)，结果表明纤维素酶、甘露醇、酶解时间均对原生质体产量均有显著影响(p《0.05)，离析酶浓度对原生质体产量无显著影响。各因素中甘露醇浓度对原生质体的产量影响最大，离析酶浓度对原生质体的产量影响最小，与极差分析结果一致。
[0071]
2.2.3白芷叶肉原生质体细胞状态统计如下
[0072]
统计细胞状态如下表7：
[0073]
表7不同实验条件下获得的白芷叶肉细胞原生质体细胞状态描述
[0074]
处理编号细胞状态描述1号细胞数量较少，细胞完整破碎少，杂质少2号细胞数量极多，细胞完整破碎少，杂质少3号细胞数量较少，细胞破碎多，杂质多4号细胞数量较多，细胞完整破碎少，杂质多5号细胞数量较少，细胞完整破碎少，杂质中等6号细胞数量极多，细胞完整破碎少，杂质少7号细胞数量极少，细胞完整破碎少，杂质少8号细胞数量较多，细胞完整破碎少，杂质少9号无完整细胞，全为破碎细胞，杂质多
[0075]
2.3白芷原生质体转化
[0076]
利用peg-ca2+介导法将植物表达载体pcambia3301-35s-egfp-kana质粒转入白芷叶肉原生质体，28℃培养15h后，用荧光显微镜(奥林巴斯ckx53)观察pcambia3301载体上的gfp基因表达情况，转化效率达到47.37％，且转化后的原生质体基因表达量几乎不受影响。
[0077]
3、可重复性验证
[0078]
再次采用“川芷3号”、“bzb003”重复验证本发明筛选得到的最优操作方法。具体的，生长条件同1.1记载的生长条件；制备部位为：选取生长状况良好的白芷黄化叶片为试验材料，进行原生质体提取；制备方法同1.5记载的制备条件，其中纤维素酶浓度1.5％，离析酶浓度0.7％，甘露醇浓度0.4mol/l，酶解时间5h。测定的“川芷3号”、“bzb003”产量和活力分别见图7和图8，图3、图7和图8中原生质体的产量和活力相当，表明本发明同样适用于其他种类的白芷。
[0079]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种白芷原生质体高效分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、白芷的培养：选取含有3片以上基生叶的白芷进行黑暗培养，黑暗培养的时间为20-60天；s2、原生质体材料的选择：选取步骤s1处理后白芷的黄化叶片作为原生质体材料；s3、原生质体的分离：将步骤s2得到的所述黄化叶片进行酶解，其中所述酶解使用的酶解液含有1.3-1.7％的纤维素酶、0.6-0.8％的离析酶和0.35-0.45mol/l的甘露醇。2.根据权利要求1所述的一种白芷原生质体高效分离的方法，其特征在于，步骤s1中，所述白芷含有3-5片基生叶。3.根据权利要求2所述的一种白芷原生质体高效分离的方法，其特征在于，步骤s1中，含有3片以上基生叶的白芷由白芷种子在光照条件下培养20-40天获得。4.根据权利要求1所述的一种白芷原生质体高效分离的方法，其特征在于，步骤s3中，所述酶解的时间为5h
±
30min。5.根据权利要求1所述的一种白芷原生质体高效分离的方法，其特征在于，步骤s3中，所述酶解液的用量为：每克黄化叶片使用10-80ml酶解液。

技术总结
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种白芷原生质体高效分离的方法。包括以下步骤：S1、白芷的培养：选取含有3片以上基生叶的白芷进行黑暗培养，黑暗培养的时间为20-60天；S2、原生质体材料的选择：选取步骤S1处理后白芷的黄化叶片作为原生质体材料；S3、原生质体的分离：将步骤S2得到的所述黄化叶片进行酶解，其中所述酶解使用的酶解液含有1.3-1.7％的纤维素酶、0.6-0.8％的离析酶和0.35-0.45mol/L的甘露醇。经过本发明提供的分离的方法得到的白芷原生质体，具有产量高、细胞完整、杂质少，以及基因转化率高的特点。及基因转化率高的特点。及基因转化率高的特点。


技术研发人员：吴卫 瞿文洁 赵琳 徐东北 侯凯 冯冬菊 陈靳松 胡朝勇 江美彦 杜宣 刘仁浪 张嘉恒
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2022.12.19
技术公布日：2023/9/20